Name: Distinctive Kapillarwirkung durch Mikrokanäle in knochenähnliche Vorlagen können Rekrutierung von Zellen für die Wiederherstellung der Große Knochendefekt Enhance (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Lernen Sie die Herstellung knochenähnlicher Vorlagen mit mikrokanalinduzierter Kapillarwirkung zur Verbesserung der Zellabsorption und -retention. Diese Methode ermöglicht die Rekonstruktion kraniofazialer Knochendefekte.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

1. Polyurethan (PU) Sponge Vorbereitung als Template <ol><li> Verwenden PU Schwämme an Hydroxyapatit-Vorlagen enthält miteinander verbundenen Poren zu erzeugen. Verwenden jedes Schwamm, um den primären Trabekel zur Bildung der Schablonen Streben sowie die Bildung von Mikrokanälen innerhalb der Knochenbälkchen bereitzustellen. </li><li> Schneiden und trimmen 80 ppi (Poren pro Zoll) Schwämme in 2 Brücke-Formen mit Abmessungen von 3,5 cm Höhe x 5 cm Länge x 1,5 cm in der Breite. Anmerkung: Die Abmessungen und Formen können ausgewählt werden entsprechend der gewünschten Primärporengröße: 100 ppi, 80 ppi und 60 ppi. </li><li> Stellen je 100 ml von 4% (w / v) NaOH-Lösung unter Verwendung eines 150-ml-Becher; dann eintauchen und drücken, bis die hergestellten Schwämme sind völlig durchnässt. </li><li> Nach dem Einweichen wird das Becherglas mit den Schwämmen in der Ultraschallgerät (42 kHz). </li><li> Ultraschall Vorbehandlung der PU-Schwämme für 15-20 min ohne Wärme, um die Oberflächeneigenschaften zu modifizieren. </li><li> Spülen Sie mit destilliertemWasser für 5-10 Minuten. Beim Waschvorgang ist, drücken Sie die Schwämme und es ihnen ermöglichen, 5-7 mal, um entfernen Sie die restliche NaOH innerhalb der Schwämme zu erweitern. </li><li> Drücken Sie die Schwämme mit Papiertüchern, um überschüssiges Wasser zu entfernen; dann trocknen Sie sie in einem Ofen bei 60-80 ° C. </li></ol> 2. Hydroxylapatit (HA) Gülle Vorbereitung zur Beschichtung <ol><li> Bevor die HA-Aufschlämmung, zu messen das Gewicht einer Becherglas mit einem magnetischen Rührstab. Dieser Wert wird verwendet, um das Pulver / Flüssigkeitsverhältnis zu berechnen. </li><li> Messen Sie 10 g der Nano-Größe HA Pulver. </li><li> In 20 ml destilliertem Wasser in die 50-ml-Becher. Wärme für 120 bis 140 ° C und umrühren unter Verwendung einer Heizplatte Magnetrührer. </li><li> Zugabe von 0,3 g (3% w / w) Polyvinylalkohol (PVA) (89,000-98,000 MW) pro Pulver in destilliertem Wasser unter Rühren bei 300-400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Gerührt, bis die PVA vollständig gelöst ist. Die Lösung sollte klar nach der vollständigen Auflösung des PVA ist. </li><li> Drehen Sie off der Flamme und 0,1 g (1% w / w) Natrium-Carboxymethylcellulose (CMC) (ultra-low viscosity) für Pulver unter Rühren bei 400-500 Umdrehungen pro Minute. Die Lösung sollte klar nach der vollständigen Auflösung des PVA ist. </li><li> Rühren, bis die CMC vollständig gelöst und Abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> Zugabe von 0,3 g (3% w / w) von Ammonium-Dispergiermittel pro Pulver unter Rühren bei 300-400 Umdrehungen pro Minute. Rühren bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Werden 0,2 g (2% w / w) Glycerin pro Pulver unter Rühren bei 300-400 Umdrehungen pro Minute. Rühren bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Langsam verteilen das HA-Pulver in die Lösung unter Rühren bei 600 bis 900 Umdrehungen pro Minute und halten Rühren für 5 min. </li><li> Ultraschallbehandlung für 5 Minuten mit einem Ultraschallgerät, um die Dispersion jeder Agglomeration des HA-Pulver zu gewährleisten. </li><li> Mit einem zusätzlichen 5 ml destilliertes Wasser in das Gemisch unter Rühren bei 600-900 Umdrehungen pro Minute und Wärme bei 90-100 ° C. </li><li> Rühren der Mischung unter Verwendung eines magnetischen Rührers mit 600-800 rpm bei 90-100 ° C in order, um den Wassergehalt zu verdampfen. </li><li> Messen die gesamte Gewicht mit dem Becher und Mischung von Zeit zu Zeit, bis ein Pulver / Flüssigkeits-Verhältnis von 1,75 bis 1,8 erhalten wird. </li><li> Formatieren der Pulver / Flüssigkeits-Verhältnis, teilen das Gewicht des Pulvers durch das Gesamtgewicht der Mischung (2,14), einschließlich des Pulvers, Reagenzien und Wasser, minus dem Gewicht des Bechers und Rührer (2,1) und abzüglich des HA-Pulver (2.2). Hinweis: Zum Beispiel: Wenn A (gesamte Mischung, Pulver, Reagenzien und Wasser) ist 49,05 g, B (Becherglas mit Rührer) beträgt 33,5 g, und dann C (HA Pulver) ist 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Lassen Sie den Brei auf RT vor der Verwendung für die Beschichtung abzukühlen. </li></ol> 3. HA-Beschichtung, Trocknen und Sintern <ol><li> Bestreichen Sie die vorbereiteten PUR-Schwämme mit dem HA Lack-Slurry mit einem rostfreien Spachtel, bis die Aufschlämmung homogen in der gesamten PU-Schwamm auf eine Glasplatte verteilt sind. Hinweis: Nach dem Entfernen der überschüssigen Bindebogenry, einige der Poren können weiterhin mit der Aufschlämmung wegen der hohen Viskosität der Aufschlämmung zusetzen. </li><li> Um Interkonnektivität, der Homogenität und offenen Poren zu gewährleisten, leicht wehen die HA beschichtet Vorlagen mit einem Luftkompressor. Dieser Prozess stellt sicher, dass die Vorlagen homogen beidem beschichtet auf der Innen- und Außenflächen des PU-Schwamm. Hinweis: Wenn eine homogene Beschichtung nicht erreicht wird, werden die HA beschichtet Vorlagen während des Sintervorgangs zusammenbrechen und kann auch knacken, während Handhabung durch geringe mechanische Festigkeit. Zusätzlich wird die homogene Beschichtung kritischer schaffen Mikrokanäle innerhalb der Knochenbälkchen. </li><li> Trocknen die HA beschichtet Vorlagen für mindestens 5 Stunden unter Kühlbedingungen (20-25 ° C) unter leichtem Luftzirkulation. Erstrecken sich jedoch die Trockenzeit auf der Grundlage der Größe der Vorlage. Anmerkung: Nach dem Trocknen werden die beschichteten HA Vorlagen in der Regel in jeder Dimension schrumpfen etwa 8% bis 10%. </li><li> Nach der Trocknung, legen Sie die HAbeschichteten Vorlagen auf einen Aluminiumoxid-Tiegel. Dann legen Sie sie in einem Hochtemperaturofen und verwenden Sie die folgenden 8 Schritt Sintern Profil. <ol><li> Wärme 2 ° C / min bis 230 ° C. </li><li> Wärme 1 ° C / min bis 280 ° C. </li><li> Erhitzen von 0,5 ° C / min bis 400 ° C. </li><li> Wärme 3 ° C / min bis 600 ° C. Halten bei 600ºC für 1 Stunde. </li><li> Wärme 5 ° C / min bis 1230 ° C. Halten 1.230 ° C für 3 Std. </li><li> Kühlung bei 5 ° C / min auf RT. Hinweis: Das Sintern wird weiter schrumpfen die HA beschichteten Schwamm Vorlagen von ca. 22% - 25% in jeder Dimension. </li></ol></li></ol> 4. Ingress und inhabitancy von Zellen in Vorlage <ol><li> Kultur vorge osteoblastischen MC3T3-Zellen in einer nicht-osteogenen Medien, bestehend aus α-MEM, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotika (Streptomycin und Penicillin) ergänzt bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . </li><li> 10 mleiner Zellsuspension mit 2 x 10 6 Zelldichte in eine einzelne Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen. </li><li> Platzieren Sie die 3 cm x 4 cm x 1 cm brückenförmigen Schablone vertikal in den 6-Well-Platte. Legen Sie eine Etappe der Vorlage in die Platte, die die Zellsuspension, und der andere Schenkel in einen benachbarten leeren Brunnen. </li><li> Lassen Sie die Schablone, um die Zellsuspension für 10 min absorbieren. </li><li> 5 ml Medium danach in der Vertiefung, die ursprünglich mit der Zellsuspension gefüllt war. </li><li> Auffüllung des Mediums in beiden Vertiefungen alle 2 oder 3 Tage bis 7 Tage vergangen sind. </li><li> Bestimmen Sie die Wirksamkeit der Zellmobilität durch Hämatoxylin und Eosin-Färbung 11. <ol><li> Befestigen Sie die Zellen und Gerüst von in 100% EtOH für 20-30 Minuten eingetaucht. </li><li> Fleck mit Hämatoxylin für 1-2 min. </li><li> Spülen Sie mit destilliertem Wasser für 1-2 min für zweimal. </li><li> Dehydratisierung durch Eintauchen in 70%, dann 95%, dann 100% EtOH für jeden 1-2 min. </li><li> Fleck mit Eosin für 20-30 sec. </li><li> Spülen Sie mit destilliertem Wasser für 12 min für zweimal. </li><li> Dehydratisierung durch Eintauchen in 70%, 80%, 90% und 100% EtOH für jeden 1-2 min. </li><li> Betten Sie das Gerüst in einem Acrylharz zum Schneiden und Imaging. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit den 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-Diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) Zelllebensfähigkeitstest und Live / Dead-Assay (lebend / tot Zellfärbung Kit MPTP) zu den Zeitpunkten von Tag 3 und 7 11. Hinweis: Das Schema der knochenähnlichen Vorlage Herstellungsprotokolle werden in der &quot;Repräsentative Ergebnisse&quot; Sitzung vertreten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein Mehrkomponenten-Vorlage einschließlich Zellen, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe usw. ist für eine erfolgreiche Knochenregeneration und funktionelle Wiederherstellung der kritischen große große Knochendefekte erforderlich ist. Innerhalb dieser Faktoren sind anatomisch konforme biologischen Eigenschaften von wesentlicher Bedeutung. Um biologische Funktionen zu erreichen, muß die Schablone Biokompatibilität Osteokonduktivität mechanischer Integrität, ausreichende Oberfläche ausreichende Oberflächenbeschaffenheit, und die Mittel für die Sauerstoff- und Nährstofftransport aufweist. Auf zellulärer Ebene, sind die folgenden Merkmale besonders wichtig für die funktionelle Wiederherstellung der massiven Knochendefekten: erleichtert das Eindringen in Vorlage (aktiv Rekrutierung), eine gleichmäßige Verteilung in der gesamten Vorlage (Retention), beschleunigte Verbreitung und hohe Rentabilität (Wohnraum). Schließlich wird die nachfolgende Bildung von wesentlichen extrazellulären Matrix und dem Auslösen der Genexpression sind entscheidend wichtiger biologischer Prozesse wie rasche Vaskularisierung and Osteogenese. Viele verschiedene Arten von synthetischen Ersatzstoffen vorgeschlagen worden, um Auto- / Allo- Knochentransplantate zu ersetzen. Allerdings ist der Stromgerüst Organisation nicht aufweist einen internen Mikromikrokanäle und Nanoporen enthält, und somit nicht aktiv Zellinfiltration, Verteilung und inhabitance tief in die synthetische Ersatzstoffe, die größer als 10 mm sind, zu erleichtern. Sie bieten keine körperliche Signale für bahnbrechende Zellen, effizient, schnell und gleichmäßig tief wandern in den Knochen Vorlage. Stattdessen wird die begrenzte passive Rekrutierung von Zellen schafft eine ungleich verteilt Zellpopulationen zwischen den äußeren und inneren Bereiche des Gerüsts. Dies verstärkt nicht nur die erste Herausforderung der Zellen Erreichen der innere Kern der Vorlage, sondern behindert auch Nährflusses und Zell-Kommunikation mit dem anderen Ende des synthetischen Ersatz. Diese Art der unverhältnismäßigen Zellrekrutierung und Besiedlung Ergebnisse in der Zell death und unvollständige Knochenwachstum nach dem Gerüst in die Körper 14,15 implantiert. So haben wir das Konzept der Kapillarwirkung als primäre physikalische Cue, um diese Hindernisse zu adressieren eingeführt. Wir haben sorgfältig konstruierte Mikrokanäle in der BMT, um die Kapillarwirkung, die für die primäre Schleppkraft zuständig für aktiv rekrutieren Zellen tief in die BMT-Konto wird induzieren. Die PU-Schwammbeschichtungstechnik stellt einige einzigartige Eigenschaften. Erstens erlaubt sie für eine einfache Herstellung von gut kontrollierten porösen trabekulären Strukturen, die sich auf den vordefinierten Matrizenstrukturen ab (dh 80 Poren pro Zoll Vorlage für 300-400 um). Dies ist für die Optimierung der Porengröße für Osteoblasten Infiltration 15 sehr wichtig. Zweitens ist die Technik ermöglicht den Aufbau von miteinander verbundenen Mikrokanälen, die für die bedeutende Rolle des Initialisierens Zelle Verlagerung 11 entfallen. Drittens gibt es fast keine Einschränkungen bei der Verwendung der PU-Schwamm in Bezug auf das Erstellen von benutzerdefinierten Formen und Größen von den Vorlagen. Der Hersteller kann eine Schere für einfache Formen oder sogar berechnete Laserschneiden für komplexe Geometrien zu verwenden. Mit diesen präzise gesteuerten Technologien, wir die BMT erstellt. HA wurde als Ausgangsmaterial aufgrund seiner Biokompatibilität und osteokonduktiv Kapazität 17 ausgewählt. In dieser Studie gab es einige kritische Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Während der HA Brei Vorbereitung, wenn die Temperatur zu hoch ist und die Rührgeschwindigkeit zu niedrig ist, wird der HA Brei stecken bleiben am unteren Rand des Bechers und versiegen. Nach der Beschichtung, wenn Ausblasen der überschüssigen HA Brei, kann zu hohen Luftdruck Risse auf der Oberfläche der BMT zu induzieren. Es ist wichtig, um den Luftdruck relativ gering, um nur richtig lüften das überschüssige HA Brei zu halten. Schließlich werden die zweite und dritte Schritt des Sinterprozessessind entscheidendsten (Heat 1 ° C / min bis 280 ° C und Wärme 0,5 ° C / min bis 400 ° C). In diesem Temperaturbereich wird die PU-Schwamm komplett ausbrennen, während der HA dicht wird. Wenn dieses Protokoll nicht genau verfolgt, wird der BMT zusammengebrochen sind oder nach dem Sintern zerbröckelt werden. Die in dieser Studie beschriebenen BMT bietet mehrere Vorteile. Zunächst werden die miteinander verbundenen Makroporen (300-400 um) imitieren die der menschlichen trabekulären Knochen und ermöglicht eine reibungslose Knochenmark-Durchfluss. Zweitens werden die Vorlagen von Mikrokanälen (25-50 um) innerhalb jedes trabekulären Septum umfasst, um die anfängliche Eindringen von Knochenzellen durch Kapillarwirkung zu beschleunigen. Wie mit Computersimulation 13, wenn die Vorlage hatte nur 300 um Poren (Primärporen) und keine Mikrokanälen gezeigt, würde die Kapillarwirkung nicht ausreichen für die volle Sättigung der Vorlage mit dem Knochenmark. Dies würde insbesondere gelten für große Mängel, l erfordern würdearge Größe Vorlagen. Mikrometergroßen Kanälen weisen hochwirksame Flüssigkeitsaufnahme und damit erwarteten wir die Mikrokanäle in erster Linie für die Kapillarwirkung in unserer Studie verantwortlich. Drittens haben unsere BMTS strategisch platzierten Nanoporen. Daten aus der Literatur zeigen, dass Zellen, die besonders empfindlich auf Nanostrukturen 18,19; In diesem Fall müssten die Nanoporen auf den Wänden der Mikrokanäle, eine Rolle bei der Erhöhung der Zellanheftung zu spielen. Nanogroßen Poren (100-400 nm) auf der Oberfläche des trabekulären Septen erlaubt immobilisierten Zellen zu verankern. Insgesamt zeigen die kombinierte Wirkung dieser drei internen Strukturen zu einer verstärkten Zellmobilisierung und die Haftung in der gesamten Vorlage. Es gibt jedoch einige Einschränkungen des Protokolls und die entscheidenden Schritte, um die perfekte BMT herzustellen. Zum Beispiel gibt es oft eine große Menge von HA-Aufschlämmung aufgrund der Schwierigkeit, eine homogene Viskosität während der Beschichtung hergestellt. Auch gibt es eine Beschränkung bei der Herstellung vonVorlagen größer als 5 cm 3 des Volumens aufgrund der Arbeitszeit, während Beschichtung. Die Beschichtungsdicke ist entscheidend, die je nach Hersteller Techniken variiert. Die Befunde der vorliegenden Studie zeigen, dass die BMT absorbieren und zu halten Zellen potentielle Vorteile gegenüber herkömmlichen alloplastische (oder synthetische) Gerüste bieten. Eine prospektive Studie in Betracht gezogen wird, die Vorteile der BMT auf Osteogenese und / oder Angiogenese zusammen mit Knochen-Wachstumsfaktoren zu verifizieren. Daher behaupten wir, dass unsere einzigartigen Funktionsumfang BMT Gerüst können die wichtigsten Hindernisse unzureichender Knochenmarkinfiltration in die synthetischen Konstrukte und unvollständiger Knochenregeneration in großen Mängel anzugehen. Das ultimative Ziel dieser Studie ist es, die aktuelle Paradigma der Biotechnik in Knochenrekonstruktion und funktionelle Wiederherstellung in kritischen großen Knochendefekte, indem die Notwendigkeit für zeit / arbeitsintensive Knochenmarkstroma vereinfachenl Zellen Isolierung und Expansionsprozesse. Schließlich wollen wir anatomisch nutzen konforme 3D-Konstrukte mit Mikrokanälen und Nano-Poren, die schnelle Zellabsorption, homogene Verteilung und inhabitance für den Wiederaufbau von Knochen induzieren.

Das ultimative Ziel des Knochengewebe-Engineerings mit synthetischen Konstrukten ist der Einbau der Konstrukte in den Wirtsknochen, die Wiederbesiedlung der Konstrukte mit Wirtszellen und die Rekonstitution des Austauschs von Gasen und Körperflüssigkeiten, um die normale Knochenfunktion wiederherzustellen. In den letzten zehn Jahren wurde über umfangreiche Forschungen zur Verwendung von polymeren und keramischen Biomaterialien für die Herstellung von Gerüsten berichtet1,2. Das ideale Material und die ideale Herstellungstechnik für eine optimale Regeneration des Knochengewebes müssen jedoch noch identifiziert werden. Darüber hinaus mangelt es insgesamt an Erfolg, diese Technologien in die Klinik zu bringen, insbesondere für die Rekonstruktion und Wiederherstellung großer Knochendefekte. Daher bleibt die Wiederherstellung kritisch großer knöcherner Defekte nach wie vor eine klinische Herausforderung1-5. 
Idealerweise sollten die Gerüste für die Regeneration von Knochengewebe Biokompatibilität aufweisen, ohne Entzündungsreaktionen oder Fremdkörper-/Toxizitätsreaktionen zu verursachen, im Vergleich zu denen von nativem Knochen genaue mechanische Eigenschaften aufweisen und einen Mechanismus besitzen, der die Diffusion und/oder den Transport von Ionen und Nährstoffen ermöglicht. Eine starke Bindung mit dem Wirtsknochen, dynamisches Knochenwachstum, vaskuläres Einwachsen und biologischer Abbau der Gerüste sind gleichermaßen wünschenswert. Obwohl die Verwendung von biologisch abbaubaren Polymergerüsten Fortschritte in Bezug auf das Einwachsen von Gewebe gezeigt hat, gibt es Kontroversen über ihre Verwendung für die Knochenregeneration. 
Trotz dieser umfangreichen Bemühungen haben die hochorganisierten strukturellen synthetischen Konstrukte immer noch begrenztes Potenzial, das Hindernis der passiven Zellpenetration zu überwinden. Die meisten dieser Ansätze führten zu einem Ingrowth-Gewebe in vitro mit Querschnitten von weniger als einigen μm bis zu mehreren mm von der Außenfläche, einer unvollständigen Integration mit dem Wirtsknochen und einer nur teilweisen Knochenregeneration in vivo6,7. Die Pionierzellen wandern nicht tief in die Konstrukte ein, weil es keine Anfangskraft gibt, die sie hineinzieht, bevor die Zellbesiedlung beginnt. Folglich findet die Zellbesiedlung ausschließlich an der Peripherie des Gerüsts statt und wird zu einem Hindernis von der Peripherie bis zur Mitte des Gerüsts. Dadurch wird die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in die inneren Teile der Templates begrenzt8. Daher ist es klar, dass die Architektur der Gerüste (Porengröße, Porosität, Interkonnektivität und Permeabilität), die den Transport und die Diffusion von Substanzen durch die Gerüste beeinflusst, entscheidend für das Erreichen einer gut verteilten Zellproliferation und -differenzierung ist9,10. Obwohl in der Vergangenheit Calciumphosphate für den Gerüstbau verwendet wurden, haben unterschiedliche Prozesse und Verfahren oft zu Calciumphosphat-Gerüsten mit unterschiedlichen Architekturen geführt. Daher wird die Auswahl des Herstellungsprozesses wichtig, um die Gerüstarchitektur zu bestimmen, die für eine erfolgreiche Regeneration des Knochengewebes erforderlich ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es immer noch zwei große Mängel des Knochengewebe-Engineerings gibt, die behoben werden müssen: die anfängliche Zellrekrutierung in das Template vor der Zellanheftung und -besiedlung und die Qualität des Stoffflusses sowohl in als auch aus dem Template.

<table><tbody><tr><td>Polyurethan-Schwamm</td><td>Plastifoam</td><td>PU-3215</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>167176</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylapatit Pulver</td><td>Ossgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethylcellulose Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpolyacrylat</td><td>Vanderbilt</td><td>DARVAN 821A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2289</td><td></td></tr></tbody></table>

distinctive kapillarwirkung durch mikrokanäle in knochenähnliche vorlagen können rekrutierung von zellen für die wiederherstellung der große knochendefekt enhance

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Ohne eine aktive, blühende Zellpopulation, die gut verteilt und stabil an der eingelegten Vorlage verankert ist, hat außergewöhnliche Knochenregeneration nicht auf. Mit konventionellen Vorlagen, das Fehlen von internen Mikrokanälen führt die fehlende Zellinfiltration, Verteilung und inhabitance tief in den Vorlagen. Daher ist eine hochporöse und einheitlich miteinander verbunden trabekulären Knochenartigen Vorlage mit Mikrokanälen (biogenen Mikroschablone; BMT) ist entwickelt worden, um diese Hindernisse zu adressieren. Der Roman BMT wurde durch innovative Konzepte (Kapillarwirkung) erstellt und mit einem Schwamm-Vorlage Beschichtungstechnik hergestellt. Die BMT besteht aus mehreren Bauteilen: miteinander verbundenen Primärporen (300-400 &amp; mgr; m), die Poren im trabekulären Knochen, Mikrokanäle (25 bis 70 &amp; mgr; m) innerhalb jedes Trabekel und Nanoporen (100-400 nm) auf der zu imitieren Oberfläche, damit Zellen zu verankern. Darüber hinaus hat der BMT durch mechanische Test-Studie dokumentiert sim zu haben,Ilar mechanischen Festigkeitseigenschaften zu denen der menschlichen trabekulären Knochen (~ 3,8 MPa) 12. Die BMT zeigte eine hohe Absorption, Retention und Behausung der Zellen während der brückenförmige (Π) Vorlagen (3 cm Höhe und 4 cm Länge). Die Zellen, die anfänglich wurden ausgesät in ein Ende der Vorlagen unmittelbar mit dem anderen Ende (10 cm Abstand) durch Kapillarwirkung der BMT auf das Zellmedium mobilisiert. Nach 4 Stunden wurden die Zellen homogen besetzt die gesamte BMT und wiesen normalen zellulären Verhaltens. Die Kapillarwirkung entfiel der Infiltration der Zellen in die Medien und die Verteilung (aktiv Migration) der gesamten BMT suspendiert. Nachdem beobachtet diese Fähigkeiten der BMT, erwarten wir, dass BMTS werden Knochenmarkzellen, Wachstumsfaktoren und Nährstoffen von der Peripherie unter physiologischen Bedingungen zu absorbieren. Die BMT können derzeitigen Einschränkungen über schnelle Infiltration, homogene Verteilung und inhabita lösennce von Zellen in großen Volumen Vorlagen zu massiven Skelettdefekte zu reparieren.

Die Gesamtstruktur der BMT weist eine einzigartige dreidimensionale Schablone mit Trabekelknochen artigen internen Strukturen. Die BMT enthält Makroporen, Mikrokanäle, und Nano-Poren. Klare Konfigurationen vollständig vernetzte Makroporen (Durchschnittsgröße von 320 &amp; mgr; m) Mikrokanäle (mittlerer Durchmesser 50 um) und Nanoporen (Durchschnittsgröße von 100 nm) wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop überprüft (EVO-40; ZEISS) sowie durch Mikrotomographie. Abbildung 1 zeigt schrittweise ausführliche Protokolle Erstellen eines BMT. Durch genaue Steuerung der Protokolle aus der Herstellung der PUR-Schwämme dem Sinterprozess (P1 - P7; Abbildung 1), die folgenden Merkmale erzielt werden: eine hoch dichte und glatte Oberfläche nach der HA-Beschichtung und Trocknen; eine präzise geformten und dimensioniert 3-D-Matrize; eine vollständig vernetzte poröse trabekulären Netzwerk ähnlich dem trabekulären Knochen; und Mikrokanäle witHin jeweils Trabekel, die enossale Kanäle wie Havers-Kanäle und Volkmann-Kanal (Abbildungen 2 und 3) zu imitieren. Weiterhin relativ hohe mechanische Festigkeit (~ 3,8 MPa), die ähnlich der der menschlichen trabekulären Knochen wurde durch ein Druckfestigkeitsprüfung gemessen. Sehr ähnlich histomorphometrische Parameter mit denen der menschlichen Lendenwirbel Trabekelknochen wurden von Mikro-CT-Analyse 12 bestätigt. Unterschiedliche Größen der Kapillarwirkung wurden durch verschiedene Kapillardurchmesser in Abbildung 4 mit Computersimulation gezeigt. Durch diesen Simulationen projiziert wir, dass der BMT würde unterschiedlichen Absorptionsraten innerhalb der Primärporen (300-400 um) und Mikrokanäle (25-70 &amp; mgr; m), bezogen auf die Durchmesser aufweisen. Kleineren Kapillaren wiesen stärkere Aufnahmekapazitäten. Diese Annahme wurde in diesem Experiment bestätigt als in Figur 5 gezeigt. Die BMT zeigten sehr effektivFlüssigkeitsabsorption und Retention durch die Kapillarwirkung der Mikrokanalstrukturen; stevenel die Bläue als dem flüssigen Medium, um leicht verfolgen den Fluss (Abbildung 5) verwendet wird. Basierend auf Computersimulation wurden die BMT mit diesen Konfigurationen gesehen zu absorbieren und zurückzuhalten Zellsuspensionen bis zu 8,5 cm in der Gesamtdistanz innerhalb von 10 sec. Aufgrund eines starken Kapillarwirkung von den inneren Strukturen induziert wird, das gefärbte Medium erreicht das andere Ende eines 3 cm (Höhe) x 4 cm (Länge) x 1 cm (Breite) brückenförmige Vorlage innerhalb von 1 min und 40 sec. Darüber hinaus wurde aktive Zelle Mobilisierung und Einbindung in die BMT beobachtet (Abbildung 6). Anschließend wird die homogene Zellmobilisierung und Befestigung zu einer verstärkten Proliferation und Matrixbildung in einer gleichmäßig verteilten Bildung. Außerdem wurde Fern (~ 10 cm) Wanderung von Zellen durch die BMT sofort validiert, nachdem der BMT mit der Zellsuspension gesättigt. Se<html> EDED Zellen überlebten im Template-Segment, das der Luft ausgesetzt wurde und nicht in das Kulturmedium eingetaucht ist. In diesem Experiment wurde das Kulturmedium zu den Zellen, die durch die ausschließlich in den Vertiefungen berühren nur die Beine des Gerüstes vorgesehen. Die Kapillarwirkung durch die Mikrokanäle zeigten dann frisches Medium erlaubt, das top, Brückenabschnitt des Gerüsts zu erreichen. Nach 3 Tagen der Kultur, wurde die Vorlage mit rasch wuchernden Zellen besetzt. Nach 7 Tagen Kultur wurde jede Trabekel von extrazellulären Matrizen gewickelt und mit Zellen 13 eingebettet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Gesamtknochenähnlichen Vorlage Herstellungsprotokoll von der Vorbehandlung des PU-Schwamm (P1) zu der abschließenden Wärmebehandlung (P7). Halten Sie die genauen Sinterprofil nach P7 ist von entscheidender Bedeutung bei der Erreichung günstige mechanische Festigkeit.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Abbildung 2 Vertreter Stereomikroskop (AmScope; SM-2TZ-M) Bilder (x4) eines 80 ppi bemessen PU Schwamm (links), HA beschichtet und getrocknet, BMT (Mitte) und Sinter BMT (rechts) (Dimension: 3. cm Höhe x 4 cm Länge x 1 cm in der Breite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Abbildung 3. REM-und Mikro-CT-Bilder eines biogenen Vorlage: (A) einem Gesamtbild eines biogenen Vorlage, <st<html> rong&gt; (B, C, D) Bilder für Mikrokanäle. Um klare Mikrokanäle in der Trabekeln zu markieren, die Vorlage granuliert wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Abbildung 4. Computational Berechnung der Kapillarwirkung mit unterschiedlichen Kanaldurchmessern innerhalb der gleichen Zeitperiode (0,4 ms), während der größten Kapillare (d = 300 um: bezieht sich auf Primärporen) absorbiert das Medium (blau) bis zu 0,16 mm Höhe, dem kleinsten Kapillare (d = 30 &amp; mgr; m: bezieht sich auf Mikro-Kanal) das Medium bis zu 0.415 mm in der Höhe absorbiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figur 5. Die Bilder zeigten Unterschiede der Absorptionsfähigkeiten der Kapillarwirkung anhand von verschiedenen Größen der Primärporen und Mikrokanäle (primäre Porengröße bezieht sich auf den Durchschnittsdurchmesser: 60 ppi ≈ 470 &amp; mgr; m, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 &amp; mgr; m). Die gelben Linien die Kapillarwirkung durch die Kombination von Primärporen und Mikrokanäle induziert. Die roten Linien stellen die Kapillarwirkung durch die vor allem Mikrokanäle in jedem Trabekel ausgestellt induziert. Wie in (F) gezeigt, wird die 100 ppi Vorlage induzierte die stärkste Kapillarwirkung, was zur vollständigen Sättigung der Vorlage innerhalb von 39 sec. Die 80 ppi und 60 ppi Vorlagen wurden danach getestet. (B) 0 s, (C) 0,5 s, (D) 1,5 sec, (E) 17,0 sec, (F) 39,0 sec, (G) 50,0 sec, und (H) 1 min 18 sec nach dem Eintauchen. (Template Dimension: 1cm x 1 cm x 4 cm in der Höhe quaderförmig). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Abbildung 6. Das Eindringen und die Einwanderung von Zellen aus den Vertiefungen ausgesät (Teil I) zu ungeimpften Brunnen (Teil V) durch die biogenen Vorlagen durch Kapillarwirkung induziert. Die anfänglich ausgesäten Zellen erreicht das Ende der ungeimpften Bein (Teil V) unmittelbar nach voller Sättigung. Nach 3 Tagen wird das Zusammenfließen der Zellen wurde in der gesamten Vorlage offensichtlich. Nach 7 Tagen erfolgte raumzeitliche Kollagenmatrixbildung innerhalb der Zellpopulationen (H &amp; E-Färbung). (Template Dimension: 3 cm Höhe x Länge von 4 cm x 1 cm in der Breite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ein Schritt-für-Schritt-Prozess zur Erstellung einer knochenähnlichen Vorlage mit künstlichen Mikrokanälen wird vorgestellt. Die hohe Absorptions- und Retentionsfähigkeit des Templates wird durch die Kapillarwirkung über Mikrokanäle demonstriert.

Distinctive Kapillarwirkung durch Mikrokanäle in knochenähnliche Vorlagen können Rekrutierung von Zellen für die Wiederherstellung der Große Knochendefekt Enhance

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Knochengerüst-Mikroumfeld zu schaffen, das in der Lage ist, fehlenden oder beschädigten Knochen zu ersetzen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Polyurethanschwamm so geformt und modifiziert wird, dass er in einen Defektbereich passt. Der zweite Schritt besteht darin, den Polyurethanschwamm gleichmäßig mit einer viskosen Hydroxylapatit-Suspension zu beschichten und trocknen zu lassen.Der letzte Schritt besteht darin, die Hydroxylapatit-Beschichtung in einem Hochtemperatur-Muffelofen zu zentrieren. Letztendlich wird eine knochenähnliche Vorlage mit technisch gestalteten Mikrokanälen hergestellt, die hohe Zellaufnahme- und -rückhaltefähigkeiten aufweist. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren, wie zum Beispiel der Salzauslaugung oder 3D-Druckverfahren, liegt darin, dass die Gestaltung der Mikrokanäle kapillare Wirkung im Material erzeugt.Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Herausforderungen im Bereich der regenerativen Medizin zu bewältigen, wie beispielsweise die Rekonstruktion kraniofazialer und segmentaler Knochendefekte. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik reichen bis hin zur Therapie angeborener Fehlbildungen. Die Vorlagen sind hinsichtlich Form und Größe vollständig anpassbar, und die Kapillarkraft fördert die Zellwanderung über größere Distanzen.Obwohl diese Methode Einblicke in das regenerierende Knochengewebe ermöglicht, kann sie auch auf andere Kultursysteme wie die 3D-Krebszellkulturplattform angewendet werden. Beginnen Sie damit, Polyurethanschwämme mit 80 Poren pro Zoll in Brückenform zu schneiden, mit den Abmessungen 3,5 Zentimeter Höhe mal fünf Zentimeter Breite mal 1,5 Zentimeter Tiefe. Danach stellen Sie 100 Milliliter einer 4%igen Natriumhydroxidlösung her.Unter Verwendung eines 150-Milliliter-Bechers. Tauchen Sie die Schwämme in die Natronlauge und drücken Sie die eingeschlossene Luft heraus, bis die Schwämme vollständig durchtränkt sind. Nach der Sättigung stellen Sie den Becher mit den Schwämmen 15 bis 20 Minuten lang in ein Ultraschallbad bei 42 Kilohertz, ohne zu erhitzen.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, spülen Sie die Schwämme fünf bis zehn Minuten lang mit destilliertem Wasser ab. Drücken Sie die Schwämme während des Ausspülens aus und lassen Sie sie fünf- bis siebenmal aufquellen, um restliches Natriumhydroxid aus den Schwämmen zu entfernen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus den Schwämmen mit Papiertüchern und legen Sie sie anschließend zum vollständigen Trocknen in einen Ofen bei 60 bis 80 Grad Celsius. Um die Herstellung der Hydroxylapatit-Suspension zu beginnen, wiegen Sie zunächst einen 50-Milliliter-Becher mit einem Magnetrührstab. Fügen Sie als Nächstes 20 Milliliter destilliertes Wasser in das Becherglas hinzu. Erhitzen Sie das Wasser auf einer Heizplatte, die auf 120 bis 140 Grad Celsius eingestellt ist, und rühren Sie mit dem magnetischen Rührer. Wenn das Wasser zu kochen beginnt, geben Sie 0,3 Gramm Polyvinylalkohol-Pulver unter Rühren mit 300 bis 400 U/min in das destillierte Wasser.Rühren, bis das Pulver vollständig gelöst ist und die Lösung klar ist. Danach die Heizung ausschalten und 0,1 Gramm Natriumcarboxymethylcellulose-Pulver mit sehr niedriger Viskosität hinzufügen, weiterhin bei 400 bis 500 U/min rühren, bis die Lösung klar wird. Sobald es erneut gelöst ist, die Mischung erneut auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Fügen Sie anschließend 0,3 Gramm Ammoniumpolyacrylat-Dispergiermittel hinzu, während Sie bei 300 bis 400 U/min rühren. Rühren Sie, bis es vollständig gelöst ist, und geben Sie dann 0,2 Gramm Glycerin hinzu, während Sie weiterhin bei 300 bis 400 U/min rühren. Rühren Sie die Mischung, bis sie vollständig gelöst ist.Wiegen Sie dann 10 Gramm nano-skaliges Hydroxylapatit-Pulver ab und geben Sie es langsam unter Rühren mit 600 bis 900 U/min in das Becherglas. Rühren Sie weitere fünf Minuten fort. Danach geben Sie die Mischung in ein Ultraschallbad und behandeln sie fünf Minuten lang mit Ultraschall, um eine vollständige Dispersion eventueller Agglomerate des Hydroxylapatit-Pulvers sicherzustellen. Fügen Sie anschließend weitere fünf Milliliter destilliertes Wasser zur Mischung hinzu, während Sie bei 600 bis 900 U/min rühren und auf 90 bis 100 Grad Celsius erwärmen. Setzen Sie das Rühren der Mischung mit einem magnetischen Rührer bei 600 bis 800 U/min und 90 bis 100 Grad Celsius fort.Um den Wasseranteil zu verdampfen, messen Sie von Zeit zu Zeit das Gesamtgewicht, einschließlich des Bechers und der Mischung, bis ein Pulver-zu-Flüssigkeits-Verhältnis von 1,75 bis 1,80 erreicht ist. Wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, lassen Sie die Aufschlämmung abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreicht hat, bevor Sie sie zum Beschichten verwenden. Tragen Sie die hergestellte Polyurethan-Schwämme mit der Hydroxylapatit-Aufschlämmung mithilfe eines Edelstahlspatels so auf eine Glasplatte auf, dass die Aufschlämmung gleichmäßig im gesamten Polyurethan-Schwamm verteilt ist. Danach blasen Sie die Schwämme leicht mit einem Luftkompressor an, um eine Verbindung der Poren, Gleichförmigkeit und offene Poren zu gewährleisten.Wenn keine homogene Beschichtung erreicht wird, können die mit Hydrogel beschichteten Formen während des ING-Prozesses einstürzen und beim Bearbeiten aufgrund der geringen Formstabilität ebenfalls Risse bilden. Zudem ist eine homogene Beschichtung entscheidend für die Erzeugung mikroskaliger Kanäle innerhalb der Struktur. Trocknen Sie die mit HA beschichteten Formen mindestens fünf Stunden lang bei 20 bis 25 Grad Celsius mit sanfter Luftzirkulation.Verlängern Sie diese Zeit bei größeren Vorlagen. Nach dem Trocknungsprozess die HA-beschichteten Vorlagen auf einen Illumina-Tiegel legen. Anschließend in einen Hochtemperaturofen stellen und dem in der beigefügten textbasierten Anleitung beschriebenen achtstufigen Zentrierprofil folgen.Geben Sie 10 Milliliter vorgeformter osteoblastischer MC3T3-Zellen mit einer Zellzahl von einer Million in eine einzelne Vertiefung einer 6-Loch-Platte. Bringen Sie anschließend die 3 cm × 4 cm × 1 cm große, brückenförmige Vorlage senkrecht in die 6-Loch-Platte ein. Platzieren Sie ein Bein der Vorlage in einer Vertiefung mit der Zellsuspension und das andere Bein in einer benachbarten leeren Vertiefung.Lassen Sie die Vorlage 10 Minuten lang im Sicherheitswerkbank die Zellsuspension aufnehmen. Fügen Sie anschließend fünf Milliliter zusätzliches Medium in die Vertiefung hinzu, die ursprünglich mit der Zellsuspension gefüllt war. Nach weiteren fünf Minuten geben Sie fünf Milliliter Medium in die andere Vertiefung, die ursprünglich nicht mit der Zellsuspension gefüllt war.Danach die Einrichtung in einen Inkubator stellen. Das Medium alle zwei Tage über einen Zeitraum von sieben Tagen wechseln. Am Ende des Experiments die Zellen und das Gerüst durch Eintauchen in einen Becher, der mit 100%igem Ethanol gefüllt ist, 20 bis 30 Minuten lang fixieren.Färben Sie das gespülte Gerüst ein bis zwei Minuten lang mit Hämatoxylin-Färbemittel. Spülen Sie es anschließend ein bis zwei Minuten lang erneut, indem Sie das Gerüst zweimal in einen Becher mit destilliertem Wasser tauchen. Danach dehydrieren Sie das Gerüst in Zellen, indem Sie es ein bis zwei Minuten lang in 70 % Ethanol eintauchen. Anschließend überführen Sie das Gerüst für weitere ein bis zwei Minuten in 95 % Ethanol.Schließlich das Scaffold zwei Minuten lang in 100 % Ethanol geben. Danach das Konstrukt eine bis zwei Minuten mit e, s und Y kontrafärben. Anschließend spülen, indem das Scaffold erneut zweimal für je eine bis zwei Minuten in einen Becher mit destilliertem Wasser getaucht wird.Nach der Spülung das Gerüst durch Einbetten in eine Reihe von gestaffeltem Ethanol entwässern, bevor es in Harz eingebettet wird. Schließlich das Gerüst in ein Acrylharz zur Schnittführung und Bildgebung einbetten. Die hier in verschiedenen Herstellungsstadien gezeigte biogene Mikroumgebungsvorlage besteht aus einem vollständig verzweigten, porösen trabekulären Netzwerk, das dem von trabekulärem Knochen ähnelt.Diese Schablone weist mehrere strukturelle Komponenten auf, darunter miteinander verbundene primäre Poren mit einem Durchmesser von 300 bis 400 Mikrometern, Mikrokanäle mit einem Durchmesser von 25 bis 70 Mikrometern sowie Nanoporen an der Oberfläche mit einem Durchmesser von 100 bis 400 Nanometern, die es Zellen ermöglichen, sich zu verankern. Die biogene Mikroumgebungsschablone unterstützt das Ansiedeln von Zellen durch Kapillarwirkung in allen Bereichen des Gerüsts. Unmittelbar nach vollständiger Sättigung kann die Verteilung der Zellen deutlich nach Hämatoxylin-, Eosin- und Eosin-Färbung sowie nach Einbettung und Schnitt des Gerüsts erkannt werden.Die Zellanzahl in jedem Bereich der Vorlage wurde nach drei Tagen Kultur quantifiziert und verfolgt. Nach sieben Tagen Kultur war die Vorlage mit schnell proliferierenden Zellen besiedelt, jede Trabekel war von extrazellulären Matrixen umhüllt und enthielt eingebettete Zellen. Sobald die Methode eingearbeitet ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden.Während dieses Verfahrens ist es wichtig, das korrekte Verhältnis von Pulver zu Wasser einzuhalten und eine homogene Beschichtung beizubehalten. Andere Methoden wie das dynamische Schaukelverfahren oder das Drehkultursystem können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen im Zusammenhang mit zellulären Reaktionen zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Distinctive Kapillarwirkung durch Mikrokanäle in knochenähnliche Vorlagen können Rekrutierung von Zellen für die Wiederherstellung der Große Knochendefekt Enhance (Video) | JoVE Journal

Distinctive Kapillarwirkung durch Mikrokanäle in knochenähnliche Vorlagen können Rekrutierung von Zellen für die Wiederherstellung der Große Knochendefekt Enhance

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