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Methodenartikel

Produktion von Nurr-1 spezifischen polyklonalen Antikörper Frei von Kreuzreaktivität gegen seine Close Homologe, Nor1 und Nur77

7.1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/52963

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17. August 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Neurobiology Laboratory, Psychiatry, McLean Hospital, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Konyang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zielen wir selektiv auf Antikörper gegen ein spezifisches Mitglied einer hochkonservierten Proteinfamilie ab, indem wir Tiere mit ihren unterschiedlichsten Regionen immunisieren, gefolgt von der Entfernung kreuzreaktiver Antikörper durch Präadsorption.

Zusammenfassung

Die Kernrezeptor-Unterfamilie 4 (NR4A) besteht aus 3 verwandten Proteinen, die sich eine DNA-Bindungsdomäne (DBD) und eine Ligandenbindungsdomäne (LBD) teilen. Das nukleäre Rezeptor-verwandte 1-Protein (Nurr1 oder NR4A2) spielt eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung des dopaminergen Systems. Zu den Dopamin-Dysfunktionen, die mit dem Nurr1-Gen verbunden sind, gehören unter anderem die Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und manische Depressionen. Darüber hinaus deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Nurr1 auch in anderen Hirnbereichen wie dem Hippocampus exprimiert wird und eine entscheidende Rolle für Lernen und Gedächtnis spielt. Die anderen Mitglieder der Familie sind der Nervenwachstumsfaktor IB (Nur77 oder NR4A1) und der von Neuronen abgeleitete Orphan-Rezeptor 1 (NOR1 oder NR4A3). Um die genaue funktionelle Rolle von Nurr1 bei dopaminergen und anderen neuronalen Dysfunktionen der Gehirnregion zu untersuchen, wurden Antikörper benötigt, die keine Kreuzreaktivitäten gegen Nur77 und NOR1 aufweisen. Da die Proteine in ihren LBDs stärker voneinander abweichen als in ihren DNA-Bindungsdomänen, sollte die Immunisierung mit gereinigten LBDs Antikörper liefern, die spezifisch für Nurr1 sind, mit minimalen Reaktivitäten gegen Nur77 und/oder NOR1. Obwohl es gelang, Anti-Nurr1-Antikörper zu erzeugen, zeigten diese eine signifikante Immunreaktivität gegen die anderen Mitglieder der Familie. Die Affinitätschromatographie über immobilisiertem Protein A, gefolgt von einer Präadsorption gegen immobilisierte Nur77- und NOR1-LBDs, ergab Nurr1-spezifische Antikörper ohne Kreuzreaktivität. Hier zielen wir selektiv auf Antikörper gegen ein bestimmtes Mitglied einer hochkonservierten Proteinfamilie ab, indem wir Tiere mit ihren unterschiedlichsten Regionen immunisieren und anschließend kreuzreaktive Antikörper durch Präadsorption entfernen. Ziel des Protokolls ist es, die Spezifität polyklonaler Antikörper durch Präadsorption gegen kreuzreaktive Antigene zu erhöhen.

Einleitung

Der Transkriptionsfaktor Nurr1 und seinen Homologen (Nur77 und Nor1) gehören zu der Kernrezeptorfamilie 4A (NR4A) 1. Sie sind auch Orphanrezeptoren weil ihre endogene Liganden noch nicht identifiziert. Nurr1 wurde erstmals 1992 kloniert, und obwohl bekannt ist, im Gehirn 2 ausgedrückt werden, wurde ihre wesentliche Rolle für die Entwicklung und Wartung von Mittelhirnneuronen mit Dopamin-knockout Maus-Studien 3 offenbart. Außerdem wurde seine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Dopamin-Neuronen im Mittelhirn vor kurzem von einem Knockout-Studie 4 gezeigt. Aufgrund dieser eleganten Studien zeigen Nurr1 kritische Rollen für Dopamin-Neuronen im Mittelhirn, viele nachfolgende Untersuchungen weitgehend auf die Dopamin-Neuronen im Mittelhirn und Dopamin bezogene neurodegenerative Erkrankung konzentriert, Parkinson-Krankheit (PD) 5.

Bemerkenswert ist, Nurr1 nicht nur in den Mittelhirn Dopamin (MDA) Neuronen, sondern auch in di ausgedrücktVers Gehirnbereichen 2, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise funktionelle Rolle in vielen nicht-DA Bereichen, die stark durch neuere Studien zeigen, dass Nurr1 spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Hirnfunktionen unterstützt wird. Beispiele wurde wie Lern gezeigt, dass die Speicher-induzierende Aktivitäten oder andere Hippocampus abhängigen Aufgaben ergeben sich im Hochregulierung von Nurr1-Expression im Hippocampus 6,7. Darüber hinaus nach unten von Nurr1-Expression im Hippocampus Klopf war ausreichend, um das Langzeitgedächtnis und / oder der synaptischen Plastizität 8-11 beeinträchtigen, was stark darauf hinweist, daß Nurr1 spielt verschiedene Rollen in vielen Bereichen des Gehirns. Um somit die zelltypspezifisch und subzellulären Expression Nurr1 weiter zu verstehen, ist es wünschenswert, Nurr1-spezifische Antikörper, die keine Kreuzreaktivität gegenüber seinen Homologen oder Nur77 Nor1 nicht aufweisen, zu verwenden. Dieses Papier beschreibt eine Pre-Adsorption-Protokoll, um Nurr1-spezifische Antikörper vorhanden und zusätzliche Daten, die seine Spezifität zu erzeugen.

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Protokoll

Hinweis: Die Zusammensetzung aller nachstehend genannten Lösungen können in der Werkstoffe / Zubehör Tabelle gefunden werden.

1. Protein A Säule Reinigung der Antikörper

  1. Äquilibrieren ein Protein, eine Spin-Säule und alle benötigten Puffer auf Raumtemperatur 15 min vor dem Beginn des Verfahrens.
  2. Verdünne das Immunserum 1: 1 mit Protein A IgG Bindungspuffer. (5 ml Serum wird empfohlen).
  3. Klopfen Sie leicht ein Protein, eine Spin-Säule auf der Tischplatte, jede Harz, das in die Kappe eingelegt werden können, zu entfernen. Entfernen Sie die obere Kappe und sanft Snap aus dem Bodenverschluss. Legen Sie die Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube und lassen Speicherlösung ablaufen.
  4. 5 ml Protein A IgG Bindungspuffer und die Lösung ablaufen.
  5. Übernehmen Sie die verdünnt Immunserum an die Säule und sammeln Sie die Durchströmung. Für beste Ergebnisse, einen Probenvolumen, das eine Antikörperkonzentration als 80% der Antikörper-bindenden capacit der Spalte enthält wenigery.
  6. Mit 15 ml Protein A-IgG-Bindungspuffer oder bis die Absorption bei 280 nm unter 0,1 Die Säule.
  7. 100 l Neutralization Buffer zu fünf markierten Sammelröhrchen.
  8. 5 ml der IgG Elutionspuffer auf Protein A-Säule und Sammeln Fraktionen von 1 ml in jedes der Rohre mit den 100 ul Neutralisierungspuffer.
  9. Die Extinktion jeder Fraktion bei 280 nm und Poolfraktionen mit einer Absorption von mehr als 0,5. Halten Sie die vereinigten Fraktionen auf Eis, bis sie zur Dialyse.
  10. Regenerieren die Säule durch Zugabe von 8 ml IgG Elution Buffer und lassen Sie die Lösung durch die Säule fließen.
  11. Spülen der Säule mit Protein A IgG Bindungslösung, bis die Laufmittel pH wieder auf 7,4.
  12. Bewahren Sie die Spalte durch Zugabe von 5 ml-Speicherlösung (0,02% Natriumazid in PBS). Wenn etwa 3 ml bleiben in der Spalte, Kappenboden und befestigen Sie die obere Abdeckung. Bewahren Sie die Spalte bei 4 ° C.
  13. Bestimmen Sie die Länge of Dialyseschlauch nach der Anleitung des Herstellers erforderlich ist. Unter Verwendung von 16 mm Flachrohrdurchmesser verwenden 5.47 cm Rohrlänge pro ml Lösung, um dialysiert werden. Schneiden Sie den Schlauch und Spülen mit PBS, pH 7,4, für 15 bis 30 min.
  14. Falten und Clip ein Ende der Dialyseschlauch, überweisen Sie den gepoolten IgG enthaltenden Fraktionen in einen Dialyseschlauch in PBS pH 7,4 ins Gleichgewicht gebracht, und schließen Sie das andere Ende.
  15. Dialyse bei Raumtemperatur gegen 200 Volumina PBS pH 7,4 für 2 Stunden.
  16. Ändern die Dialysepuffer (frisch PBS pH 7,4) dialysiert und für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur.
  17. Ändern Sie den Dialysepuffer (frisches PBS pH 7,4) dialysiert und über Nacht bei 4 ° C.
  18. Halten Sie die dialysiert Antikörperlösung bei 4 ° C, bis bereit, mit weiteren Reinigungsschritten fortfahren.
  19. Bewertung der Antikörperkonzentration unter Verwendung seiner Absorption bei 280 nm und der molare Absorptionskoeffizient von Antikörpern bei 280 nm von 210.000 M -1 cm -1 12.

2. Kupplung von LBD Proteine, um die Kopplung Resin Aminolink

  1. Bereiten Sie zwei Spalten, eine für Nor1 und die andere für Nur77. Folgen Sie dem gleichen Protokoll sowohl Proteinen.
  2. Aufzutauen, dass das Protein an das Harz auf Eis gekoppelt werden. Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung seines molaren Extinktionskoeffizienten und seine Absorption bei 280 nm 12.
    1. Alternativ können Sie einen Proteinbestimmung Assay wie dem Bicinchoninsäure-Assay 13. Wenn das Protein in einer aminhaltigen Puffer dialysiert oder Pufferaustausch gegen den Kopplungspuffer gelöst. Wenn das Protein in einem geeigneten Puffer (keine freien Amine) verdünnen 4fach in Kopplungspuffer.
  3. Ein 2-ml Harz für 2 mg Protein. Alle Schritte, die folgen, beziehen sich auf 2 ml Harz in einem 10-ml-Säule. Bis zu 10 mg Protein pro 1 ml Harz (: 1 Aufschlämmung 2 ml 1) verbunden werden.
  4. Bereiten Sie eine 10 ml-Säule, indem Sie eine Fritte nach unten und läuft PBS pH 7,4 durch. Cap ter Boden der Säule und 2 ml Kopplungspuffer.
  5. Fügen Sie das gewünschte Volumen an Schlamm (4 ml bis 2 ml Harz zu erhalten) an die Säule, entfernen Sie die Bodenkappe und lassen Sie die Spalte Drain. Spülen der Säule mit einer Gesamtzahl von 6 ml (3 Harz-Bettvolumen) Kopplungspuffer und damit der Säule ablaufen. Nach der Kupplungspuffer entleert, ersetzen Sie die Bodenkappe.
  6. Hinzuzufügen 2-4 ml Protein in Kupplungspuffer suspendiert, um die Säule (keep ein Aliquot der Proteinlösung, um die Kopplungseffizienz, indem die Proteinkonzentration des Eluats in Schritt 2.11 unter Verwendung von entweder der Absorption bei 280 nm oder die Bicinchoninsäure-Assay zu beurteilen) . Kappe und mischen kopfüber, um eine homogene Lösung zu haben.
  7. Wiegen Sie eine leere 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zu bewegen, um den Abzug. Sorgfältig über NaCNBH 3 (etwa 0,05 g) in der vorgewogen Rohr. Schließen Sie den Schlauch und wiegen die Röhrchen mit NaCNBH 3. Das Rohr Öffnen Sie nicht außerhalb der Haube.
  8. Bezogen auf das GewichtNaCNBH 3 in das Rohr übertragen, machen Sie eine 5 M-Lösung durch Zugabe von 1 M NaOH. Das Molekulargewicht des NaCNBH 3 62,84 g deshalb 0,05 g gleich (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 Mol) 7,96 x 10 -4 mol ist. Um eine 5 M Lösung add (7,96 x 10 -4 / 5) 159 ul 1 M NaOH zu machen.
  9. Messen Sie Gesamtvolumen der Reaktion der Einnahme des Harzvolumen in Betracht. In 10 ul 5 M NaCNBH 3 pro ml Reaktions.
    1. Zum Beispiel: für einen 4 ml Reaktionsvolumen werden 40 & mgr; l von 5 M NaCNBH 3. 1 ml Harz und 3 ml zugesetztes Protein, das Gesamtvolumen von 4 ml.
  10. Verschließen Sie die Spalte und Mischen über Kopf. Befestigen Sie die Säule an einem Rohr Rotator und ließ die Reaktion über Nacht weiter bei 4 ° C.
  11. Am Morgen bringen die Spalte an die chemischen Haube und entfernen Sie die Kappe so etwas Gas gebildet haben sorgfältig. Entleeren Sie die Säule in ein sauberes Röhrchen und speichern Sie das Eluat, das Protein con messentration mit der Absorption bei 280 nm Methode 12 oder die Bicinchoninsäure-Assay und vergleichen ihn mit dem Ausgangsprotein-Konzentration in Schritt 2.6.
  12. Das Harz wird mit 4 ml Kopplungspuffer und lassen Sie die Spalte Drain.

3. Blocking Verbleibende Seiten

  1. Mit 4 ml Puffer Abschrecken Waschen des Harzes. Abtropfen lassen und ersetzen Sie die Bodenkappe. 2 ml Puffer und Abschrecken auszusetzen Harzes.
  2. Beurteilung des gesamten Reaktionsvolumens durch Messung der Harzvolumen und das Abschrecken Puffervolumen dann werden 10 ul 5 M NaCNBH 3 pro ml Reaktionsvolumen.
  3. Vorsichtig mischen bei Raumtemperatur für 30 min End-Over-End. Nach 30 Minuten bringen Sie die Spalte in der Abzugshaube. Entfernen Sie vorsichtig die obere und dann die untere Kappe und lassen Sie die Spalte Drain in einen Abfallrohr.
  4. Mit 5 Harzvolumina Waschlösung Die Säule. Überwachen Sie die Waschanlagen für die Anwesenheit von Restproteine ​​durch Messung des Eluats der absorbance bei 280 nm. Entkoppelt Proteine ​​werden durch die hohe Salzkonzentration gewaschen.
  5. Mit 6 ml entgastem PBS pH 7,4, enthaltend 0,02% Natriumazid Waschen des Harzes. Halten der Säule auf 4 ° C, bis es benötigt.

4. Reinigung von Nurr1 spezifischer Antikörper

  1. Spülen Sie die Nur77 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie das abgelassen Nur77 LBD gekoppelt Säule in ein neues 15 ml Sammelröhrchen.
  2. 5 ml Protein A-gereinigten Anti-Nurr1-Antikörpern, die Kappe die Säule und den Platz auf einem Schüttler bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch. Beiseite auf Eis, bis bereit gesetzt, um zum Nor1 LBD gekoppelt Spalte hinzuzufügen.
  3. Spülen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube.
  4. In den Fluss durch von der Nur77 Putsch LBDLED-Säule vom Säule und auf einem Rotator bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch.
  5. Messung der Antikörperkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm.

5. ELISA-basierte Analyse von gereinigten Anti-Nurr1 Antikörper

  1. 100 l Protein (2,5 ug / ml) in die Vertiefungen einer 96 Well-Platte. Wenn die Prüfung 3 verschiedene Proteine ​​wird mit 100 ul Protein 1 die Vertiefungen A1 bis H4 wurden 100 ul Protein 2, die Vertiefungen A5 bis H8 und 100 & mgr; l von Protein 3 zu Vertiefungen A9 bis H12. Die Platte und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
  2. Zweimaliges Waschen der beschichteten Wells mit 300 ul pro Napf an PBS, pH 7,4 und 300 ul ELISA Blockpuffer an die gesamte Antigen-beschichteten Vertiefungen und inkubiert 2 h bei Raumtemperatur.
  3. Während die Platte blockiert Vorbereitung eines gewünschten Ausgangsverdünnung von gereinigtem anti-Nurr1-Antikörper (im Bereich von 10 bis 100 ug / ml) im ELISA Blockpuffer.
  4. Nach 2 Stunden der Sperrung, ersetzen Sie den ELISA-Blockpuffer mit 100 ul frisch ELISA-Blockpuffer in alle Vertiefungen.
  5. 100 l des verdünnten gereinigten anti-Nurr1 Antikörper in jede Vertiefung in der Reihe A. Seriell verdünnte die Antikörper durch die Übertragung von 100 ul der Lösung von Reihe A zu den Vertiefungen in der Reihe B, gefolgt von Übertragen von 100 ul der Lösung von Reihe zu Reihe B C Fortsetzung auf G. rudern Nach dem Mischen der Lösungen in den Vertiefungen in der Reihe G entsorgen Sie die zusätzliche 100 ul. Wells in Reihe H erhalten nur die ersten 100 l Blocking-Puffer. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  6. Drei (3) mal mit 300 ul pro Vertiefung von 0,05% Tween 20 waschen Sie die Platte in PBS pH 7,4 und trocknen Sie die Platte, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen.
  7. 100 l Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG ELISA in Blockpuffer verdünnt (1: 8.000 Verdünnung; der typische Bereich von 1: 5.000 bis 1: 25.000). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  8. Waschen Sie die Platte threie (3) mal so in 5.6 beschrieben. Spülen Sie alle Vertiefungen durch mit 300 ul entionisiertem Wasser füllt sie. Tupfen Sie überschüssiges Wasser durch Umdrehen der Platte auf absorbierendes Papier.
  9. Füge 100 ul 3, 3 ', 5, 5' Tetramethylbenzidin (auf Raumtemperatur erwärmt) in jede Vertiefung und inkubiert 15 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
  10. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 NH 2 SO 4.
  11. Extinktion bei 450 nm subtrahiert Hintergrund bei 650 nm.

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Ergebnisse

Ein Vergleich der Protein A-Säule gereinigt Nurr1-spezifische Antikörper mit Protein A gereinigter anti-Nurr1-Antikörper, gefolgt von Passage durch Nur77 LBD und Nor1 LBD Spalten ist in Figur 1 dar. Wie gezeigt ist ersichtlich, Protein A-gereinigten Nurr1-Antikörper zeigte eine starke Bindungs um Nurr1 LBD. Jedoch zeigte sich auch eine signifikante Bindung an Nur77 LBD und Nor1 LBD. Wenn Protein A-gereinigten Antikörper wurden Nurr1 weiter gegen Nur77 LBD und Nor1 LBD endgültigen affinitätsgereinigtem N...

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Diskussion

Der Erfolg dieses Protokoll beruht auf der Verfügbarkeit von reinen Proteinen zur Charakterisierung von Antikörpern gegen ein bestimmtes Mitglied der Proteinfamilie von Interesse angehoben. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Antikörper unter Verwendung von Protein A / G bis zum deutlich festgestellt, dass es signifikante Kreuzreaktivität mittels ELISA und Western-Blotting zu reinigen.

Wie im Text erwähnt, ist es wichtig zu vermeiden, Suspendieren des Proteins (en) werden auf der Säule in...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse (NS070577 und NS084869) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aufgereinigte Ligandenbindungsdomäne aus Nurr1, Nor 1 und Nur77Säulenspeicherlösung
AminoLink Kupplungsharz und KitThermo Scientific44890
Protein A-Spin-SäuleThermo Scientific89978
Dulbecco's phosphatgepufferte KochsalzlösungCorning21-031-CV
96 Well Platten mit flachem Boden, hoher Flansch, 330 μ lThermo Scientific3455
10% Normales ZiegenserumKPL50-675-69
Milchverdünnungsmittel / BlockierungskonzentratKPL50-82-01
IgG-ElutionspufferThermo Scientific21004
Micro BCA Protein Assay KitThermo Scientific23235
Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Thermo Scientific31460
Ni-NTA-HarzThermo Scientific88221
3, 3', 5, 5' TetramethylbenzydinThermo Scientific34028
2N H2SO4Macron FeinchemikalienH381 05
Protein A IgG-BindungspufferThermo Scientific21001
IgG-ElutionspufferThermo Scientific21004
Säule LagerlösungPhosphat gepuffert Kochsalzlösung mit 0,02 % Natriumazid
Spectra/Por 7 vorbehandelter DialyseschlauchSpectrum Labs132128
10 ml EinwegsäulenThermo Scientific29924
AminoLink Kupplungspuffer0,1 M Natriumphosphat, 0,05 % NaN3, pH 7,0
Quenching Puffer1M Tris. HCI, 0,05 % NaN3, pH
7,4
Waschlösung1 M NaCl, 0,05 % NaN3
ELISA-Blockierungspuffer1 % normales Pferdeserum (NHS), 1 % normales Ziegenserum (NGS) in 1X KPL Milchverdünnungsmittel
LagerlösungPBS pH 7,4 mit 0,02 % Natriumazid
Mikropipetten: 10 μ l; 20 μ l; 200 μ l; 1000 μ l

Referenzen

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