Koinfektion beim Menschen ist in vitro schwer zu replizieren. Humane Malariaparasiten können jedoch problemlos in vitro kultiviert werden, ebenso wie frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, die auf natürliche Weise mit HIV infiziert sind. Dies stellt ein hervorragendes Modell dar, um frühe Immunantworten auf Malariaparasiten im Rahmen einer HIV-Koinfektion zu untersuchen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Malaria und HIV-Koinfektionen sind eine wachsende Gesundheitspriorität. Die meisten Forschungen zu Malaria oder HIV konzentrieren sich derzeit jedoch auf jede einzelne Infektion. Obwohl es wichtig ist, die Krankheitsdynamik für jeden dieser Erreger unabhängig voneinander zu verstehen, ist es auch wichtig, dass die Wechselwirkungen zwischen diesen Erregern untersucht und verstanden werden.
Wir haben ein vielseitiges in vitro Modell der HIV-Malaria-Koinfektion entwickelt, um die Immunantworten des Wirts auf Malaria im Kontext einer HIV-Infektion zu untersuchen. Unser Modell ermöglicht die Untersuchung von sezernierten Faktoren in zellulären Überständen, Zelloberflächen- und intrazellulären Proteinmarkern sowie RNA-Expressionsniveaus. Das Versuchsdesign und die verwendeten Methoden begrenzen die Variabilität und fördern die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten.
Alle Krankheitserreger, die in diesem Modell verwendet werden, sind natürliche menschliche Krankheitserreger (Plasmodium falciparum und HIV-1), und alle infizierten Zellen werden auf natürliche Weise infiziert und frisch verwendet. Wir verwenden humane Erythrozyten, die mit P. falciparum parasitiert und in kontinuierlicher In-vitro-Kultur gehalten werden. Wir gewinnen frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut von chronisch HIV-infizierten Freiwilligen. Für jede verwendete Erkrankung gibt es eine geeignete Kontrolle (P. falciparum parasitiert vs. normale Erythrozyten), und jeder HIV-infizierte Spender hat eine HIV-nicht infizierte Kontrolle, von der die Zellen am selben Tag entnommen werden. Dieses Modell bietet eine realistische Umgebung, um die Wechselwirkungen zwischen Malariaparasiten und menschlichen Immunzellen im Rahmen einer HIV-Infektion zu untersuchen.
Einleitung
Co-Infektion, Infektion mit mehreren gleichzeitigen Infektionen, ist die Norm in natürlichen Umgebungen. Co-Infektion kann einen großen Einfluss auf die Krankheitspathologie und der klinischen Behandlung von jeder Infektion. Im Zusammenhang mit der Ko-Infektion, Impfstoff und Wirksamkeit von Medikamenten sowie diagnostische Tests können negativ beeinflusst werden (Übersicht in 1). Trotz ihrer Bedeutung ist die Mehrheit der Erreger der Forschung ist jedoch der Auffassung nur einzelne Infektionen.
Malaria und HIV-1 (HIV) sind die führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität weltweit. Bereiche von Malaria und HIV Endemizität t....
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Protokoll
Dieses Protokoll erfordert die Rekrutierung von Spendern für Serum und RBC für Parasitenkultur verwendet werden und HIV (+) und nicht-infizierten Spendern für PBMC Isolierung. Institutional Review Boards müssen alle Studien zu genehmigen und alle Geber müssen informierte Zustimmung vor der Blutabnahme zu schaffen.
ACHTUNG: Die Arbeit mit menschlichen Blutproben und die menschliche Malaria-Parasiten erfordert Vorsichtsmaßnahmen. Tragen Sie immer einen Laborkittel, Handschuhe, und die Arbeit in einem Level 2 Biosicherheitsschrank. Im Falle einer versehentlichen perkutanen Exposition für die menschliche Malaria zu melden, um Gesundheit und S....
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Ergebnisse
Die Graphen zeigen die Niveaus der IFN & ggr; Produktion von NKT-Zellen (Figur 2), mit CD56 + CD3 + γδ- Toren der NKT Zellen Population zu erhalten (Daten nicht gezeigt). Die Zellen wurden für 72 Stunden vor der Färbung kultiviert. Sobald befleckt, 100.000 CD3 + Zellen wurden auf die Strömung erfasst Zytometer zu groß genug Populationen von NK, NKT und γδ-Zellen (Zellen von Interesse) zu erhalten. Ein Minimum von 5600 NKT-Zellen sind auf jedem Graphen angezeigt. TNF-Produktion wird in der gleichen A.......
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Diskussion
Unser Protokoll wurde entwickelt, um HIV-Malaria-Koinfektion meisten realistisch studieren in vitro optimiert. Zunächst werden frische menschliche Erythrozyten und Serum für die Malaria-Parasiten Kultur erforderlich. Dies ist entscheidend, um eine gesunde Population von Malaria-Parasiten zu erhalten. Parasite Lysaten kann nicht für Live-Parasiten substituiert sein, wie Zytokin-Produktion viel schneller und intensiver bei der Verwendung von Live-P. falciparum infizierten RBC (PfRBC) 17,18. Zu.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
C.A.M.F. und L.S. beteiligten sich an der Protokollgestaltung, der Datenerfassung und -analyse sowie an der Erstellung des Artikels.
Die Autoren danken Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth und Dr. Ayi für ihre Beiträge.
C.F. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN) unterstützt. L.S. wird durch einen OHTN Junior Investigator Development Award unterstützt. Die vorliegende Arbeit wurde durch einen Betriebszuschuss der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 und 115160) und einen CIHR New Investigator Catalyst Zuschuss unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alanin | Sigma | A7377 | |
| Antikörper (siehe andere Tabelle) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm mit BD GolgiPlug | BD | 555028 | enthält Brefeldin A, Cytofix/Cytoperm Puffer und Perm/Wash Puffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Natriumheparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (kein Calcium, kein Magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetales Rinderserum | Sigma | F1051 | vor Gebrauch hitzeinaktiviert |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Färbeset | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Hypoxanthin | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM nicht-essentielle Aminosäuren (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 Pulver | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 mit L-Glutamin und HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| Natriumbicarbonat (Pulver, Zellkultur) | Sigma | S5761 | |
| Natriumpyruvat (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma Base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypanblau (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | hängt von den verwendeten Antikörpern |
| Parasitengasgemisch | Sonderbestellung | 3% CO2, 1% O2, Saldo N2 | |
| >Equipment | |||
| 0,2 μ m Filtereinheit | |||
| Objektträger | |||
| T25 Kolben | |||
| T75 Kolben | |||
| 50 ml Röhrchen | |||
| 24 Well Kulturplatten | |||
| unplugged Pasteur Pipetten | |||
| verstopft Pasteur Pipetten | |||
| Transferpipetten Hämozytometer | |||
| Durchflusszytometer (3 Laser) | |||
| Antikörper für die Durchflusszytometrie | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (Fluorophor) 2 μ l |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (Fluorophor) 20 μ l |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (Fluorophor) 1 μ l |
| Anti-CD14-Biolegende | ; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (Fluorophor) 0,5 μ l Streptavin PE-TR (Fluorophor) 0,1 μ l |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (Fluorophor) 5 μ l |
| Anti-γ δ | Biolegend | 331212 | APC (Fluorophor) 5 μ l |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (Fluorophor) 5 μ l |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (Fluorophor) 1 μ l |
Referenzen
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
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Nachdrucke und Genehmigungen
