T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Bakterienerfassung durch CD4 ⁺ T-Zellen, die während der Antigenpräsentation über transinfection aus bereits infizierten dendritischen Zellen (DC) auftritt, zu messen. Wir zeigen, wie man die notwendigen Schritte durchführen: Isolierung von primären Zellen, Infektion von DC, DC / T-Zell-Konjugat-Bildung, und die Messung der bakteriellen T-Zell-Transfektion.

Zusammenfassung

Kürzlich haben wir gezeigt, im Gegensatz zu dem, was beschrieben wird, dass CD4⁺ T-Zellen, das Paradigma der adaptiven Immunzellen, Bakterien von infizierten dendritischen Zellen (DCs) durch einen Prozess namens Transinfektion einfangen. Im Folgenden wird die Analyse des Transinfektionsprozesses beschrieben, der im Verlauf der Antigenpräsentation abläuft. Dieser Prozess wurde durch die Verwendung von CD4⁺ T-Zellen aus transgenen OTII-Mäusen aufgedeckt, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) tragen, der spezifisch für ein Peptid von Ovoalbumin (OVAp) ist, der daher stabile Immunkomplexe mit infizierten dendritischen Zellen bilden kann, die mit diesem spezifischen OVAp beladen sind. Die Dynamik von grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden Bakterien während der Übertragung von DC-T-Zellen kann durch Lebendzellbildgebung überwacht werden, und die Quantifizierung der bakteriellen Transinfektion kann durch Durchflusszytometrie erfolgen. Darüber hinaus kann die Transinfektion durch eine empfindlichere Methode quantifiziert werden, die auf der Verwendung von Gentamicin basiert, einem nicht permeablen Aminoglykosid-Antibiotikum, das extrazelluläre Bakterien, aber keine intrazellulären Bakterien abtötet. Diese klassische Methode wurde bereits in der Mikrobiologie eingesetzt, um die Wirksamkeit bakterieller Infektionen zu untersuchen. Hiermit erläutern wir das Protokoll des gesamten Prozesses, von der Isolierung der Primärzellen bis zur Quantifizierung der Transinfektion.

Einleitung

Wenn ein Erreger infiziert seinen Wirt, gibt es normalerweise eine Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunreaktionen, für die bakterielle Clearance erforderlich. Angeborene Immunität ist die erste Verteidigungslinie, die meisten Infektionen verhindert. Angeborenen Immunität zu unterscheiden in einer präzisen Art und Weise Elemente, die in breiten Gruppen von Mikroorganismen konserviert sind (pathogen-associated molecular patterns, PAMPS) ^1. Die Mechanismen der angeborenen Immunität umfassen physikalische Barrieren, wie Haut, Chemikalien Barrieren (antimikrobielle Peptide, Lysozym) und die angeborenen Leukozyten, der die Phagozyten (Makrophagen, Neu....

Protokoll

Hinweis: Experimentelle Verfahren wurden vom Ausschuss für Forschungsethik der Universidad Autónoma de Madrid genehmigt und in Übereinstimmung mit spanischen und europäischen Richtlinien unter der Aufsicht von der Universidad Autónoma de Madrid Leiter der Tierschutz und Tiergesundheit durchgeführt. Die Mäuse wurden in spezifischen pathogenfreien (SPF) Gehäuse gezogen und sie von geschultem und qualifiziertem Personal unter Verwendung von Kohlendioxid _(CO 2) Inhalationsmethode eingeschläfert wurden.

1. Maus-Knochenmark-abgeleitete DCs Differenzierung und Infektion

ANMERKUNG: Abbildung ....

Ergebnisse

Hier beschrieben wir, wie man murine T-Zell-bakterielle transinfection von infizierten Knochenmark-DCs und wie bakterielle transinfection über zwei verschiedene Ansätze Messung durchführen: Durchflusszytometrie und Gentamicin-Überlebenstests Abbildung 1 fasst die Vorgehensweise, um die Zellen zu erhalten.. DCs werden durch Inkubation der Knochenmarkszellen, die mit GM-CSF für 9 Tage erzeugt. Dann werden DCs mit LPS gereift zu MHCII auf ihrer Membran zu erhöhen, um sie sp.......

Diskussion

T-Zellen oder T-Lymphozyten sind eine Art von Leukozyten, die eine zentrale Rolle bei der zellvermittelten Immunität spielen und gehören zu der adaptiven Immunantwort ^26. T-Zellen sind resistent gegen in vitro infiziert aber einige Berichte zeigen, dass sie in vivo ^14,15 infiziert werden. Die intime Kontakte des APC und T-Zellen während der Immunsynapse als Plattform für den Austausch von biologischem Material ^13, darunter auch einige Viren wie HIV ^{11 dien.......}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS		SIGMA L2630-10mg
Na Pyruvat	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323– 339)	GenScript
Zellensieb 70uM	BD	352350
30 μM Spritze Filcons Sterile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicin	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehyd 16%	Elektronenmikroskopie Sciences	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Klon RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonellen	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antikörper, hochgradig kreuzadsorbiertes	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-Amino-4-chlormethylcumarin)	Life technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences