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Research Article
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Gerüste, die in kranio-maxillofaziale (CMF) Knochendefekte passen können und gleichzeitig Osteokonduktivität und Bioaktivität aufweisen, sind von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines Formgedächtnisgerüsts auf der Basis von Polycaprolactondiacrylat (PCL-DA) unter Verwendung eines Lösungsmittelguss-Partikelauslaugungsverfahrens (SCPL) unter Verwendung einer geschmolzenen Salzschablone und des Aufbringens einer bioaktiven Polydopaminbeschichtung.
Tissue Engineering wurde als alternative Strategie für die Behandlung von Cranio-maxillofacial (CMF) Knochendefekten kritischer Größe untersucht. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist ein Gerüst, das in der Lage ist, sich konform in einen unregelmäßigen Defekt einzufügen und gleichzeitig die erforderliche biologische Abbaubarkeit, Porenvernetzung und Bioaktivität aufweist. Aufgrund ihrer Formwiederherstellungs- und Fixierungseigenschaften könnten Gerüste aus Formgedächtnispolymer (SMP) einen "selbstanpassenden" Defekt erreichen. Auf diese Weise würde das SMP-Gerüst nach der Einwirkung von warmer Kochsalzlösung (~60 ºC) formbar werden, so dass es von Hand in einen unregelmäßigen Defekt gedrückt werden kann. Eine anschließende Abkühlung (~37 ºC) würde das Gerüst innerhalb des Defekts wieder in seinen relativ steifen Zustand versetzen. Um diese Anforderungen zu erfüllen, beschreibt dieses Protokoll die Herstellung von SMP-Gerüsten, die durch die photochemische Aushärtung von biologisch abbaubarem Polycaprolacton-Diacrylat (PCL-DA) unter Verwendung eines Solvent-Casting-Partikellaugungsverfahrens (SCPL) hergestellt werden. Eine geschmolzene Salzschablone wird verwendet, um eine Porenvernetzung zu erreichen. Um die Bioaktivität zu realisieren, wird eine Polydopamin-Beschichtung auf die Oberfläche der Porenwände des Gerüsts aufgebracht. Die Charakterisierung des Selbstanpassungs- und Formgedächtnisverhaltens, der Poreninterkonnektivität und der in vitro Bioaktivität wird ebenfalls beschrieben.
Zur Zeit als Goldstandard der Kiefer- und Gesichts (CMF) Knochendefekt-Behandlungen, ist die Transplantation von autologen Transplantaten geerntet durch komplexe Transplantation Verfahren, Entnahmemorbidität und der begrenzten Verfügbarkeit 1 behindert. Eine besondere Schwierigkeit ist die Gestaltung und Befestigung des starren Autotransplantat fest in den Defekt, um die Osseointegration zu erhalten und Transplantat Resorption verhindern. Tissue Engineering ist als alternative Strategie zur Autotransplantation und synthetischen Knochenersatzmaterialien (zB Knochenzement) 2,3 untersucht. Entscheidend für den Erfolg einer Tissue-Engineering-Ansatz ist ein Gerüst mit einem bestimmten Satz von Eigenschaften. Erstens, um die Osseointegration zu erreichen, muss das Gerüst engem Kontakt mit angrenzenden Knochengewebe 4 zu bilden. Das Gerüst sollte auch osteokonduktive werden, wodurch die Zellmigration, Nährstoffdiffusion und neotissue Abscheidung 4,5. Dieses Verhalten ist in der Regel mit biologisch abbaubaren sca erreichtffolds die eine hochgradig vernetzten Porenmorphologie. Schließlich sollte das Gerüst bioaktiven sein, um die Integration und Bindung mit umgebenden Knochengewebe 5 zu fördern.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Gewebetechnik Gerüst mit diesen Eigenschaften herzustellen. Wichtig ist, weist dieses Gerüst die Fähigkeit, "self-fit" in unregelmäßige CMF Defekte aufgrund seiner Formgedächtnisverhalten 6. Thermoresponsive Formgedächtnispolymere (SMP) sind dafür bekannt, Formänderung bei Belichtung unterziehen, um zu heizen 7,8. SMPs sind von "Netzpunkte" (dh chemische oder physikalische Vernetzungen), die die permanente Form und "Schaltsegmente", die die temporäre Form zu erhalten und wiederherzustellen die permanente Form festzustellen, besteht. Die Schaltsegmente weisen eine Wärmeübergangstemperatur (T trans) entspricht, entweder die Glasübergangs (Tg) oder Schmelzübergang (Tm) des Polymers. AlsFolglich können SMPs nacheinander in eine temporäre Form bei T> T trans, in der temporären Form bei T <T trans fixiert verformt werden und wiedergewonnen, um die permanente Form bei T> T trans. Somit wird ein SMP-Gerüst "Selbst-Montage" in einem CMF Defekt erreichen könnte wie folgt 6. Nach der Belichtung mit warmer Kochsalzlösung (T> T trans), wäre ein SMP-Gerüst werden zu formbaren, wodurch eine allgemein vorbereiteten zylindrischen Gerüst Hand gepressten in einem unregelmäßigen defekt sein, mit Formrück Förderung Expansion des Gerüsts des Mangels Grenze. Beim Abkühlen (T <T trans), würde das Gerüst seiner relativ starrer Zustand zurück, mit Formstarrheit seiner neuen temporären Form innerhalb des Defekts erhalten bleibt. In diesem Protokoll wird ein SMP-Gerüst von Polycaprolacton (PCL) hergestellt, ein biologisch abbaubares Polymer intensiv untersucht für die Geweberegeneration und andere biomedizinische Anwendungen 9-11. Für Formgedächtnis, the T m von PCL dient als die T trans und variiert zwischen 43 und 60 ºC, abhängig vom Molekulargewicht des PCL 12. In diesem Protokoll wird die T trans (dh T m) des Gerüstes beträgt 56,6 ± 0,3 ºC 6.
Um Osteokonduktivität zu erreichen, wurde ein Protokoll entwickelt, um PCL-basierten SMP Gerüste mit stark miteinander verbundenen Poren auf der Basis eines Lösungsmittelgießen Partikel-Laugung (SCPL) Methode 6,13,14 zu machen. Polycaprolacton-diacrylat (PCL-DA) (M n = ~ 10.000 g / mol) wurde verwendet, um eine schnelle, photochemischen Vernetzung zu ermöglichen, und wurde in Dichlormethan (DCM) gelöst, um Lösungsmittel-Gießen über der Salzvorlage ermöglichen. Nach der photochemischen Härtung und Lösungsmittelverdampfung wurde das Salz Vorlage durch Auslaugen in Wasser entfernt. Die durchschnittliche Salzgröße regelt Gerüstporengröße. Wichtig ist, das Salz-Vorlage mit Wasser verschmolzen wurde vor der Lösungsmittel-Gießen zur Poren interconnectivi erreichenty.
Bioaktivität wurde auf Porenwänden 6 zu der SMP-Gerüst durch die in situ-Bildung eines polydopamine Beschichtung verliehen wird. Bioaktivität wird häufig durch Einschluß von Glas oder Glaskeramik-Füllstoffe 15 in Gerüste eingebracht. Doch diese können zu unerwünschten spröden mechanischen Eigenschaften zu geben. Dopamin ist gezeigt worden, um eine haftende, dünne polydopamine Schicht auf einer Vielzahl von Substraten 16-19 bilden. In diesem Protokoll wurde die SMP Gerüst einer leicht basischen Lösung (pH = 8,5) von Dopamin zogen, um eine Beschichtung von polydopamine nanothick auf allen Porenwandoberflächen 6 bilden. Zusätzlich zur Verbesserung Oberflächenhydrophilie für verbesserte Zelladhäsion und Ausbreitung hat polydopamine gezeigt worden bioaktiven in Bezug auf die Bildung von Hydroxyapatit (HAp) bei Belichtung mit simulierter Körperflüssigkeit (SBF) 18,20,21 sind. In einem letzten Schritt wird das beschichtete Gerüst ausgesetzt Behandlung bei 85 ºC (T> T trans) wh erhitzenich führt zu Verdichtung Schafott. Wärmebehandlung wurde bereits erwähnt die für Gerüstformgedächtnisverhalten zu sein, möglicherweise aufgrund PCL kristallinen Domänen Reorganisation um eine größere Nähe 14.
Wir beschreiben außerdem die Methoden, um die Selbstsitz Verhalten innerhalb einer unregelmäßigen Modell Defekt zu charakterisieren, Formgedächtnisverhalten in Bezug auf Belastung gesteuerte zyklische thermomechanische Druckversuche (dh Wiederherstellung der Form und Gestalt Festigkeit), Porenmorphologie und In-vitro-Bioaktivität. Strategien zur Gerüsteigenschaften maßzuschneidern werden ebenfalls vorgestellt.
1. Synthesizing PCL-DA Makromer
2. Vorbereitung des SMP Gerüst (Abbildung 1)
3. Anwenden Polydopamine Coating auf SMP-Gerüst (Abbildung 1)
4. Auswerten "Self-Montage" Verhalten
5. Testen Formgedächtnisverhalten
6. Visualisierung Porengröße und Interkonnektivität
7. Prüfung von in-vitro-Bioaktivität
Die resultierende PCL basierende MMP-Gerüst ist in der Lage selbst passend in einem Modell CMF Defekt (Abbildung 2). Nach kurzer Einwirkung von Salzlösung (~ 60 ° C) erwärmen, erweicht die zylindrische Gerüst ermöglicht das Gerüst manuell in gedrückt werden und innerhalb des Modells Defekt zu erweitern. Nach dem Abkühlen auf RT wird das Gerüst in die neue temporäre Form, die nach der Entnahme aus dem Defekt zurückgehalten wird fixiert.
Die Formgedächtnisverhalten eines SMP-Gerüst wird durch spannungsgesteuerten zyklischen thermomechanischen Druckversuche in Bezug auf Form Festigkeit (R f) und Formwiederherstellung (R r) (Abbildung 3) quantifiziert. Für diese PCL basierenden SMP Gerüst Werte (%) für Zyklen n = 1 und 2 sind: R f (1) = 102,5 0,7, R f (2) = 101,8 0,3, R r (1) 95,3 0,9 und R r (2) = 99,8 0,2 6.
Die SMP-Gerüst zeigt eine stark vernetzten Porenmorphologie, die beobachtetdurch REM-Aufnahmen (4A). Dies wurde durch die Verwendung einer Salzschmelze Vorlage, durch die Zugabe einer kleinen Menge von Wasser zu dem gesiebten Salz (Figur 1) gebildet erreicht.
Nach Kontakt mit simulierter Körperflüssigkeit (SBF; 1X) für 14 Tage, REM-Aufnahmen bestätigen die Bildung von HAp (4B), wodurch Gerüst Bioaktivität anzeigt.

Abbildung 1. Schematische für die Vorbereitung der SMP-Gerüst mit polydopamine. ASMP Gerüst beschichtet wird über die beschriebenen Protokoll auf Basis des photochemische Härtung der Polycaprolacton-diacrylat (PCL-DA) unter Verwendung eines Lösungsgießen Partikel-Laugung (SCPL) Verfahren hergestellt unter Verwendung von Schmelzsalz-Vorlage und Anwendung eines bioaktiven polydopamine Beschichtung. Die abschließende Wärmebehandlung bei 85 ° C (T> T trans) induziert Gerüst densifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Beobachtung der Selbstsitzverhalten. Ein zylindrischer SMP Gerüst (~ 6 mm Durchmesser x ~ 5 mm Höhe) befindet sich in einem "unregelmäßige Defektmodell" ausgestattet (A) wie folgt. Beim Erhitzen in Wasser bei ~ 60 ° C (T> T trans), das Gerüst weich und formbar wird (B) und kann somit mechanisch gepresst werden ("ausgestattet") innerhalb der Modellfehler (C). Nach Abkühlen auf RT wird das SMP Gerüst entfernt und behält seine neuen, festen temporären Form (D). Beim anschließenden Erhitzen auf ~ 60 ° C, das Gerüst durchläuft eine Formwiederherstellung zu der ursprünglichen, generische zylindrische Form. <ahref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52981/52981fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3. Messung der Formgedächtnisverhalten. Das Formgedächtnisverhalten eines SMP Gerüst bei der spannungsgesteuerten zyklischen thermischer mechanischer Kompressionstest auf einem Gerüst quantifiziert Gestalt fixity (Rf) und Formwiederherstellung (R r) auf der Basis festzustellen Messungen der ε m, ε u, und ε p. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Beobachtung der pore Vernetzung und Bildung von Hydroxyapatit (HAp). Repräsentative SEM-Bilder eines unbeschichteten, wärmebehandelt SMP Gerüst (Maßstab = 200 & mgr; m) (A) und beschichtet, wärmebehandelt Gerüst nach der Einwirkung von SBF (1x) 14 Tage (Maßstab = 50 & mgr; m) (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Gerüste, die in kranio-maxillofaziale (CMF) Knochendefekte passen können und gleichzeitig Osteokonduktivität und Bioaktivität aufweisen, sind von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines Formgedächtnisgerüsts auf der Basis von Polycaprolactondiacrylat (PCL-DA) unter Verwendung eines Lösungsmittelguss-Partikelauslaugungsverfahrens (SCPL) unter Verwendung einer geschmolzenen Salzschablone und des Aufbringens einer bioaktiven Polydopaminbeschichtung.
Die Autoren danken der Texas A & M University Engineering and Experiment Station (TEES) für die finanzielle Unterstützung dieser Forschung. Lindsay Nail dankt Unterstützung von der Texas A & M Universität Louis Stokes Allianz für Minderheitsbeteiligung (LSAMP) und der National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang dank der Texas A & M University Dissertation Fellowship.
| Polycaprolacton-diol (Mn ~ 10.000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichlormethan (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Getrocknet über 4A Molekularsiebe |
| 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamin (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloylchlorid | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethylacetat | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Kaliumcarbonat (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| wasserfreies Magnesiumsulfat (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopaminhydrochlorid | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris-Puffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Wird bei einer Konzentration von 10 mM verwendet, pH = 8,5 |
| Sieb | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Rasterelektronenmikroskop (REM) | FEI | Quanta 600 |