Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Zusammenfassung

Mikroglia können Neuronen und andere Gliazellen in Kultur durch verschiedene nicht-zellautonome Mechanismen beeinflussen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Mikroglia selektiv aus primären neuronalen Kulturen zu depletieren. Diese Methode hat das Potenzial, die Rolle von mikroglial-neuronalen Interaktionen aufzuklären, mit Auswirkungen auf neurodegenerative Erkrankungen, bei denen Neuroinflammation ein charakteristisches Merkmal ist.

Zusammenfassung

Mikroglia, die residenten immunkompetenten Zellen des ZNS, spielen eine vielfältige Rolle bei der Modulation und Kontrolle der neuronalen Funktion sowie bei der Vermittlung der angeborenen Immunität. Primäre Zellkulturmodelle von Nagetieren haben unser Verständnis der neuronal-glialen Interaktionen erheblich verbessert, aber erst in jüngster Zeit wurden Methoden zur gezielten Eliminierung von Mikroglia aus Mischkulturen eingesetzt. Eine solche Technik – die hier beschrieben wird – ist die Verwendung von L-Leucinmethylester, einem lysomotropen Mittel, das von Makrophagen und Mikroglia internalisiert wird, wobei es eine lysosomale Störung und anschließende Apoptose verursacht^13,14. Experimente mit L-Leucinmethylester haben die Möglichkeit, den Beitrag von Mikroglia zur umgebenden zellulären Umgebung unter verschiedenen Kulturbedingungen zu identifizieren. Anhand eines in unserem Labor optimierten Protokolls beschreiben wir, wie Mikroglia aus P5-Kleinhirn-Körnerzellkulturen von Nagetieren eliminiert werden können. Dieser Ansatz ermöglicht es, den relativen Einfluss von Mikroglia auf experimentelle Daten zu bewerten und zu bestimmen, ob Mikroglia eine neuroprotektive oder neurotoxische Rolle in Kulturmodellen für neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer oder Parkinson spielen.

Einleitung

Das menschliche Gehirn enthält schätzungsweise 85 Milliarden Neuronen und eine weitere 85 Milliarden nicht-neuronalen Zellen, sowie Glia ^1. Daher der griechischen Etymologie "Glia" übersetzt in englisch als - zum größten Teil von den letzten 100 Jahren haben Neurowissenschaftler überwiegend auf der neuronalen Zellpopulation konzentriert, zu glauben, Gliazellen auf wenig mehr als passive Stützzellen, die strukturelle Unterstützung für den Neuronen vorgesehen sein "Leim". In jüngster Zeit wurde es jedoch zunehmend offensichtlich geworden, dass neuronale-glial Wechselwirkungen können weitaus Grund grundlegende Aspekte der Neurobiologie, Neurophysiologie und der Entstehung und Progression von vielen neurodegenerativen Krankheiten. Kleinhirn-Körnerzellen (BVKA), die am häufigsten vorkommende homogene neuronalen Population im menschlichen Gehirn, dominieren das Kleinhirn und machen mehr als 90% der Zellbestandteile. Folglich wurden diese Zellen ausgiebig in vitro als Modellsystem für T verwendeter studieren der neuronalen Entwicklung, Funktion und Pathologie ^2-6.

Allerdings enthalten CGC Kulturen noch Mikroglia und anderen Glia in wohl signifikante Anteile. Als Ergebnis CGC Daten mutmaßlich Anzeige direkten neuronalen Reaktionen auf verschiedene Zellen Behandlungen können in der Tat ergeben - teilweise oder insgesamt - aus dem indirekten sekundäre Antwort benachbarter Glia in der Kultur. Um dies zu beurteilen, haben wir selektiv abgespalten Mikroglia von CGC neuronalen Kulturen mit Hilfe von L-Leucinmethylester (LME). LME ist ein lysomotropic Mittel ursprünglich benutzt, um selektiv Makrophagen ⁷ zerstört und seit verwendet worden, um auch selektiv abzureichern Mikroglia aus neuralen, Astrozyten und gemischten Gliakulturen ^8.9.10. LME wird von Makrophagen und Mikroglia verinnerlicht, bei dem es lysosomalen Unterbrechung und anschließender Apoptose ^13,14 bewirkt. Makrophagen und Mikrogliazellen sind charakteristischerweise reich an Lysosomen, wodurch sie particula seinrly anfällig bei Exposition gegenüber LME Behandlung. Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke und dennoch einfache und einfache Möglichkeit, den Beitrag der Mikroglia in Experimenten unter Verwendung von CGC und andere neuronale / Gliazellen Kultursystemen zu ermitteln.

Protokoll

Alle hierin beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 durchgeführt.

1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte

1. Bereiten Sie zwei Edelstahl Labor Präparierscheren und zwei Edelstahl-Laborzangen. Autoklaven alle Instrumente und in eine Kultur Haube O / N unter ultraviolettem Licht (UV) Licht für die Sterilisation.
2. Bilden 500 ml Minimum Essential Medium (MEM) Kulturmedium (10% Fötales Rinderserum [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO _3, 30 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 6 & mgr; g / ml Ampicillin) und Filter zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C für Monate.
3. Bereiten Sie 24 Well-Kulturplatten mit 14 mm, die Nummer 1 Dicke Deckgläser. Autoklaven werden die Deckgläser und Mantel in 100 mg / l Poly-D-Lysin (PDL), wie vorstehend beschrieben ^3. UV-Licht sterilisiert O / N.

2. Herstellung von CGC Kulturlösungen

1. Vorbereiten "Lösung A" (100 ml) in autoklavierten, UV-Licht behandelt, steriles dH _{& sub2;} O, enthaltend 250 mg Glukose, 300 mg Rinderserumalbumin [BSA], 955 mg phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] (Ca ²⁺ und Mg ⁺ free), und 1 ml 3,8% MgSO ₄ · 7 H ₂ O.
2. Vorbereiten "Lösung B" (10 ml), die 1 ml 5 mg / ml Trypsin in 9 ml Lösung A verdünnt
3. Vorbereiten "Lösung C" (10 ml), enthaltend 1.000 Einheiten DNase, 0,5 mg Sojabohnentrypsininhibitor, 100 & mgr; l 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O, 10 ml mit Lösung A. verdünnt
4. Vorbereiten "Lösung D" (20 ml), die 3,2 ml der Lösung C auf 20 ml mit Lösung A. verdünnt
5. Vorbereitung Balanced Salt Solution (EBSS) Lösung BSA / Earles enthaltende EBSS, 25 mM _NaHCO3, 3 mM MgSO ₄ · 7H ₂ O, und4% BSA, pH 7,4, wie zuvor beschrieben, ^3.
6. Bereiten LME durch Zugabe von reinem LME in 5 ml MEM Kulturmedium, um eine Endkonzentration von 150 mM LME zu geben, zurück die Lösung auf pH 7,4 mit einem pH-Meter Tisch Modell und Filter-sterilisiert unter Verwendung eines 28 mm Polyethersulfon (PES) 0,2 um Spritzen Filter.

3. Kultivierung der BVKA

1. Sammeln cerebella 4-7 Tage alten Rattenjungen, wie zuvor beschrieben ^3. Platzieren Sie sofort in Petrischale mit 5 ml Lösung A auf Eis.
2. Gießen Sie überschüssige Lösung von Kleinhirne und Ort Gewebe in der Petrischale Deckel.
3. Zerhacken Gewebe fein mit einer gut geflammt Rasierklinge in mindestens drei verschiedenen Richtungen.
4. Gehackte Gewebe zu Lösung B (rinse Petrischale mit Lösung begrenzte Gewebe sicherzustellen geht verloren) und im Wasserbad bei 37 ° C für 5 min. Vorsichtig schütteln alle paar min.
5. In Lösung D (20 ml) zu dem Rohr, um das Trypsin, schütteln und Cent zu neutralisierenrifuge bei 65 × g für 5 min.
6. Überstand abgießen.
7. Resuspendieren in 4 ml Lösung C Man reibt gut (ca. 10 mal) mit je drei geflammten Glaspipetten mit abnehmendem Durchmesser, bis die Suspension so homogen wie möglich ist.
8. Langsam und vorsichtig ein paar Tropfen dieses Homogenats auf dem BSA / EBSS. Wenn es beginnt, durch die BSA / EBSS Spüle, verreiben mehr und / oder fügen Sie ein wenig mehr Lösung C. Das Homogenat sollten in einer Schicht auf der Oberseite des BSA / EBSS sitzen. Nicht schütteln. Spin bei 100 xg für 5 min.
9. Überstand entfernen und Pellet (weich) in 1 ml MEM-Medium.
10. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei 800.000 Zellen / Deckglas in 500 & mgr; l MEM-Medium. In einem Brutschrank bei 37 ° C unter 6% CO _2.
11. Ändern Sie den folgenden Tag (24 bis 36 Stunden nach der prep) des Mediums. Stellen eine Lösung von MEM-Medium mit 10 & mgr; M des Zellzyklus-Inhibitors arabinofuranosyl Cytidin (AraC).
    1. Für jedenDeckglas, behalten 250 ul des alten Mediums in einem frischen 24-Well-Platte, saugen Sie den Rest, fügen Sie 250 ul normalen MEM-Medium und saugen Sie diese, um die Zellen zu waschen, dann die 250 ul alte Medium zurück in den Zellen und füllen mit 250 ul AraC enthaltenden Medium.
       Hinweis: Zellen kann von 6 Tagen in vitro (DIV) verwendet werden.

4. Wahlweise zum Abbau der Mikroglia (Durchgeführt bei 6 DIV)

1. Hinzuzufügen reinen LME bis 5 ml eines separaten Aliquot MEM-Medium auf eine Endkonzentration von 150 mM LME ergeben.
2. Rückkehr der Lösung auf pH 7,4 und mit einem Filter sterilisiert 28 mm Polyethersulfon (PES), 0,2 & mgr; m Spritzenfilter filtriert.
3. Verdünnte Lösung auf eine Konzentration von 50 mM (2 x LME) in MEM-Medium und in einem Wasserbad bei ³⁷ ° C für 10 min mit dem normalen MEM Medium für Kontrollkulturen.
4. Entfernen Sie die Hälfte (250 ul) der MEM-Medium von CGC Kulturen und bei 37 ° C zu halten.
5. Treat-Zellenmit MEM-Medium, das 2 x LME (250 ul), das heißt 1: 1 verdünnt hat ein schönes Konzentration von 25 mM oder mit vorgewärmter MEM-Medium ohne LME (250 ul) für Kontrollkulturen.
6. Zellen bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6% CO ₂ für 1 Stunde.
7. Wash Zellen zweimal in frischem vorgewärmten MEM-Medium zu LME haltigen Medien zu entfernen, und ersetzen Sie dann den gehaltenen Kulturmedium und ein gleiches Volumen an frischem vorgewärmten MEM-Medium in die entsprechenden Wells.
8. Zurück Kulturen in den Inkubator (mit 6% CO ₂ bei 37 ° C befeuchtet) ruhen lassen für 24 h vor der weiteren Behandlung.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieser Technik selektiv zu eliminieren Mikroglia CGC und / oder Mischkulturen beruht auf der nachfolgenden Fähigkeit des Untersuchers genau zu identifizieren und zu differenzieren Mikroglia aus ihrer umgebenden Zellen. Dies kann mit einer Mikroglia-spezifischen Zellmacher, wie isolectin-B4 erreicht werden, wie in 1 dargestellt. Wie in Figur 2 gezeigt, wurden keine beobachtbaren Änderungen in Astrozyten und neuronalen Dichte und Morphologie in Bezug auf jede Hauptbehandlung...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte, um die erfolgreiche selektive Elimination von Mikroglia CGC sichern und / oder Mischkulturen sind: 1) die Aufrechterhaltung einer sterilen und gesunde CGC Kultur; 2) Sterilfiltrieren der LME haltigen Medium und Rückführen der Lösung auf pH 7,4; 3) halten die beibehalten CGC Medien und LME haltigen Medien bei 37 ° C, um Hitzeschock zu vermeiden; und 4) schnell arbeiten, um die Zeit-Zellen werden außerhalb des Inkubators gehalten zu reduzieren.

Wir haben ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pinzette	Sigma-Aldrich	F4142	Das gebogene Ende erleichtert die Entfernung des Kleinhirns
Mikro-Präparierschere	Sigma-Aldrich	S3146	Gerade, scharfe Spitze erleichtert das Präparieren von Nagetieren P4-7
L-Leucinmethylesterhydrochlorid	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS-Lösung	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-Lysin	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Deckgläser 1 Tag vor Gebrauch
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Maus Anti-ED1 Antikörper	Abcam	ab31630