Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing

Summary

Lebermakrophagen, genannt Kupffer-Zellen, sind für den Einfang von zirkulierenden Nanopartikeln verantwortlich. Wir beschreiben hier eine Methode mit hoher Zellreinheit und Ausbeute zur Kupffer-Zellisolierung. Der modifizierte LDH-Assay wird hier verwendet, um die durch Kohlenstoffnanoröhren in Kupffer-Zellen induzierte Toxizität zu messen.

Abstract

Die große Mehrheit der in-vitro-Studien haben nanotoxikologische immortalisierten Zelllinien auf ihre Praxistauglichkeit verwendet. Jedoch haben Ergebnisse aus Nanopartikeln Toxizität in immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen Diskrepanzen zeigt, die die Notwendigkeit, die Verwendung von primären Zellen für in vitro-Assays zu erweitern. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Mausleber Makrophagen, Kupffer-Zellen genannt, und ihre Verwendung zur Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel verantwortlich. Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Wobei das Verfahren, bezogen auf Kollagenaseverdau und Dichte der Zentrifugation wird der von Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll angepasst. für Rattenleberzell isolatio ausgelegtn und bietet hohe Ausbeute (bis 14 x 10 ⁶ Zellen pro Maus) und hoher Reinheit (> 95%) von Kupffer-Zellen. Diese Isolierung Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder anspruchsvoll und stellt somit einen idealen Kompromiss zwischen Komplexität und Zellausbeute. Die Verwendung von schwereren Mäuse (35-45 g) die Ausbeute an dem Isolierungsverfahren, sondern erleichtert auch bemerkenswert, das Verfahren der Pfortader Kanülierung. Die Toxizität von Kohlenstoffnanoröhren f -CNTs wurde in diesem Modell durch das modifizierte LDH-Assay gemessen. Dieses Verfahren bewertet die Lebensfähigkeit der Zellen durch Messen der Mangel an struktureller Integrität Kupffer Zellmembran nach Inkubation mit f -CNTs. Toxizität von f induzierte -CNTs konsistent mit diesem Assay gemessen werden, Hervorhebung, dass isolierte Kupffer-Zellen sind für die Prüfung der Toxizität von Nanopartikeln. Das Gesamtverständnis der Nanotoxikologie können von diesen Modellen profitieren, so dass die Nanopartikel-Auswahl für die klinische Übersetzung effizient.

Introduction

Der Bereich der Toxikologie Forschung zielt auf die biologische Wirkung von Nanopartikeln zu charakterisieren. Toxikologische Untersuchungen auf Basis von in vivo Untersuchungen bleiben die genauesten Methoden. Allerdings ist ihr Einsatz durch ihre Kosten, Arbeit und Zeitaufwand ¹ beschränkt. Als Alternative, in vitro-Assays wurden aufgrund ihrer Einfachheit und der Möglichkeit der Entwicklung von Hochdurchsatz in vitro Testplattformen ² verwendet wurden - so Erweiterung der Anzahl von Bedingungen getestet. Esten nanotoxikologische Untersuchungen werden mit Hilfe von in-vitro-Assays mit immortalisierten Zelllinien. Es gibt jedoch Bedenken hinsichtlich der Extrapolation dieser experimentellen Befunde in vivo toxikologische ^3. Tatsächlich können die Eigenschaften der immortalisierten Zelllinien signifikant von Geweben sie abgeleitet wurden, zum Beispiel genetische Transformation ^4. Verschlechterung von wichtigen morphologischen Merkmale sein5, Verlust der Zellpolarität ⁶ und funktionellen Veränderungen wie die Regulierung von Entzündungsmediatoren ^7.

Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und sind in direktem Kontakt mit Blut durch Auskleiden der Wand Lebersinusoide. Als Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), sind diese Makrophagen für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel und damit verantwortlich, bilden eine sehr geeignetes Modell, um die Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. In vivo ⁸ und In-vitro-Studien ⁹ von Entzündungsreaktionen mit Kupffer-Zellen zu Nanopartikeln ausgesetzt zugeordnet wurden an anderer Stelle veröffentlicht. Kupffer-Zellen wurden ebenfalls in der Pathogenese von Lebererkrankungen wie alkoholische Leberkrankheit ^10, Leberfibrose ¹¹ oder Virushepatitis ¹² beteiligt. Es wurde berichtet, dass isolierte Kupffer-Zellen liefern nützliche Einblicke in zelluläre Mechanismen inv beschreibenLeberstörungen ^13,14 olved.

Mehrere Verfahren wurden berichtet, zu isolieren und zu reinigen, Kupffer-Zellen. Zellisolierung aus mechanischen oder enzymatischen Dissoziation ¹⁵ führen. Kollagenaseverdau zeigt den Vorteil, dass die Erhaltung der Funktionsfähigkeit der Kupffer-Zellen, während die zu hohen Kupffer Zellausbeute ^16. Viele experimentelle Ansätze unterschiedlicher Komplexität und die Kosten, sind verwendet worden, um den Kupffer-Zellen von anderen Leberzellpopulationen zu trennen. Beispielsweise kann Kupfferzelle Reinheit durch Immunoaffinitätschromatographie ^17. Strömungs Elektrophorese ^{18, 16} oder selektive Adhäsion durch die Zentrifugalkraft Techniken ^16, die Zellen auszuwählen entsprechend ihrer Größe und Dichte erreicht werden. Eine Kombination dieser Verfahren kann gewählt werden, um die Reinheit der Bevölkerung ¹⁶ zu erhöhen. Es besteht kein Konsens über die ideale Methode für die Kupffer-Zellisolierung, da sie größtenteils abhängig von der Anwendung und den verfügbaren equipment. Im Falle von Nanopartikeln Toxizitätstests, die Einfachheit und eine hohe Ausbeute der Technik mit der funktionellen Erhaltung Kupffer Zellen assoziiert ist jedoch zu dem als am besten geeignet für diese Anwendung.

Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Die Methode wurde von dem vom Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll geändert. ¹⁶ für Rattenleberzellisolierung konzipiert. Die meisten Studien berichtet und beschrieben die Isolierung von Kupffer-Zellen aus Rattenlebern. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kupffer-Zellen aus Mäuseleber isoliert, in hoher Ausbeute und Reinheit. Die Verwendung von Mäusen, vermindert die Kosten und Experiment erlaubt die Verarbeitung mehrerer Lebern, große Mengen von Kupffer-Zellen zur Nanopartikeltoxizitätstests erhalten.

Im folgenden Protokoll wurden Kupffer-Zellen mit funktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren inkubiert (f -CNTs). Die einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften von CNTs - also hohen Länge-Durchmesser-Verhältnis und eine große Oberfläche haben CNTs interessante Kandidaten als Vektoren für die Therapie und Diagnosezwecken hergestellt. Allerdings wurde die Sorge in Bezug auf die Toxizität von CNTs ^19, und die Entwicklung neuer in vitro-Tests zielt darauf ab, das Verständnis der CNT biologische Wirkung erhöht. Toxizität in Kupffer Zelle mit einem Mangel an struktureller Integrität der Zellmembran assoziiert. Dies wird durch den Verlust der zytoplasmatischen Enzyms LDH aus der Zelle in den Überstand gemessen. Das Prinzip dieses Verfahrens ist es daher, um jede freigesetzte LDH zu entfernen und zu messen, was in den Zellen ²⁰ belassen. Dies wird bevorzugt, um die Messung des freigesetzten LDH im Überstand durchgeführt, da das Vorhandensein von CNTs in dem Überstand stört den Test ^21.

Wir schlagen vor, die Verwendung dieser einfachen und kostengünstigen Kupffer Zellisolierung method zu hoher Anzahl funktioneller Kupffer-Zellen zu isolieren. Dies ermöglicht das Screening von Toxizität einer Reihe von Nanopartikeln in einem relevanten primären Makrophagenmodell.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden durchgeführt. Das Protokoll demonstriert wurde unter der Leitung und Genehmigung des britischen Innenministeriums Regelung durchgeführt

1. Perfusion and Cell Collection (Figur 1)

Abb. 1: Leberperfusion Nach Anästhesie der Maus, der Verdauungstrakt ist seitlich nach links des Bauches, um die Pfortader (PV) zugänglich zu machen bewegt. Der Istwert mit einer langsamen Flussgeschwindigkeit (1-3 ml / min) von EGTA / HBSS-Lösung und die untere Veina cava (IVC) kanüliert sofort aufgebrochen, um überschüssige Druck in der Leber zu vermeiden. Innerhalb der ersten Minute der Perfusion wird die Fließgeschwindigkeit allmählich zu 7 ml / min erhöht. Die Collagenase-Lösung wird dann bei 10 ml / min perfundiert, bis zu seiner vollständigen Verdauung erreicht wird.

1. PrepaWieder frisch alle in der Materialtabelle beschriebenen Reagenzien.
2. Warm das EGTA (Ethylenglykol-Tetra-Essigsäure) / HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Lösung (50 ml pro Maus) und die Kollagenase-Lösung (100 ml pro Maus) 30 Minuten lang bei 40 ° C.
3. Zuerst mit 70% Ethanol spülen Sie den flexiblen Pumpschlauch. Gießen Sie 40 ml EGTA / HBSS-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen im Wasserbad getaucht und spülen Sie den flexiblen Pumpschlauch mit vorgewärmter EGTA / HBSS Lösung.
4. Führen Terminal Anästhesie mit einem Barbiturat zuverlässig Bewusstlosigkeit erzeugen, bevor die Atemdepression und Tod. Injizieren Phenobarbital bei 1 mg / kg, ip in einen weiblichen oder männlichen CD1-Maus (35-45 g). Bestätigen Sie die Anästhesie durch toe Kneifen.
5. Rasieren Bauchhaare und sterilisieren die Bauchfläche mit 70% Ethanol-Lösung.
6. Messer durch die Bauchhöhle und setzen die Pfortader und Vena cava inferior durch Bewegen des Darms seitlich nach links des Bauches.
7. Start die Pumpe bei einer Geschwindigkeit von 1-3 ml / min mit EGTA / HBSS-Lösung und kanülieren die Pfortader mit einer 23 g Schmetterlingsnadel (Flügel geschnitten). Klemmen Sie den Abschnitt der Pfortader mit der 23 G-Nadel einer Kanüle versehen, und dann drehen Sie die serrefine Zange an der Oberfläche des geöffneten Mausunterleib. Die Leber sollte rasch blass innerhalb der ersten 30 sec von EGTA / HBSS-Lösung Perfusion.
8. Der untere Teil der unteren Hohlvene rasch einzuschneiden, um überschüssige Druckaufbau in der Leber vermieden, und erhöhen die Fließgeschwindigkeit allmählich zu 7 ml / min, über der ersten Minute der Perfusion. Das Tier stirbt wegen Blutungen sekundär zu Venenpunktion Vena cava.
9. Wenn weniger als 5 ml EGTA / HBSS Lösung wird in die Zentrifugenröhrchen verbleibenden, füllen Sie es mit Kollagenase-Lösung (40-50 ml). Erhöhung der Strömungsrate allmählich auf 10 ml / min, über 30 sec.
10. Stellen Sie die Leber anschwellen, indem Druck auf die untere Hohlvene, mit einer Pinzette, für 5-10 sec Intervallen. This kann in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden (5-10 mal während der Verdauung). Mit diesem Schritt wird die Leberzelle Dissoziation zu verbessern und mit Collagenase reduzieren die Durchblutung Zeit.
11. Wenn weniger als 10 ml Kollagenase-Lösung innerhalb des Zentrifugenröhrchens bleibt, gießt 40-50 ml vorgewärmtes Collagenaselösung in dem Zentrifugenröhrchen.
12. Nach 10-15 min Perfusion und etwa 70-80 ml Kollagenase-Lösung perfundiert, eine kleine Druck auf die Oberfläche der Leber mit einer Pinzette. Ein Druck des Druck zeigt an, dass Leberzellen dissoziiert.
13. Entfernen Sie die Leber aus der Bauchhöhle als ein Stück und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen mit 20-30 ml Kupffer-Zellen Isolierung Medium. Halten Sie Leberzellen auf Eis oder bei 4 ° C für einen Zeitraum von maximal 3 Stunden zu vermeiden, die Leberzelllebensfähigkeit.
14. Wiederholen Sie den Vorgang auf Perfusion mehrere Tiere, wenn nötig, während die Leber perfundiert auf Eis. Pool 1-3 Lebern für die Reinigung und fahren Sie mit Stufe 3.

2. Herstellung des Dichtegradienten für die Zentrifugation (Figur 2)

Abb. 2: Vorbereitung des Dichtegradienten Alle Vorgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der SIP wird durch Mischen von 15,3 ml von beschichteten Silicapartikel-Lösung mit 1,7 ml 10 x PBS hergestellt. Ein 5 ml SIP werden mit 15 ml PBS gemischt und 20 ml 25% SIP Lösung herzustellen. 10 ml von SIP werden mit 10 ml PBS gemischt und 20 ml 50% SIP Lösung herzustellen. Zentrifugenröhrchen, das 50% SIP-Lösung (20 ml) gekippt wird und die 25% SIP-Lösung (20 ml) wird langsam mit einer serologischen 25 ml-Pipette.

1. Fahren Sie mit den folgenden Schritten (Abschnitt 2., 3. und 5.) unter sterilen Bedingungen und halten Zellen auf Eis oder bei 4 ° C. Bereiten Sie die SIP (Lösung von Isotonische beschichteten Siliciumdioxid-Teilchen) durch Mischen von 15,3 ml von beschichteten Silicapartikel-Lösung mit 1,7 ml 10 x PBS.
Zu 20 ml 25% SIP-Lösung zu machen, mischen Sie 5 ml SIP mit 15 ml PBS. Zu 20 ml 50% SIP-Lösung zu machen, mischen 10 ml SIP mit 10 ml PBS.
2. Füllen eines Zentrifugenröhrchen mit 20 ml der 50% igen Lösung SIP. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen in einem Winkel nahe 90 ° und fügen Sie langsam die 25% SIP-Lösung (20 ml) auf der Seitenwand der Röhre mit einem 25 ml serologische Pipette, ohne Berührung der Oberfläche des 50% SIP-Schicht. Beim Hinzufügen von 25% SIP Lösung progressiv den Winkel der Röhre zu verringern. Halten Sie den Dichtegradienten auf Eis bis zum Gebrauch.

3. Kupfferzelle Reinigung (Figur 3)

Fig. 3: Reinigung von Kupffer-Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und Zelladhäsion Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. (A) Nach dem Bruch der Glisson-Kapsel, werden Leberzellen durch eine 1 gefilterten00 & mgr; m Sieb. Die Suspension wird bei 50 x g zentrifugiert, um Hepatozyten zu verwerfen (Pellets) zu sammeln und das nicht-parenchymalen Zellfraktion (Überstand). Diese Stufe wird 3 mal wiederholt. Nicht-parenchymalen Zellen auf einem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten gegeben und bei 800 · g für 15 min zentrifugiert. Kupffer-Zellen von 25% SIP Kissen gesammelt werden durch Zelladhäsion Selektion gereinigt. (B) Die Zellen werden in 24-Well-Platte ausplattiert und bei 37 ° C für 30 min inkubiert und 5% CO _2. Nicht-adhärente Zellen werden einmal mit 500 ul HBSS gewaschen. Kupffer-Zellen zeigen ihre haft Morphologie 4 Stunden nach der Plattierung, wenn f -CNTs können zu den Zellen gegeben werden. Der Maßstab entspricht 25 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Setzen Sie einen perfundierten Leber in einer Petrischale mit 15 ml Kupffer Zelle Isolierung Medium. Bruch der Glisson-Kapsel (Membran der Leber) mit einer Schere und lassen alle Leberzellen in den Kupffer-Zellisolierung Medium. Die Lösung wird, obwohl ein 100 & mgr; m Zellsieb in ein Zentrifugenröhrchen gesammelt werden. Wiederholen Sie den Vorgang auf zusätzliche Perfusion perfundierten Leber und bündeln die Zellen in der gleichen Zentrifugenröhrchen (15 ml von einer Maus, bis zu 45 ml von drei Mäusen).
2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 g für 2 min bei 4 ° C. Parenchymale Zellen (Hepatozyten) wird in dem Pellet und nicht-parenchymale Zellen (einschließlich Kupffer-Zellen) werden in dem Überstand sein.
3. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50 g für 2 min je. Wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male.
4. Zentrifuge bei 1.350 × g für 15 min pelletiert nicht-parenchymalen Zellen. Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml von Kupffer Zellen Isolierung Medium.
5. In den nicht-Parenchymzelle Lösung auf dem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten 25/50%, wie in 2.3 beschrieben. Centrifuge bei 850 × g für 15 min ohne Beschleunigung oder Pause.
6. Lokalisieren des angereicherten Kupfferzelle Fraktion innerhalb 25% SIP Fraktion in der Nähe des 25/50% SIP-Schnittstelle (Figur 3) erscheinen trüb. Mit einem 10 ml serologische Pipette absaugen etwa 12 ml der angereicherten Kupffer Zellfraktion. Übertragungszellen in ein Zentrifugenröhrchen mit 35-40 ml Kupfferzelle Isolationsmedium. Vorsichtig mischen und Zentrifugieren bei 1.350 xg für 15 min bei 4 ° C Zellen zu pelletieren.
7. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 5-10 ml vorgewärmtes Kupffer Zellkulturmedium. Count-Zellen (Hämozytometer) und messen die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau-Färbung.
8. Platte der gereinigten nicht-Parenchymzellen in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁵ Zellen / Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ (Figur 3). Nach 30 Minuten, entfernen Sie vorsichtig das Medium, waschen mit vorgewärmter Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) einmal ersetzenes mit 500 ul frisch und vorgewärmte Kupffer Zellkulturmedium (pro Vertiefung).
9. Verlassen Kupffer Zellen für mindestens 4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO ₂ vor der Behandlung mit Nanopartikeln, damit sie ihre haft Morphologie erhalten.

4. Charakterisierung

1. Kupffer-Zellen Purity
   1. Bereiten Sie frisch verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten Kupffer PBS / BSA-Lösung. Wasche die Zellen einmal mit 500 ul PBS / BSA-Lösung. Entfernen Sie die PBS / BSA-Lösung und nehmen Kupffer-Zellen in 500 ul frischem PBS / BSA-Lösung mit leichtem Kratzen. Wenn Zellen in 24-Well-Platten, kürzen Sie die Enden der Schaberklingen mit einer Schere, um das Lösen einfacher zu fahren. Übertragen Sie Zellen in der Durchflusszytometrie Röhren.
   2. Zählen Kupffer-Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Zentrifuge 1 x 10 ⁵ Zellen bei 1350 x g. Resuspendieren Kupffer-Zellen in 30 ul F4 / 80-Antikörper (unverdünnt). Gut mischen und bei Raumtemperatur für 30 min. Halten Sie die ungefärbten Zellen (nicht mit dem Antikörper) auf Eis.
   3. 2 ml PBS / BSA-Lösung in gefärbten Zellen, Zentrifuge bei 1.350 g für 5 min und entsorgen Sie die resultierende Überstand. Resuspendieren gefärbten Zellen in 200 ul PBS / BSA.
   4. Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Tor 10.000 unbefleckt Kupffer-Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und Granularität (side scatter). Analysieren Fluoreszenz gated Zellen in FL-1-Kanal.
   5. Wiederholen Sie den Vorgang für Bunt Kupffer-Zellen halten die gleichen Einstellungen für die Durchflusszytometrie-Analyse von ungefärbten Kupffer-Zellen verwendet. Auszuwählen und Quantifizierung der Fluoreszenz von gefärbten Zellen, die Reinheit Kupfferzelle beurteilen.
2. Kupffer Zelle Phagozytoseaktivität
   1. Ersetzen Medien mit 0,5% (v / v) fluoreszierenden Kügelchen in Kupffer Cell Culture Medium und Inkubation für 4 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Um nicht verinnerlicht Perlen, Zentrifuge Kupffer-Zellen bei 1350 · g, di entfernenscard den Überstand und resuspendieren Zellen in 500 ul PBS / BSA-Lösung. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male.
   3. Scrape Kupffer-Zellen in 500 ul PBS / BSA-Lösung und Transfer Zellen in ein Durchflußzytometrie Röhre.
   4. Centrifuge Kupffer-Zellen bei 1350 · g, den Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 200 ul PBS / BSA-Lösung.
   5. Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Tor 10.000 unbefleckt Kupffer-Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und Granularität (side scatter). Analysieren Fluoreszenz gated Zellen in FL-2-Kanal.

5. Die Inkubation von chemisch funktionalisierte Kohlenstoffnanoröhren (f -CNTs)

1. Bereiten Sie eine Dispersion f -CNTs (1 mg / ml) in Wasser durch Ultraschallbehandlung für 15 Minuten vor dem Gebrauch. F -CNTs werden im eigenen Haus ²² vorbereitet.
2. Bereiten 2x konzentriert f- CNTs Dispersion in Kupffer Zellkulturmedium. Beschallen f- CNTs in Medium dispergiert2 Minuten, bevor Sie mit Schritt 5.3 fortfahren).
3. Für jeden gut, ersetzen Sie 250 ul alten Medien mit 250 ul 2x f -CNTs Dispersion. Unbehandelten Vertiefungen (250 & mgr; l konditioniertes Medium + 250 & mgr; l frisches Kupffer Cell Culture Medium) und Vertiefungen, die mit 10% DMSO behandelt werden als negative und positive Kontrolle verwendet wurden.
4. Inkubieren Kupffer Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 24 oder 72 Stunden.

6. Toxizität Beurteilung f -CNTs in Kupffer-Zellen nach dem modifizierten Lactatdehydrogenase (LDH) Assay

1. Überstand verwerfen.
2. Fügen Sie 200 ul (pro Well Platte mit 24 Vertiefungen) von Lysis Buffer und bei 37 ° C für 30 min-1 Std.
3. Nach Durchführung heftiges Pipettieren, sammeln bei 40.000 xg in Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge lysiert Kupffer-Zellen für 10 Minuten, um zu pelletieren f -CNTs, die von den Zellen und der Zelltrümmer aufgenommen wurden.
4. Sammeln Sie die Überstände (ƒ-CNT frei) inReaktionsgefäße und bei -20 ° C oder fahren Sie mit Schritt 6.5).
5. Transfer 50 ul in eine Platte mit 96 Vertiefungen und dasselbe Volumen des Substrats Mix-Lösung (LDH-Kit) in jede Vertiefung. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur für 15 min vor Zugabe von 50 & mgr; l der Stopplösung (LDH-Kit). In dreifacher Ausführung von leeren Vertiefungen, die 50 & mgr; l Lysepuffer 50 ul Substrat-Mix-Lösung und 50 ul Stop-Lösung.
6. Die Absorption bei 490 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät und verwenden Sie die folgende Formel, um die (%) Zelllebensfähigkeit zu berechnen.

Results

Die Anzahl der nicht-gereinigten Parenchymzellen war konsistent und lag im Bereich zwischen 8 und 14 x 10 ⁶ Zellen pro Maus (17 Isolierungen wurden durchgeführt). Jede Maus Isolation war ausreichend, um 16 bis 28 Brunnen zu plattieren. Die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung zeigten die Zelllebensfähigkeit ~ 95%. Kupffer-Zellen zeigten eine runde Form innerhalb von 30 min Inkubation bei 37 ° C, das unvollständige adhärente Morphologie (4A) bezogen. Bei 4 h Inkubation und ansch...

Discussion

Die folgenden Schritte sind entscheidend für die hohe Ausbeute und hohe Rentabilität der Kupffer-Zellen zu erreichen. Aseptischen Bedingungen zu verwenden, um das Risiko einer bakteriellen und Pilzkontamination zu begrenzen. Alle Instrumente müssen vor Gebrauch sterilisiert werden. Reagenzien werden frisch vor der Durchführung der Isolationsverfahren hergestellt werden.

Die Wahl der Collagenase IV, mit niedrigen Trypsinaktivität, ist von entscheidender Bedeutung. Verschiedene Partien vom gle...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euthatal (Pentobarbital-Natrium)	Merial
CD1 Mäuse	Charles River	-	Das Gewicht der Maus sollte zwischen 35 und 45 g variieren. Wir empfehlen die Verwendung von männlichen CD1-Mäusen, da ihr Gewicht schnell zunimmt (z. B. eine männliche CD1-Maus im Alter von 7 Wochen wiegt mehr als 35 g). Es ist auch ratsam, sich im Voraus mit dem Tierlieferanten in Verbindung zu setzen, um die Lieferung älterer Tiere zu arrangieren. Alternativ können auch Tiere im Haus untergebracht werden, um das gewünschte Gewicht zu erreichen.
HBSS (Ca2+ und Mg2+ frei, mit Bikarbonat)	Life Technologies	14175-053	HBSS muss sein  Ca2+ kostenlos.
Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA)-Tetranatriumsalz	Sigma-Aldrich	E8145	EDTA kann auch verwendet werden, aber EGTA hat den Vorteil, dass es Ca2+ selektiv chelatisiert.
HEPES (1 M)	Life Technologies	15630-056;	100 ml
Kollagenase Typ IV	Worthington	CSL-4	Es wird empfohlen, verschiedene Chargen von Kollagenase zu testen oder zumindest dem Lieferanten gegenüber zu erwähnen, dass das Produkt für die Isolierung von Leberzellen geeignet sein muss.
Niedriger Glukose-DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (mit Natriumpyruvat und Glutamax)	Life Technologies	12633-012	500 ml
Penicillin/Steptomycin	Life Technologies	15140-122	100 ml
Fötales Rinderserum	Erster Link	60-00-850	500 ml
Trypanblau-Lösung	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Beschichtete Kieselsäurepartikellösung (Percoll)	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll® ist sehr stabil und kann mehrere Jahre gelagert werden
1x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Life Technologies	10010-023	500 ml
10x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Life Technologies	70011-036	500 ml
Dimethylsulfoxid	Fischer	D/4120/PB08	500 ml
LDH-Kit (CytoTox 96)	Promega	Nr. G1781	Vor Licht geschützt aufbewahren
DMEM phenolrot frei	Life Technologies	31053-028	500 ml
F4/80 Antikörper (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Nicht verdünnen, pur für die Durchflusszytometrie verwendet
Fluoreszierende Kügelchen	Sigma	L2778	Latexkügelchen, aminmodifiziertes Polystyrol, fluoreszierend rot. 1 ml
Name der	Materialfirma	Katalognummer	Kommentare/Beschreibung
Schmetterlingsblutentnahme-Set (23 G/305 mm langer Schlauch)	BD
Spritzenvorsatzfilter (0,22 μ m Blue Rim)	Minisart	16534-K
Zentrifugenröhrchen (50 ml blaue Kappe)	BD Biosciences, Falke	35 2070
Petrischale (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μ M-Zell-Sieb	BD	352360
Schlauchpumpe	Watson Marlow	SciQ 300	Spülen Sie die Schläuche vor und nach jedem Gebrauch mit sterilem PBS und 70 % Ethanol.
24-Well-Platten	Corning	3526
96-Well-Platten	Corning	3595
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
Plattenleser	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine Pinzette	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Kat. Nr. 221-0051	Die Serrefine-Pinzette ermöglicht es, das mit der 23 G Nadel kanülierte Gefäß zu klemmen, ohne dass die Pinzette während des Perfusionsvorgangs festgehalten werden muss. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Durchflusszytometrie-Röhrchen	BD Biosciences, Falcon
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Zellschaber	BD Biosciences, Falcon	353086	Schneiden Sie mit einer Schere die Klingenextremitäten, um Zellen in 24-Well-Platten zu schaben.
Name des Reagenzienunternehmens		Katalognummer	Kommentare/Beschreibung
EGTA (Ethylenglykoltetraessigsäure)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Lösung			HBSS mit 0,5 mM EGTA und 25 mM HEPES. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Bereiten Sie 50 ml für jede Leber vor, um sie zu perfundieren.
Kollagenase-Lösung			DMEM mit niedrigem Glukosegehalt an Kollagenase Typ IV bei 100 IE/ml, 15 mM HEPES und 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Bereiten Sie 100 ml für jede Leber vor, um zu perfundieren. Nach der Zugabe der Kollagenase wird empfohlen, die Lösung vor der Anwendung 30 Minuten lang aufzuwärmen. Dadurch kann die Kollagenase-Aktivität optimal sein.
Kupffer-Zell-Isoliermedium			RPMI enthält, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (v/v), 1% Glutamax® (v/v) und 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Bereiten Sie mindestens 100 ml für 1-3 Lebern vor.
Kupffer Zellkulturmedium			RPMI enthält 10% fötales Rinderserum, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (v/v), 1% Glutamax® (v/v) und 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Bereiten Sie mindestens 100 ml für 1-3 Lebern vor.
SIP (Lösung aus isotonisch beschichteten Kieselsäurepartikeln)			Mischen Sie 1,7 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 15,3 ml Percoll®, um 17 ml SIP zu erhalten.
25% SIP-Lösung			Mischen Sie 5 ml SIP mit 15 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung
50% SIP-Lösung			Mischen Sie 10 ml SIP mit 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung
Lysepuffer			DMEM-Medien mit 0,9 % Triton X-100
PBS/BSA-Lösung			Bereiten Sie frische phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 mit 1 % Rinderserumalbumin vor.