Die subretinale Injektion ist eine chirurgische Technik zur effektiven Genabgabe an das retinale Pigmentepithel im Mausauge. Hier beschreiben wir eine einfache und replizierbare Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in retinales Pigmentepithel bei Versuchsmäusen.
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Methodenartikel
Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Auge ist ein kleines und geschlossenes Organ, was es zu einem idealen Ziel für die Gentherapie macht. In jüngster Zeit wurden verschiedene Strategien für die Gentherapie bei Retinopathien angewendet, bei denen nicht-virale und virale Genverabreichung an die Netzhaut und das retinale Pigmentepithel (RPE) verwendet werden. Die subretinale Injektion ist der beste Ansatz, um virale Vektoren direkt an RPE-Zellen zu liefern. Vor der klinischen Erprobung einer Gentherapie ist es unumgänglich, die Wirksamkeit der Therapie in Tiermodellen verschiedener Retinopathien zu validieren. So wird die subretinale Injektion bei Mäusen zu einer grundlegenden Technik für eine okuläre Gentherapie. In diesem Protokoll stellen wir die einfache und replizierbare Technik zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in experimentelle Mäuse zur Verfügung. Diese Technik ist modifiziert von der intravitrealen Injektion, die in Augenkliniken weit verbreitet ist. Die repräsentativen Ergebnisse der RPE/Aderhaut/Skleral-Komplex-Flat-Mount werden dazu beitragen, die Wirksamkeit dieser Technik zu verstehen und das Volumen und den Titer der viralen Vektoren an das Ausmaß der Gentransduktion anzupassen.
Einleitung
In der Augenheilkunde hat die Gentherapie als Behandlungsmethode in monogenen geerbt Retinopathien entstanden. Es vererbt Retinopathien mit Genen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Leber angeborene amurosis 1,2, Retinitis pigmentosa 3 und choroideremia 4 verbunden. Das Forschungsfeld der Gentherapie erweitert in beiden präklinischen Studien und klinischen Studien unter Verwendung von viralen Vektoren, wie Adeno-assoziierte Virus (AAV), Lentiviren (LV) und Adenovirus (Ad) 5. Verschiedene virale Vektoren haben unterschiedliche Tropismus in der Netzhaut. Für eine sichere und wirksame Gentherapie, virale Vektoren sollten sorgfältig entsprechend Zielzellen und Zielgene ausgewählt werden.
Die Route der Genübertragung ist auch wichtig für eine effektive Genübertragung an Zielzellen, so sollte es sorgfältig und ausgewählt werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur intraokularen Abgabe von viralen Vektoren sind SUBRETinal Einspritzung und intravitreale Injektion 6. Letztere, intravitreale Injektion, wurde weit verbreitet für die Arzneimittelabgabe verwendet werden, um CNV in feuchten altersbedingten Makuladegeneration (AMD) und Makulaödem bei diabetischer Retinopathie 7 behandeln. Intravitreale Route bietet Exposition viraler Vektoren zu glasigen und inneren Retina, sondern die Diffusion der Vektoren äußeren Netzhaut begrenzt ist. Auf der anderen Seite stellt die subretinale Route direkte Lieferung von viralen Vektoren zum Potential Raum zwischen Retina und RPE, Induzieren einer lokalisierten Bläschen. Daher wird subretinalen Injektion momentan als ein effizienter Weg für die gezielte Photorezeptorzellen und RPE. In Bezug auf die chirurgischen Ansatz, Pars plana als einen sicheren Bereich für die intravitreale Injektion gewählt, um Netzhautschäden in menschlichen Patienten zu vermeiden. Durch einfaches Ändern dieses Konzept für Mäuse, wir könnten virale Vektoren subretinal oder intravireally via Limbus-Ansatz zu injizieren.
In diesem VideoArtikel zeigen wir eine einfache und bequeme Methode der subretinalen Injektion von viralen Vektoren in Mäuse RPE. Nach Einzelpunktion bei posterior zu Limbus mit einer 30 G 1/2 Nadel wird ein 33 G stumpfen Nadel ausgestattet Mikroliterspritze in den subretinalen Raum über den Limbus Einstichstelle eingeführt. Die viralen Vektoren 1,5-2 ul Volumen auf das Potential Raum zwischen Retina und RPE Induzieren subretinalen Bläschen injiziert. Dieser Vorgang kann unter direkter Sicht mit Operationsmikroskop durchgeführt werden. Wiederholte Praxis werden reproduzierbare Ergebnisse auch ohne direkte Visualisierung der Bläschenbildung zu gewährleisten. Dies soll dazu dienen, um eine genaue und zeitsparende Experimente zur subretinalen Gentransfer in Mäusen RPE durchzuführen.
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und die Richtlinien und Vorschriften von der Seoul National University Institutional Animal Care und Verwenden Committee und Seoul National dargelegt Universitätsklinikum Biosafety Committee.
1. Vorbereiten Injection Kit und Virale Vektoren
- Bereiten Sie die Mikroliter-Spritze mit einer 33 G stumpfen Nadel sterilisiert mit Ethylenoxid-Gas ausgestattet. Verdünnt den viralen Vektoren in PBS zur adäquaten Titer im Mikroröhre (dh 1 × 10 6 TU / ul). Spülen Sie die Spritze mehrmals mit viralen Vektoren, jede toten Raum in der Spritze zu entfernen.
2. Subretinale Injektion von viralen Vektoren
- Betäuben den erwachsenen Mäusen (dh, 6-8 Wochen alt) mit einer intraperitonealen Injektion der Mischung aus tiletamine und Zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin-Hydrochlorid (0,7 mg / kg Körpergewicht) oder eine alternative geeignete Anästhesie Regimes.
- Erweitern sich die Schüler mit einem Auge Tropfen Phenylephrin 0,5% und 0,5% Tropicamid.
- Bereiten Sie den Mikroliterspritze durch das Laden mit 1,5 bis 2 & mgr; l von viralen Vektoren.
- Öffnen Sie das Augenlid und stehen den Blick auf den Äquator zum bequemen Injektion freizulegen und sich auf unter dem Operationsmikroskop. Aufrechterhaltung der vorstehende Augenposition bis Beendigung der Injektion oder Verschiebung der Nadel während der Injektion ein. Um den Augapfel fest zu halten, legen Sie die Finger außerhalb des Augenhöhlenrand.
- Einen Tropfen Augen viskoelastische Lösung, um die Hornhautoberfläche.
- Setzen Sie einen kleinen runden Deckglas auf der Oberseite der Hornhaut, um die Netzhaut zu visualisieren.
- Stechen ein kleines Loch an leichten hinter dem Limbus mit einer sterilen Nadel 30 G 1/2 für die weitere subretinale Injektion. Machen Sie das Loch unterlegen for das rechte Auge und überlegen für das linke Auge für die Bequemlichkeit.
HINWEIS: Wenn das Loch an zeitliche oder Nasen gemacht, ist es schwer, durch das Augenlid nach der Injektion bedeckt sein. Punktion sollte etwas hinter dem Limbus, die Limbusgefäßen, die entlang des Limbus ausgeführt und kann leicht erkannt werden, zu vermeiden. Seien Sie vorsichtig, schlagen Sie das Objektiv mit Nadel und gleichzeitig die Punktion zu vermeiden. Nicht die gesamte Kegel der Nadel legen nicht auf Linsenpunktion zu vermeiden. - Legen Sie die 33 G stumpfen Nadel der Mikroliterspritze durch die Pre-Stichloch und nähern sich die Nadel in den subretinalen Raum bis zu dem Punkt, wenn mild Widerstand zu spüren ist.
HINWEIS: Bei den subretinalen Injektion, der beste Ansatz Winkel der Nadel ist etwa 45 Grad gegen Iris Ebene und die stumpfe Nadel sollte nach hinten in Richtung peripapillären Bereich geschoben werden. Gepunktete Quadrat angezeigt die vorgeschlagene Nadel Weg über den Glaskörperraum für den subretinalen injection in 1.
HINWEIS: Es wird kein Widerstand fühlte, als Piercing (oder Weitergabe) die Netzhautschichten, wie sie sind sehr weich. Somit wird das erste Gefühl einer leichten Widerstand zeigt an, dass die Nadel die RPE-Schicht bereits berührt wurde und die Einführung der Nadel gestoppt werden sollte. Achten Sie darauf, Skleragewebe mit Überdruck durchdringen, weil die Nadel in das Potenzial subretinalen Raum platziert werden. Wenn die Nadel in die Lederhautgewebe durch übermäßige Macht, tritt sie in den äußeren Augen orbitalen Bereiche ohne Widerstand. (Dieser Schritt ist kritisch)
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Subretinale Injection. H & E gefärbten Querschnitt der Maus Auge Darstellung der Strukturen mit einer Nadel Weg für den subretinalen Injektion markiert (eine gepunktete Quadrat). Vergrößerung: 40x, Maßstabsbalken: 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Injizieren Sie den viralen Vektoren (dh 1 x 10 6 TU / ul) vorsichtig in den subretinalen Raum ohne Zittern um unerwünschte Gewebeschäden zu vermeiden und vorsichtig ziehen Sie die Nadel. Halten Sie den Augapfel fest während der Injektion, wie in 2.4 beschrieben.
- Beachten Sie die Bildung von subretinalen Bläschen nach Injektion unter Operationsmikroskop, um sicherzustellen, gibt es keine Netzhautblutungen.
Abbildung 2. Subretinale Belb Formation ohne Netzhautblutungen. Mikroskopische Ansicht des subretinalen belb nach dem subretinalen Injektion unter Operationsmikroskop zeigt erfolgreiche bleb Bildung ohne Netzhautblutungen.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Schließen Sie vorsichtig das Augenlid auf die Injektionsstelle für selbstdicht decken. Bringen Sie die Maus mit nach Hause Käfig und am Leben zu erhalten, bis die Auswertung.
Hinweis: Nach dem die Forscher erhalten den Verfahren verwendet werden, können sie die wiederholbare Ergebnisse mit Schnellverfahren durch Überspringen Sie diese Schritte erhalten (2,5, 6 und 10)
3. Bewertung der Wirksamkeit von Gentransfer in Retinapigmentepithel
- Opfern die Mäuse in der CO 2 Kammer. Entkernen die Augen mit einer Schere.
- Fixieren die Augen in der 4% Paraformaldehyd-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde bis einige Tage.
- Besorgen Sie sich die Hornhaut mit feinen Pinzetten und Punktion der Hornhaut mit Mikro-Schere. Entfernen Sie die Hornhaut nach scissoring entlang des Limbus. Nehmen Sie den Objektiv mit einer Pinzette.
- Schneiden Sie die Ziliarkörper mit micro-Schere ermöglicht Netzhautablösung. Ziehen Sie die gesamte Netzhaut von der RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex. Schneiden Sie den RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex radial von der Peripherie zum Zentrum in der Nähe des Sehnervs mehrmals, um 4 bis 8 Blätter für flache Montage machen.
- Klappen Sie den RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex zu RPE Seite nach unten zu machen, und schneiden Sie die verbleibenden Gewebe an der skleralen Seite einschließlich der Muskeln, Bindehaut und Sehnerv. Dieser Schritt ist wichtig, um eine flache RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex zu machen, weil der verbleibende Gewebe macht die komplexe uneben.
- Inkubieren Sie die Anlage mit primären und sekundären Antikörpers für Ihre spezielle Forschungszwecke (optional, siehe die Referenzen für detaillierte Methoden). Flach montieren RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplexe auf dem Objektträger und absorbieren die PBS mit einem saugfähigen Schwamm.
- In 30 ul Montagelösung und legen Sie das Deckglas. Beachten Sie die Probe für die Wirksamkeit von Vektor-Lieferung unter Fluoreszenzmikroskop. Bewahren Sie die Proben inder Kühlschrank zur weiteren Beobachtung.
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Ergebnisse
Um die Wirksamkeit der subretinalen Injektion auf virale Gen-Transduktion durch dieses Protokoll zu bewerten, haben wir im Handel erhältlich LV Vektoren mit CMV-Promotors exprimieren, sowohl GFP und RFP für den Indikator. Augen wurden nach der jeweiligen Zeitperiode nach dem Forschungszweck ausgeschält. Für die repräsentative Ergebnisse wurden die Augen 10 Wochen und 20 Wochen nach der subretinalen Injektion enukleiert. Nach vollständiger Entfernung der Netzhaut mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Wohnung Ber...
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Diskussion
In diesem Video-Artikel beschrieben wir die Limbus-Ansatz subretinalen Injektionstechnik im Detail mit den repräsentativen Ergebnissen der RPE / Aderhaut / Lederhaut Flachmontage. Dies ist eine einfache und bequeme Technik zum subretinalen Injektion von viralen Vektoren in RPE. Direkte Visualisierung bleb Bildung während der Injektion ist ein wichtiger Schritt für die pünktliche Lieferung für die Anfänger. Es gibt einige subretinalen Injektionstechniken in Blatt eingeführt of Visualized Experiments 8-10. Subr...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde von der Seoul National University Research Grant (800-20140542) unterstützt, der Pioneer Research Program der NRF / MEST (2012-0009544) und die Bio-Signalanalyse-Technologie-Innovations-Programm der NRF / MEST (2009-0090895), und die Gewährung von NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PINZETTE DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Schere F/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt Nadel | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Spritze, 10 Mikroliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | Für einfache Einhandinjektion |
| 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Nadel | BD | 305107 | Initialpunktion für subretinale |
| Injektion Mikroskop-Deckglas (Nr. 1 3 mm Durchmesser) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica Operationsmikroskop | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein Mikroskop | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO. LV-Ctr | Zur Verdünnung von Vektoren |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Zur Verdünnung |
| Vektoren Troperin (Phenylephrin 0,5% - Tropicamid 0,5%) | Hanmi | Zur Dilatation | |
| Proparacainhydrochlorid Ophthalmische Lösung USP, 0,5% (steril) | Bausch& Lomb | Für topische Anästhesie | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (Tiletin Hypochlorid und Zolazepam Hypochlorid) | Virbac | Für die Allgemeinanästhesie | |
| Rompun Injektion (Xylazin HCl) | Bayer | Für die Vollnarkose |
Referenzen
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