Das Studium von Proteinfunktionen und die Rolle der Altered Protein Expression von Antikörper-Interferenz und Dreidimensionale Rekonstruktionen

Zusammenfassung

Die Kontrolle der Proteinexpression ist nicht nur für jeden lebenden Organismus unerlässlich, sondern auch eine wichtige Strategie, um Proteinfunktionen in zellulären Modellen zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll zeigt die Anwendung von Antikörperinterferenzen in Säugetierzellen, einschließlich primärer Hippocampus-Neuronen, und demonstriert die Verwendung dreidimensionaler Rekonstruktionen bei der Untersuchung der Proteinfunktion.

Zusammenfassung

Eine strenge Verwaltung der Proteinexpression ist nicht nur wichtig für jeden Organismus am Leben, sondern auch eine wichtige Strategie Proteinfunktionen in Zellmodellen zu untersuchen. Daher erfunden neuere Forschung verschiedene Werkzeuge Proteinexpression in Säugetierzelllinien oder Tiermodellen, einschließlich RNA und Antikörper Interferenz abzuzielen. Während die erste Strategie viel Aufmerksamkeit in den letzten zwei Jahrzehnten gesammelt hat, Peptide, die eine Translokation von Antikörper Cargos durch Zellmembranen und in Zellen vermitteln, erhalten viel weniger Interesse. In dieser Publikation stellen wir ein detailliertes Protokoll, wie ein Peptidträger namens Chariot in humanen embryonalen Nierenzellen sowie in primären Neuronen im Hippocampus zu nutzen, um Antikörper Interferenzexperimente durchführen und weiter die Anwendung von dreidimensionalen Rekonstruktionen bei der Analyse von Protein-Funktion veranschaulichen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Chariot ist, wahrscheinlich aufgrund seiner Kernlokalisationssignal, particularly gut geeignet Proteine ​​im soma und den Kern mit Wohnsitz Ziel. Bemerkenswert ist, wenn Chariot zu primären Hippokampus-Kulturen anwenden, wandte sich das Reagenz überraschend gut aus von dissoziierten Neuronen in Kauf genommen werden.

Einleitung

Eine strenge Kontrolle der Proteinexpression ist für jeden lebenden Organismus seine eigene Entwicklung als auch zu befehlen, als auf Umweltsignale zu reagieren. Daher wurde eine Vielzahl von Mechanismen erfunden während der Evolution genau das Expressionsniveau jedes von dem App kodierten Proteins regulieren. 20.000 Gene in jeder eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt ihres Lebens existiert. Es findet in den verschiedenen Phasen der Proteinproduktion reichen die Regulationsmechanismen aus dem Management der Chromatinstruktur, Transkription und RNA auf die Richtung der posttranslationalen Proteinmodifikationen Handhabung, Transport und Abbau.

Es ist daher nicht verwunderlich, dass Störungen in der zugrunde liegenden molekularen Maschinerien und veränderten Proteinexpressionsniveaus haben mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs oder geistiger Behinderung in Verbindung gebracht worden. Tatsächlich an der herausragenden Komplexität der neuronalen Entwicklung und Säugetier-Gehirn-Funktion suchen, die Sensivität dieser hochentwickelten Systemen zu Veränderungen in der Proteinexpression manifestiert sich in einer Reihe von bekannten intellektuellen Defiziten einschließlich Alzheimer und Parkinson-Krankheit (AD und PD) sowie Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) wie das Fragile-X-Syndrom (FXS). Letztere Krankheit wird durch eine umfangreiche misexpression einer Vielzahl von Proteinen aus, die auf den Verlust eines einzelnen Übersetzungsregel Protein, FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) ^1-4 zurückzuführen ist. Darüber hinaus X - chromosomale Protein A Chromosomenaberrationen , die Variable Ladung zu beeinflussen (VCXA), ein Protein, das mRNA durch Modifizierung der mRNA - Stabilität und Translation verwaltet ⁵ Capping, haben vor kurzem mit geistigen Defiziten in Verbindung gebracht worden, während Punktmutationen bei Patienten mit kognitiven Behinderungen wurden nicht identifiziert ab sofort ^{6, 7,} was darauf hindeutet , dass die beobachteten psychischen Beeinträchtigungen von veränderten VCXA Ausdruck und dysregulated Ausdruck seiner Ziel Prote stammenins. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen einer Studie untersucht , ob De - novo - Kopienzahl Variationen von Genen , die mit ASD verbunden sind , festgestellt , dass neuartige Genduplikationen und Streichungen sind ein bedeutender Risikofaktor für ASD ^8, also die Idee unterstützen , dass eine erhöhte oder verminderte Proteinexpressionsniveaus führen kann intellektuelle Defizite.

Neuere Forschungen weiterer Beweis bereitgestellt bemerkenswert, dass das Expressionsniveau eines gegebenen Proteins genau seine Aggregation als Folge der hohen Proteinmengen nahezu ohne Sicherheitsabstände eingestellt ⁹ zu verhindern. Es wurde daher vorgeschlagen , dass auch kleine Inkremente ausreichen ⁹ Krankheiten wie AD und PD zu induzieren. Obwohl die Vielzahl von molekularen Maschinen zur Proteinexpressionskontrolle beiträgt eine komplexe Regelung schlägt Schema in Anbetracht dieser Feststellungen wurde eine Studie zur Untersuchung der Expression von mehr als 5.000 Säugetiergenen ¹⁰ Untersuchung gezeigt , dassNatur bevorzugt , ein sparsameres Schema: Die zelluläre Fülle von Proteinen wurde überwiegend auf der Ebene der ¹⁰ Übersetzung geregelt gezeigt werden, was zeigt , dass das Management von RNA Verfügbarkeit dient in erster Linie der Proteinexpression zur Feinabstimmung.

Untersuchung der Dosis von Proteinen von Interesse (POI), ist daher nicht nur wichtig für das Verständnis der endogene Funktionen eines Proteins, sondern auch auf die Untersuchung vieler Krankheiten und der Entwicklung von Therapien. So haben im vergangenen Jahrzehnten den Fortschritt von mehreren Strategien gesehen RNA-Interferenz mit POI Dosierung zu manipulieren. Obwohl RNA - Interferenz stark Proteinfunktion zu untersuchen verwendet wird und auch in klinischen Studien angewandt wird Krebs oder Augenerkrankungen sowie zu verfolgen antivirale Therapien bei Patienten ^11-13, einige Schwierigkeiten auftreten können , zu behandeln , die die Strategie unmöglich machen könnten. Beispielsweise die Samen-Sequenz, die den Zuschlags durch Homologie antreibt, ist comparakurze ble, damit die Förderung der Off-Target-Effekte. Da hocheffiziente Sequenzen selten und müssen unter Tausenden von Optionen ( beschrieben in ^14), die Identifizierung der richtigen Reihenfolge gefunden werden kann zeitraubend und kostspielig sein, führt aber immer noch enttäuschend sein kann.

Eine alternative Strategie ist, um direkt die POI durch Antikörper zielen. Hier zeigen wir die Verwendung des Proteinträger Chariot (hergestellt von Active Motif) zelluläre Protein Verfügbarkeit zu reduzieren, und der Einsatz von dreidimensionalen Rekonstruktionen folgende Proteinfunktion knock-down zu studieren.

Das aktive Motiv des Chariot, selbst ein 2,8 kDa Peptid, wird Shuttle Peptide, Proteine ​​und Antikörper durch Membranen von Säugetierzellen ¹⁵ verwendet. Die Peptid assoziiert mit POIs durch Bildung nicht-kovalent gekoppelt makromolekularer Komplexe verwendet hydrophobe Wechselwirkungen, woraufhin Chariot-POI-Komplexe werden in Zellen in einer Endosomen-ind internalisiertependent Weise. Beeinflussen weder die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen pendelte wichtiger ist , wurde Chariot zu deutet, noch zytotoxischen Wirkungen auszuüben oder die biologische Aktivität von seiner Ladung ¹⁵ zu beeinflussen.

Protokoll

1. Stammlösungen

1. Resuspendieren des lyophilisierten aktiven Motiv Pulver in sterilem H ₂ O auf eine Endkonzentration von 2 ug / ul. Tippen Sie vorsichtig zum Mischen.
2. Bereiten Sie kleine Teilmengen ( zum Beispiel 12 & mgr; l jeweils 2 ul pro Reaktion benötigt werden) und speichern sie bei -20 ° C.

2. Herstellung von Zellen

1. Seed Säugerzellen wie HEK293-Zellen oder primären Neuronen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen in 500 & mgr; l Wachstumsmedium mit Antibiotika.
   HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, die Zellen bei geringer Dichte Saatgut und verwenden Sie nur die beiden mittleren Reihen der 24-Well-Platte. Jede Vertiefung wird also ein leeres Gegenstück, das Medium während der Inkubation (Schritt 4.2) zu beherbergen. Wenn Neuronen Handhabung, immer darauf achten, dass die Zellen nicht außerhalb des Inkubators gehalten länger als ein paar Minuten.
2. Kultur die Zellen bei geeigneten Bedingungen (befeuchteten, 5% CO ₂ und 37 ° C) , bis die Zellen app sind. 50%konfluent.
   HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, Kultur die Zellen, bis die gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist und App ändern. 25-50% des Mediums zweimal pro Woche. Medium: Neurobasal Medium (enthaltend 1x B27, 5 mM L-Glutamin und 1x Penicillin und Streptomycin; Vergleichen mit ref 16).

3. Chariot Komplexbildung

1. Pro Reaktion, 0,1-2 ug des POI oder den entsprechenden Antikörper sowie das Kontrollprotein oder Kontrollantikörper, die jeweils in 50 ul PBS verdünnen.
   HINWEIS: Die Technik arbeitet auch mit makromolekularen Komplexen , bestehend aus Vor-gebundenen primären und sekundären Antikörpern (cp 'Repräsentative Ergebnisse', Fig . 1). Mix und Spin.
2. Für jede Probe verdünnen 2 ul Chariot Stammlösung in 50 ul PBS mit getrennten Röhren, um die Selbstassoziation von Chariot zu vermeiden. Mix und Spin.
3. Übertragen Sie die verdünnte POI oder Antikörper (Schritt 3.1) an die Chariot Verdünnung durch pipettierenting. Mix und Spin.
4. Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur (Chariot-POI-Komplexe bilden).

4. Transfektion von Zellen

1. Verdünnen Sie die Chariot-Komplexe (Schritt 3.4) in 100 & mgr; l vorgewärmten Wachstumsmedium (37 ° C, ohne Zusätze). Entfernen Sie das Medium und waschen Sie einmal die Zellen vorgewärmt 1x PBS.
   HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, sollten Sie das Medium nicht zu verwerfen, wird es wieder verwendet werden. Halten Sie es bei 37 ° C. Zum Waschen verwenden PBS , das 0,5 mM MgCl ₂ und CaCl _2.
   Vorschlag: halten das Medium in leeren Brunnen, während die Platte Inkubation (Schritt 4.5).
2. Tragen Sie die Chariot-Komplex-Lösung (Schritt 4.1) zu den Zellen und die Zellen schaukeln sanft eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu gewährleisten. Wachsen die Zellen unter Standardbedingungen (Schritt 2.2) für 1 Stunde. Hinzufügen Serum bis zu einer Endkonzentration von 10%. Wenn Neuronen verwenden, fügen Sie das Medium aus Schritt 4.1. Wachsen die Zellen für 1 bis 2 weitere Stunden.
   Beachten Sie dasZeit optimale Inkubationszeit hängt von der Größe und den Eigenschaften der Ladung und müssen empirisch eingestellt werden. Die folgenden Vorschläge können als Richtlinie dienen: Für Peptide, 1 h in der Regel ausreichend ist, die für Proteine ​​1-2 Stunden empfohlen werden, für Antikörper 2 h und für die Transfektion von Neuronen mit Antikörpern 4 Stunden.
3. Prozess Zellen für die Analyse wie üblich. Bitte beachten Sie: die Technik, mit Experimenten ist kompatibel mit Fixierung Protokolle sowie Live-Bildgebung.

5. Imaging

1. Mit Hilfe eines Laser-Scanning-Mikroskop, nehmen Sie z-Stapeln von Zellen und / oder Zellräumen von Interesse etwa 0,25-0,5 & mgr; m Abstand verwenden. Die genaue Schichtabstand hängt von der Größe der Struktur rekonstruiert werden und muss individuell bestimmt werden.

6. Wiederaufbau

1. In den folgenden Schritten, verwenden Sie die Esc Boden mehrere Objekte zwischen Auswahl und Navigation, Cntr zu wechseln auswählen, indem Sie on sie und Shift-Taste zu schneiden Objekte (vgl. Schritt 6.10).
2. Öffnen Sie die LSM-Datei in Imaris.
3. Mit der Display-Einstellung für jeden Kanal, Kontrast das Bild, bis die hellsten Strukturen Sättigung erreichen. Bitte beachten Sie, dass diese Einstellung die Oberflächenkonstruktion nicht beeinflussen, ist es nur der Experimentator zu unterstützen dient das Bild in Schwellwertbildung.
4. Klicken Sie auf das Hinzufügen neuer Oberflächen-Symbol. Ein Assistent wird geöffnet.
5. Wählen Sie: Segment nur eine Region of Interest. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt.
6. Passen Sie die Ränder der Auswahlbox Ihr Objekt von Interesse zu passen. Bitte beachten Sie, dass das Bild 3 Dimensionen hat und dass die Auswahl muss auch in der z-Ebene eingestellt werden. Wenn die rechteckige Form der Auswahlbox nicht das Objekt von Interesse richtig passen sollte, schalten Sie das Objekt und / oder das Feld vergrößern, bis alle erforderlichen Strukturen eingebettet sind. Unerwünschte Objekte können später entfernt werden (vgl. Schritt 6.10). Vorgehen.
7. Wählen Sie die entsprechende channel. Die Fläche Detailebene oder Kugeldurchmesser sollten die Strukturen werden rekonstruiert übereinstimmen eingestellt werden. In Abhängigkeit von den Signaleigenschaften, entweder absolute Intensität oder Local Contrast verwendet werden. Im Allgemeinen arbeitet Lokaler Kontrast besser für diffuse Signale. In jedem Fall müssen die Einstellungen für jedes Signal oder interessierende Struktur separat eingestellt werden, respectively.
8. Mit dem Thresholding Werkzeug, rekonstruieren die Struktur von Interesse.
9. Füllen Sie die Rekonstruktion, indem Sie auf den grünen Pfeil unten klicken.
10. Stellen Sie das Objekt weiter von dem Stift-Werkzeug Oberflächen zu schneiden und zu entfernen, wie erforderlich. Es ist nur möglich, in Nord-Süd-Richtung zu schneiden, also kippen das Bild, um das gewünschte Objekt zu schneiden.
11. Erhalten Messungen von Volumen, Fläche und Intensitäten für jede Fläche durch die Auswahl Statistiken, detaillierten Statistiken und Durchschnittswerte.
12. (Optional Schritt) farbcodierte Statistiken zu beobachten (vgl. Abbildung 2E und F), wählen Sie die Registerkarte Farbe der entsprechenden Oberfläche und markieren Sie "Statistik Coded" anstelle von "Base". Mehrere Optionen werden angezeigt.

Ergebnisse

In den folgenden Abschnitten wird eine funktionale Zuschlags eines POI exemplarische Ergebnisse (Simiate, für weitere Details siehe bitte ^{16, 17)} darstellt , unter Verwendung von Chariot Reagenz und Antikörper Interferenz präsentiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass verminderte Expression von Simiate Transkriptionsaktivität beeinträchtigt, und in einer dosisabhängige Weise, induziert Apoptose, die ihren Höhepunkt in Mortalitätsraten von über 99%, wenn höhere Antikörper-Mengen (> 1 ...

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll die Bedeutung von Protein-Expressionsniveaus in Kontrolle zellulärer Funktionen in einer Dosis angetrieben Weise zu studieren. Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine Feinabstimmung Manipulation der Proteinexpression in verschiedenen Säugetierzelltypen, einschließlich Hippocampusneuronen, damit detaillierte Studien der Proteinfunktion auf zellulärer Ebene zu erleichtern.

Obwohl die RNA - Interferenz eine bekannte Strategie POIs repräsentiert herunterregulier...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chariot	Active Motif	30025	bei -20 > C
Neurobasales Medium	Lebenstechnologien	21103-049	erwärmen sich auf 37 > C vor der Verwendung von
1x B27		Life-Technologien 17504044	bei -20 & Grad lagern; C
L-Glutamin	Life Technologies	25030-149	lagern bei -20 ° C
Penicillin und Streptomycin	Life technologies	15140-122	lagern bei -20 ° C
Imaris Software	Bitplane	n.a.teur,	aber unübertroffen
Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	n.a.