Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Zusammenfassung

Wir demonstrieren die Herstellung, Kalibrierung und Eigenschaften von zwei Arten von ionenselektiven Mikroelektroden (doppelläufig und konzentrisch) zur Messung von Ionenkonzentrationen im Hirngewebe. Diese werden dann in der Präparation von Hippocampus-Schnitten der Maus verwendet, um zu zeigen, dass die exzitatorische Aktivität sowohl die extrazelluläre Kalium- als auch die Natriumkonzentration verändert.

Zusammenfassung

Die elektrische Aktivität im Gehirn wird von signifikanten Ionenflüssen durch die Membranen begleitet, was zu komplexen Änderungen in der extrazellulären Konzentration aller wichtigen Ionen führt. Da diese Ionenverschiebungen signifikante funktionelle Konsequenzen haben, ist ihre quantitative Bestimmung oft erforderlich, um die Funktion und Dysfunktion neuronaler Netzwerke unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu verstehen. In der vorliegenden Studie demonstrieren wir die Herstellung und Kalibrierung von doppelläufigen ionenselektiven Mikroelektroden, die sich als hervorragende Werkzeuge für solche Messungen im Hirngewebe erwiesen haben. Darüber hinaus werden auch sogenannte "konzentrische" ionenselektive Mikroelektroden beschrieben, die aufgrund ihres unterschiedlichen Designs eine weitaus bessere zeitliche Auflösung von schnellen Ionenänderungen bieten. Anschließend zeigen wir, wie diese Elektroden in akuten Hirnschnittpräparationen des Hippocampus der Maus eingesetzt werden können. Mit Hilfe von doppelläufigen, kaliumselektiven Mikroelektroden werden Veränderungen der extrazellulären Kaliumkonzentration ([K⁺]_o) als Reaktion auf exogene Applikation von Glutamatrezeptoragonisten oder während der epileptiformen Aktivität nachgewiesen. Darüber hinaus veranschaulichen wir die Reaktionseigenschaften von natriumempfindlichen, doppelläufigen und konzentrischen Elektroden und vergleichen deren Detektion von Veränderungen der extrazellulären Natriumkonzentration ([Na⁺]_o), die durch Bad- oder Druckanwendung von Medikamenten hervorgerufen werden. Diese Messungen zeigen, dass die Ansprechamplituden zwar ähnlich sind, die konzentrischen Natrium-Mikroelektroden jedoch im Vergleich zum doppelläufigen Design ein überlegenes Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Ansprechzeit aufweisen. Im Allgemeinen lassen sich die demonstrierten Verfahren leicht auf die Messung anderer Ionenspezies, einschließlich pH oder Kalzium, übertragen und auch auf andere Präparate anwenden.

Einleitung

Die elektrische Signalübertragung im Gehirn basiert auf dem Fluss von Ionen durch Plasmamembranen. Wichtige Ionenbewegungen in und aus dem extrazellulären Raum werden nicht nur durch die Passage durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle vermittelt, sondern auch durch postsynaptische ionotrope Rezeptoren sowie Ionentransporter. Die neuronale Aktivität geht also mit komplexen Veränderungen der extrazellulären Konzentration aller wichtigen Ionen ^{einher 1}. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass der Einstrom von Natrium in Neuronen während der exzitatorischen Aktivität zu einer Abnahme der extrazellulären Natriumkonzentration ([Na⁺]_o) ^{führt 2}. Gleiches gilt für die extrazelluläre Calciumkonzentration, da Calciumionen schnell sowohl in prä- als auch in postsynaptische Strukturen eindringen ³. Gleichzeitig bewegt sich Kalium in die entgegengesetzte Richtung, was zu einem Anstieg der extrazellulären Kaliumkonzentration ([K⁺]_o) im niedrigen mM-Bereich ^{führt 4,5}. Die synaptische Aktivität verursacht auch Veränderungen des extrazellulären pH-Werts, die teilweise durch begleitende Gliamembranflüsse gemildert werden, die den intraglialen pH-Wert ^{von 6,7} verändern. Diese aktivitätsbedingten Veränderungen der extrazellulären Ionenkonzentrationen haben signifikante funktionelle Konsequenzen. Zum Beispiel depolarisieren selbst kleine Erhöhungen von [K⁺]_o Neuronen sowie Gliazellen, wodurch die neuronale Erregbarkeit verändert wird, und es gibt mehrere Mechanismen, um überschüssiges Kalium ⁸ zu entfernen. Ein Versagen dieser kann zu einer epileptiformen Aktivität von Neuronen oder zu Phänomenen wie der Ausbreitung von Depressionen ^{führen 1}.

Aufgrund ihrer kritischen Bedeutung ist die quantitative Bestimmung der extrazellulären Ionenkonzentrationen oft notwendig und erforderlich, um die Funktion und Dysfunktion neuronaler Netzwerke unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu verstehen. Seit Jahrzehnten haben sich doppelläufige ionenselektive Mikroelektroden als hervorragende Werkzeuge für solche Messungen im Hirngewebe erwiesen ⁹. Für viele Ionen stehen hochspezifische Sensoren mit geringer Kreuzreaktivität für andere Ionen zur Verfügung. Neben den klassischen doppelläufigen Elektroden wurden vor kurzem sogenannte konzentrische Elektroden eingeführt. Letztere bieten eine überlegene Zeitauflösung, erfordern jedoch etwas mehr Zeit und Mühe, um ¹⁰ zu erstellen.

Im Folgenden beschreiben wir die Vorbereitung und Kalibrierung dieser beiden Arten von ionenselektiven Mikroelektroden. Anschließend zeigen wir, wie diese Elektroden in Hirnschnittpräparaten eingesetzt werden können, um Veränderungen in [K⁺]_o oder [Na⁺]_o zu messen, die durch exzitatorische Aktivität induziert werden, indem wir verschiedenen Stimulationsparadigmen folgen, einschließlich Bad- und Druckanwendung von Medikamenten.

Protokoll

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland, sowie der europäischen Richtlinie der Gemeinschaft des Rates (86/609 / EWG) durchgeführt. (: O52 / 05 institutionellen Akt Nummer) Alle Experimente wurden von der Tierschutzbüro der Animal Care und Verwenden der Einrichtung der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland mitgeteilt und genehmigt. In Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz (Tierschutzgesetz, Artikel 4 und 7), keine formale zusätzliche Zulassung für die post-mortem Entfernung von Hirngewebe war notwendig.

1. Herstellung der doppelläufigen ionenselektive Mikroelektroden

1. Bereiten zwei Borosilikatglas Kapillaren mit Filamenten, eine mit einer Länge von 7,5 cm und einem Außendurchmesser von 1,5 mm für den ionensensitiven Trommel eine mit einer Länge von 6,5 cm und einem Außendurchmesser von 1,0 mm für die später verwendet werden, und Referenz Barrel.
2. Reinigen Sie die capil laries in Aceton für 12 Stunden und dann spülen Sie mehrmals mit abs. Ethanol und trocknen lassen. Elektroden können nun in einem Exsikkator gelagert werden.
3. Verwenden Sie Zwei-Komponenten-Kleber oder einen kleinen Streifen aus Aluminiumfolie zusammen an beiden Enden fix eine lange und eine kurze Kapillare. Erhitzen des Doppel Kapillare in einem Ofen bei 60 ° C für 1 Stunde. Dies beschleunigt die Aushärtung. Bewahren Sie die Elektroden nun in einem Exsikkator.
4. Zentrieren Sie den Doppel Kapillare in einer vertikalen Abzieher mit einer drehbaren Spannfutter. Erhitzen Sie die Spule vorsichtig, bis das Glas weich genug ist, um eine horizontale Drehung des drehbaren Spannfutter 180 ° zu ermöglichen. Während dieses Schritts zu vermeiden Dehnung der Kapillare mit Keil unter dem Spannfutter.
5. Nach dem Abkühlen, entfernen Sie die mechanische Pause und tragen Sie eine zweite Heizung-Protokoll, um die Kapillare herausziehen, was zu zwei scharfen, doppelläufige Kapillaren (Abbildung 1). Der Spitzendurchmesser von einem zwei Kapillare sollte möglichst nahe bei 1 & mgr; m sein.

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Abbildung 1. Architektur von ionenselektiven Mikroelektroden. (A) Fotographie einer doppelläufigen Mikroelektrode. Zum Zwecke der Veranschaulichung und bessere Sichtbarkeit wurde die Flüssigkeit innerhalb der Referenz barrel getönt. (B) Fotografie eines konzentrischen Mikroelektrode und dem entsprechenden Referenzelektrode. Die Spitze der konzentrischen Mikroelektrode ist an seinem linken vergrößert dargestellt. In (A) und (B), ist der Raum, durch den Ionensensor in den Spitzen der Pipetten besetzte Stelle farben. An der Unterseite ist die Spitze Anordnung der beiden Elektrodentypen schematisch dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

6. Wenn eine vertikale Abzieher mit drehbaren Spannfutter nicht verfügbar ist, bereiten eine doppelläufige Ionen Selective Mikroelektroden in einer horizontalen Abzieher mit Theta Glas.
   1. Zu diesem Zweck ziehen Theta Glas (Außendurchmesser von 1,5 mm, Länge 7,5 cm) aus, um in zwei Elektroden mit je zwei Fässer führen. Einer von ihnen Mark als zukünftige Referenz Barrel zu dienen. Silanisiert der andere ähnlich dem nachstehend beschriebenen, die als zukünftige ionenselektiven Faß dienen Verfahren.
      HINWEIS: Während der Vorbereitung der doppelläufigen theta-Glaselektroden ist viel einfacher als die Herstellung von verdrillten Doppelnamen Elektroden, sind sie anfälliger für Querwirkung zwischen den beiden Fässern die dünne Trennglaswand zwischen ihnen neigt poröser sein ihr Möglichstes Spitze.
      Hinweis: Da der Sensor-Cocktail (siehe unten) hydrophob ist, muß die innere Oberfläche des späteren ionensensitiven Trommel durch ein Verfahren namens Silanisierung hydrophobierter werden ebenso. Hierzu wird Hexamethyldisilazan (HMDS) verwendet (Figur 2), wie im nächsten Schritt beschrieben.

Abbildung 2. Die Silanisierung von Pipetten. (A) Hexamethyldisilazan (HMDS) reagiert mit den Si-OH Gruppen der inneren Glasoberfläche und macht sie hydrophob. (B) Das linke Bild zeigt die gesamte Silanisierung Einheit. Eine Weithalsflasche mit HMDS wird oben auf einer Heizplatte bei 40 ° C eingestellt war. Am oberen Ende der Flasche ist eine Halterung (PH), die die Kapillaren (Cap) angebracht ist. Die rechte Bild zeigt eine Vergrößerung der Pipettenhalter (PH), die die Kapillaren (Cap). (C) schematische Seitenansicht der maßgeschneiderte Pipettenhalter (PH) für die Doppelnamen (links) oder konzentrisch (rechts) Kapillaren (Cap) für ein Weithalsflasche montiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.

7. Kurz vor puFüllung Elektroden, füllen Sie ca. 20 ml HMDS in ein Weithalsflasche. Achtung: HMDS ist ausschließlich zur Verwendung in einer Abzugshaube, sind Dämpfe gesundheitsschädlich! Verschließen Sie die Flasche und legen Sie sie auf eine Heizplatte, voreingestellt auf 40 ° C. Heizen Sie einen Ofen, unter der Motorhaube platziert sowie, bis zu 200 ° C.
8. Füllen Sie die Referenz Barrel bis zu seiner Spitze mit destilliertem Wasser auf seine Silanisierung während des folgenden Verfahrens zu verhindern.
9. Setzen doppelläufige Kapillare mit seiner Spitze bis auf eine spezielle, maßgeschneiderte Halter (2B, 2C). Das stumpfe Ende offen ist frei durch den Boden des Halters (2C, links) zu erreichen. Danach legen Sie diese Halterung auf den breiten Mund Flasche, die die vorgewärmten HMDS für 70 min.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass HMDS Dampf kann durch die Kapillaren frei fließen. Während einer Silanisierung Prozess, haben die 20 ml HMDS nicht vollständig zu verdampfen, und die Flasche kann somit mehrfach verwendet werden.
10. Nach Wards, übertragen Sie die Kapillaren mit einem Metallständer und in den vorgeheizten Ofen für zwei Stunden. Dies wird beide Läufe trocknen.
11. Nach der Silanisierung, halten Sie die Kapillaren bis zur Verwendung trocken. Während erstere Verfahren erfordert etwa 3,5 Stunden, insgesamt Elektroden kann nun in einem Exsikkator für mehrere Wochen gelagert werden.
12. Am Tag ihrer experimentellen Gebrauch vorbereitet ionenselektiven Elektroden, indem die Spitze des silanisierten Lauf mit 1-2 ul des ionenselektiven Sensor (1A). Für Kalium sensitiven Mikroelektroden, verwenden Sie die Träger Valinomycin; und auf Natrium-sensitiven Mikroelektroden, verwenden ETH 157 als Träger.
13. Beachten Sie, dass die ionenselektive Sensor ist ziemlich viskos macht es schwierig für die Spitze, um richtig zu füllen.
14. Füllen Sie den Referenzlauf mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (siehe unten).
    HINWEIS: Während andere, einfachere isoosmotisch Kochsalzlösung könnte auch verwendet werden, bevorzugen wir eine Kochsalzlösung verwenden, deren Zusammensetzung im wesentlichen ähnlich istdie Perfusion Kochsalzlösung (ACSF, siehe 3.6.), denn es kann austreten und während der Experimente durchdringen in das Gewebe. Daher ist es auch wichtig, dass dieses Salzlösung enthält nicht eine höhere Konzentration des Ions als die ACSF verwendet bestimmen.
15. Hinterfüllen des Sensors mit Kochsalzlösung, die eine hohe Konzentration des Ions nachzuweisenden enthält. So verfüllen den Sensor mit 100 mM NaCl Salzlösung (für Natrium-sensitive Mikroelektroden) oder 100 mM KCl (Kaliumsensitiven Mikroelektroden). Achten Sie darauf, zusätzliche Luftblasen während dieser Prozedur einfügen.
16. Wenn die Silanisierung erfolgreich war und der Sensor richtig gefüllt, beobachten die Sensoroberfläche bilden einen deutlich sichtbaren konkave Fläche gegen die Hinterfüllung (1A). Andernfalls kann der Sensor von der Kapillarwand zurückgezogen sind und die Spitze wird nicht ausgefüllt werden. Solche Elektroden werden nicht funktionsfähig sein.
17. Legen chlorierten Silberdrähte in die beiden Läufe (Vorsicht die sen nicht zu berührensor) und Dichtung jedes Fass mit Dentalwachs (Abbildung 1A).

2. Herstellung von Concentric ionenselektive Mikroelektroden

1. Für die Außentrommel, verwenden dünnwandigen Glaskapillaren mit Glühlampen (Außendurchmesser 2,0 mm) und einer Länge von 7,5 cm. Für die innere Trommel, nehmen dünnwandiger Kapillaren mit Filament, einen Außendurchmesser von 1,2 mm und einer Länge von 10 cm.
2. Reinigen Sie die Kapillaren in Aceton für 12 Stunden. und dann mehrmals gründlich mit abs. Ethanol und trocknen lassen. Elektroden können nun in einem Exsikkator gelagert werden.
3. Füllen Sie ca. 20 ml HMDS in ein Weithalsflasche. VORSICHT! HMDS ist ausschließlich zur Verwendung in einer Abzugshaube, sind Dämpfe gesundheitsschädlich. Verschließen Sie die Flasche und legen Sie sie auf eine Heizplatte, voreingestellt auf 40 ° C. Heizen Sie einen Ofen, unter der Motorhaube platziert sowie, bis zu 200 ° C.
4. Stecken Sie den 2,0 mm Kapillare in einer horizontalen Abzieher und ziehen Sie sie in Kapillaren mit Kurzkegel und einem Spitzendurch führenter von ~ 4 & mgr; m (1B).
5. Setzen herausgezogene 2,0 mm Kapillare mit seiner Spitze bis auf ein Maß, spezielle Halterung (2B, 2C), so dass seine stumpfen Ende öffnet, um den Hohlraum der Flasche (2C, rechts). Danach legen Sie diese Halterung auf den breiten Mund Flasche, die die vorgewärmten HMDS für 70 min. Stellen Sie sicher, dass HMDS Dampf kann durch alle Kapillaren fließt.
6. Anschließend übertragen Sie die Kapillaren mit einem Metallständer und in den vorgeheizten Ofen für zwei Stunden.
7. Nach der Silanisierung, halten Sie die Kapillaren bis zur Verwendung trocken. Während erstere Verfahren erfordert etwa 3,5 Stunden, insgesamt nun die Elektroden in einem Exsikkator speichern für mehrere Wochen.
8. Unmittelbar vor Gebrauch, füllen Sie eine kleine Menge des Sensors (0,2 ul) in die silanisierten Kapillare (1B).
9. Um die innere Kapillare vorzubereiten, legen Sie eine Kapillare mit kleinem Durchmesser in den Abzieher und ziehen Sie, um in beiden führenKapillaren mit langen Verjüngungen und scharfen Spitzen (1B). Füllen Sie mit 100 mM NaCl (Natriumsensitiven Mikroelektroden) oder 100 mM KCl (Kaliumsensitiven Mikroelektroden) Kochsalzlösung.
10. Legen Sie den Sensor gefüllt und die Kochsalzlösung gefüllte Kapillare direkt in einer Linie zueinander auf eine benutzerdefinierte Build-Stopper von Deckgläsern hergestellt. Stecken Sie den kleineren Kapillare einen kurzen Weg in die größere Kapillare.
11. Befestigen Sie die Kapillaren auf ein anderes Deckglas mit Modelliermasse, übertragen auf die Bühne eines Mikroskops und visualisieren mit 100-facher Vergrößerung. Mit Hilfe eines Glasstabes, der auf einem Mikromanipulator und durch Drehen der Feinantrieb der Objekttisch des Mikroskops angebracht ist, langsam die äußere Kapillare Fortschritt gegenüber der inneren Kapillare, bis der Abstand zwischen den Spitzen ist ungefähr 5 um (1B).
12. Befestigen Sie das offene Ende des äußeren Kapillare auf die innere Kapillare mit Dentalwachs. Alternativ geben Sie eine kleine Tropfen Cyanacrylat (Crazy Glue) Instead von Wachs.
    HINWEIS: Die Zugabe einer kleinen Wassertropfen wird der Klebstoff zu polymerisieren und zu beheben, die Elektroden an Ort und Stelle. Legen Sie eine chlorierten Silberdraht in den inneren Zylinder und verschließen Sie diese mit Dentalwachs (1B).
13. Um die Referenzelektrode vorbereiten, nehmen Sie eine 7,5 cm lange Kapillare mit Faden und einen Außendurchmesser von 1,5 mm, und ziehen Sie mit einer vertikalen Magnet. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen sind relativ lang, aber nicht zu scharf (Spitzendurchmesser ~ 1 & mgr; m).
14. Entsorgen Sie die obere Pipette, öffnen Sie die untere Klemmvorrichtung und heben Sie den unteren Pipetten von etwa 5 mm. Schließen Sie das Spannfutter wieder und heben Sie sie, bis die Spitze der unteren Elektrode ist etwa 5 mm über der Heizspirale angeordnet. Erhitzen Sie die Spule und Verwenden einer Pinzette, um die Spitze von etwa 45 ° zur Seite biegen. Lower Pipette ca. 1-2 mm. Biegung erneut um etwa 45 ° um die Spitze wieder parallel direkt an die Hauptwelle (1B). Dieses Verfahren ist notwendig, um die enge Positionierung der Spitze des refere FreigabeNCE-Elektrode mit dem konzentrischen Elektroden.
15. Füllen Sie den Referenzlauf mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (siehe unten), legen Sie eine chlorierten Silberdraht und verschließen Sie das Fass mit Dentalwachs (1B).

3. Salines

1. Bereiten Kochsalzlösung zur Hinterfüllung von Kalium sensitiven Elektroden (siehe 1.15.) Von 100 mM KCl zusammen. Kochsalzlösung zur Hinterfüllung von Natrium- sensitiven Elektroden ist aus 100 mM NaCl besteht.
2. Vorbereitung Salzlösung zur Verfüllung von Referenz Barrel (. HEPES-gepufferte Salzlösung, siehe 1.16) aus (in mM) besteht aus: 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl _{2, 2} MgSO _4, 1,25 NaH _{2 PO 4} und 25 HEPES, titriert mit NaOH in einem pH-Wert von 7,4 ergeben.
3. Vorbereitung Salzlösung zur Kalibrierung von kaliumselektiven Elektroden sind aus 25 mM HEPES besteht und insgesamt 150 mM NaCl und KCl, pH-Wert auf 7,4 mit NMDG-OH (N-Methyl-D-glucamin) eingestellt. Hier wurde die Kalibrierung mit salines, der 1, 2, 4 oder 10 mM durchgeführt wirdKCl; ACSF enthielt 2,5 mM KCl (Abbildung 5).
4. Bereiten Kochsalzlösung für die Kalibrierung von Natrium-sensitive Elektroden wie folgt; (in mm) 25 HEPES, 3 KCl, insgesamt 160 NaCl und NMDG-Cl, pH-Wert mit NMDG-OH auf 7,4 eingestellt. Führen Sie die Kalibrierung mit Kochsalzlösung (in mm) 70, 100, 130 oder 160 NaCl; ACSF enthielt 152 NaCl (Abbildung 6).
5. Zur Bestimmung der Kreuzreaktion des Sensors durch andere Ionen, z. B. pH, bereiten zusätzliche Kalibrierung salines mit festen Ionenkonzentrationen, aber unterschiedlichem pH.
   HINWEIS: Während dieses Verfahren nicht in der vorliegenden Studie gezeigt hat, sollten Sie in früheren Arbeiten Bewältigung dieses Problems (zB ^11,12) beziehen.
6. Vorbereitung akuter Hirngewebeschnitten in Salzlösung besteht aus (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _{2, 6} MgCl _2, 1,25 NaH _{2 PO 4,} 26 _NaHCO 3, und 20 Glucose, mit 95% O _{2 und 5} eingeblasen _% CO 2, was zu einem pH-Wert von7.4.
7. Experimente durchführen in Hirnschnitten in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) bestehend aus (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl _{2, 1} MgCl _2, 1,25 NaH _{2 PO 4,} 26 _NaHCO 3, und 20 Glucose, 95 geperlt _% O 2 und 5% CO 2, was in einem pH von 7,4.
8. Zur Stimulation von Neuronen und Gliazellen, die Lösungen, die 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 mM Glutamat oder 10 mM L-Aspartat in ACSF gelöst. Für Druckanwendung, lösen sich 10 mM Glutamat in HEPES-gepufferte Kochsalzlösung.
9. Bereiten Auftragspipette für Druckanwendung. Legen dünnwandigen Glaskapillaren mit Glühlampen (Außendurchmesser 2,0 mm) und einer Länge von 7,5 cm in horizontale Abzieher und ziehen Sie, um in einem Spitzendurchmesser von ~ 1 & mgr; M führen.
10. Für die Induktion der epileptiforme Aktivität, bereiten magnesiumfreien ACSF, das 10 & mgr; M Bicucullin methiodide.
11. Um die Erzeugung von Aktionspotentialen zu hemmen, bereiten eine 10 mM Stamm solutIonen von Tetrodotoxin (TTX) in destilliertem Wasser. Während der Versuche wird TTX direkt dem ACSF zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5 & mgr; M ergeben.
12. Zur Aktivierung von AMPA-Rezeptoren zu verhindern, bereiten eine 50 mM Stammlösung von Cyano-nitrochinoxalin-dion (CNQX) in Dimethylsulfoxid (DMSO). Während der Versuche wird diese direkt dem ACSF zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 & mgr; M ergeben.
13. Zur Aktivierung von NMDA-Rezeptoren blockieren, bereiten eine 50 mM Stammlösung von Amino-phosphonopentanoate (APV) in 70 mM NaHCO _3. Während der Versuche wird diese direkt dem ACSF zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 & mgr; M ergeben.

4. Kalibrierung von ionenselektiven Mikroelektroden

1. Kalibrieren ionenselektive Mikroelektroden unmittelbar vor und nach jedem Experiment.
2. Bringen Elektroden Mikromanipulatoren und fügen Sie sie in eine ACSF durchbluteten Versuchskammer, unter einem Stereomikroskop gelegt (Abbildung 3 g> 4). Legen Sie die Referenzelektrode in die Vorkammer (4A, B). Schalter auf Badperfusion, sicherzustellen, dass die Strömung etwa 2 ml / min.

Abbildung 3. Die experimentelle Arbeitsbereich. Die Aufnahme rig besteht aus einem schwingungsgedämpften Tisch Tragen der x / y-Translationsstufe mit dem experimentellen Bad, den Mikromanipulatoren und einem Stereomikroskop mit hochwertiger Optik. Das Stereomikroskop ist auch mit einer CCD-Kamera zur Dokumentation ausgestattet. Darüber hinaus ist ein Druckauftragseinrichtung für Brennarzneimittelanwendung verwendet wird. Die Aufzeichnungselektroden werden über die Kopfstufe mit einem Differenzverstärker verbunden ist. Die digitalisierten Daten (A / D-Wandler) mit einem Computer aufgezeichnet. Das Bad-Perfusion durch eine peristaltische Mikropumpe realisiert (nicht gezeigt).> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Schalten Sie den A / D-Wandler, der Differenzverstärker, und dem Computer, und starten Sie die Aufnahme-Software (Abbildung 3, 4). Weil Widerstand der ionensensitiven Barrel ist sehr hoch (10-20 G & Omega; siehe unten), mit einem speziellen Elektrometer-Verstärker mit hoher Eingangsimpedanz (R _in = 10 Tw) und einen kleinen Ruhestrom _(I bias = 50 fA - 1 pA).

Abbildung 4. Elektronische und Raumgestaltung der Versuchsanordnung. (A) Schematische Darstellung der Aufnahmeanordnung. Die Spitzen einer doppelläufigen Mikroelektrode (blau) und einem konzentrischen Mikroelektrode (rot) sind in einem experimentellen Bad mit Kochsalzlösung gefüllt angeordnet. Das Bad Referenzelektrode schematisch angedeutet. Die poten TiAl durch die ionenselektive Barrel _(V 1) des elektrischen Feldpotentials (V _ref) und der Ionenpotential (V _ion) zusammen detektiert, während der Referenz Barrel _(V 2) nur V _ref zu detektieren. Bis V _Ionen zu isolieren, wird V _ref aus V _{1 mit Hilfe} eines Differenzverstärkers (DA) subtrahiert. (B) Topographie des Versuchsstadium mit einer konzentrischen Mikroelektrode an Ort und Stelle. Das Zentrum des experimentellen Phase besteht aus dem experimentellen Bad mit der Schnittpräparat. Um das Bad Boden wird der Referenz Badelektrode in der Vorkammer, die auch Gastgeber der Perfusion Einlass unter Wasser. Die Bühne selbst wird von einem separaten Erdungsanschluss geerdet. Die konzentrische Mikroelektrode und dessen Bezugselektrode werden durch separate Pipettenhalter durch Mikromanipulatoren angetrieben durchgeführt. Mikroelektrode und Referenzelektrode werden elektronisch an die Kopfstufe des Verstärkers gekoppelt ist.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Verbinden chlorierten Silberdrähte mit den entsprechenden Eingängen der Kopfstufe des Differenzverstärkers (4). Bestimmen Sie Elektrodenwiderstände. Sicherzustellen, dass der Widerstand des Referenz Lauf zwischen 30-100 MOhm und dem Widerstand des ionensensitiven Trommel zwischen 10-20 GOhm.
5. Passen Sie Spannungssignale auf Null zurück und starten Sie die Aufnahme.
6. Man beachte, dass die durch die ionenselektive Barrel _(V 1) des elektrischen Feldpotentials (V _ref) zusammengesetzt ist und der Ionenpotential (V _ion) erfaßten Potential, während die Bezugs Barrel _(V 2) nur V _ref zu detektieren. Bis V _Ionen zu isolieren, wird V _ref aus V _{1 mit Hilfe} eines Differenzverstärkers (DA) (4A) subtrahiert.
7. Nach Erhalt einer stabilen Basislinie,Schalter Kalibrierungs salines enthaltenden definierten Konzentrationen des Ions zu messen.
   HINWEIS: 5A zeigt die Kalibrierung eines doppelläufigen Kalium-sensitive Mikroelektrode. In 6A, die Kalibrierung sowohl eine doppelläufige sowie eine konzentrische Na ⁺ -sensitiven Mikroelektrode gezeigt. Während wir nicht beschreiben das Verfahren zu beachten, dass mögliche Störungen durch andere Ionen muss vor der Verwendung einer spezifischen Ionophor getestet werden (siehe auch 3.4.).

Figur 5. Kalibrierung des doppelläufigen kaliumselektive Mikroelektroden. (A) Änderung der Spannung des Referenzzylinders (V _ref) und ^der K + -Potential (V _{K +)} in Reaktion auf Änderungen in dem Bad K ^{+ -Konzentration} ( [K ^+] _b), wie angegeben. (B) Halb-logarithmic Grundstück von [K ^+] _b gegenüber _{K +} V. Eine lineare Handlung der Daten zeigt eine Neigung von etwa 56 mV. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

8. Bestimmen die Spannungsantwort der ionenselektiven Trommel in Reaktion auf eine bekannte Änderung der Ionenkonzentration. Plot Daten in einer einzigen logarithmischer Auftragung (5B, 6B) und bestimmen den Hang. Ein idealer Sensor folgt einer durch die Nernst-Gleichung beschriebene Beziehung (siehe zB ^13):

V: Messelektrodenpotential;
V _0: Standardelektrodenpotential, zB für eine AgCl-Draht bei einer Temperatur von 298,15 K und einem Druck von 101,325 Teil kPa (absolut)
R: Gaskonstante (8,314 Joule / Kelvin / mol)
T: absolute Temperatur (in Kelvin)
z: Ladung des Ions (+ 1 für Kalium und Natrium)
F: Faraday-Konstante (96,500 Coulomb)
c ': extrazellulären Ionenkonzentration
c '': intrazellulären Ionenkonzentration

Aus praktischen Gründen und dem natürlichen Logarithmus an die Nernst-Steilheit s, die dann für ein gegebenes Ion und Temperatur umgerechnet:

HINWEIS: Für die Kalium- und Natriumelektroden weist eine ideale Spannungsantwort des Sensors somit eine lineare Neigung von etwa -58 mV bei RT. Eine gewisse Abweichung von dieser genehmigt werden können (Abbildung 5b, 6b). Es ist jedoch wesentlich, dass die Reaktion Eigenschaften einer Elektrode nicht wesentlich verändern (um mehr als 10%, siehe unten), vor und nach dem Experiment.

Abbildung 6. Kalibrierung von Natrium-selektiven Mikroelektroden und der Vergleich der doppelläufigen mit konzentrischen Elektroden (A) Top verfolgt:. Änderung der Spannung der Referenz Barrel _(V ref) einer doppelläufigen Elektrode (schwarz gepunktete Linie) und eine konzentrische Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in dem Bad Na ⁺ Konzentration ([Na ^+] _b), wie angegeben. Beachten, dass die Spannungsantworten beider Elektroden sind nahezu identisch. Bottom Spuren: Änderungen in der Spannung der ^Na + -Potential (V _{Na +)} einer doppelläufigen Elektrode (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in [Na ^+] _b. (B) Half-logarithmischen Graphen der [Na ^+] _b gegenüber dem V _{Na +} beider Elektroden. Linearen Plots der Daten zeigen eine Neigung von etwa 48 mV für beide Elektroden.(C) Reaktion des V _{Na +} aus einer doppelläufigen (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) zu einer schnellen Änderung der [Na ^+] _b von 152 mm bis 70 mm. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend schneller. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

9. Bestimmung der Reaktionszeit der Elektroden, die auf dem Spitzendurchmesser abhängig ist, die Form der Spitze als auch von der Dicke der Sensorphase in der Elektrodenspitze.
   HINWEIS: In dieser experimentellen Einrichtung und Anwendung eines schnellen Wechsel zwischen verschiedenen Perfusion Salines (Austausch an der Spitze der Elektrode innerhalb von 500 ms abgeschlossen), doppelläufige natriumsempfindlicher Mikroelektroden erreicht ein stabiles Potential innerhalb von 9,7 ± 4,5 s, wennUmschalten von 152 mM bis 70 mM [Na ^+] (n = 6). Innerhalb der gleichen Einstellung erreicht konzentrischen Natriumempfindlichen Mikroelektroden ein stabiles Potential innerhalb 0,8 ± 0,3 Sekunden (n = 6) (Figur 6C). Dies unterstreicht die überlegene Zeitauflösung von konzentrischen, im Vergleich zu doppelläufige Mikroelektroden.

5. Präparation der Gewebe

1. Für die Erzeugung von akuten Scheiben, betäuben Mäuse der postnatale Tage 16-20 _mit CO 2 und schnell enthauptet (im Anschluss an die Empfehlung der Europäischen Kommission veröffentlicht in: Euthanasie von Versuchstieren, Luxemburg: Amt für amtliche Veröffentlichungen der Europäischen Gemeinschaften, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Bereiten hippokampalen Gewebeschnitt (Dicke 250 & mgr; m), nach einem Standardverfahren (siehe zB ^14).

6. Experimentelle Verfahren

1. Bringen Sie ein Stück in die Versuchskammer und befestigen Sie sie mit einerRaster.
2. Senken die kalibrierte ionenselektive Mikroelektroden auf der Scheibenoberfläche und aufspießen das Stratum radiatum der CA1-Region bis zu einer Tiefe von etwa 50 um mit der Elektrode.
   HINWEIS: Berühren der Scheibenoberfläche mit der Mikroelektrode führt zu charakteristischen Schwankungen der ionensensitiven Trommel. Ferner wird während impalement des Gewebes Schäden an Zellen verursacht Schwankungen als auch. Warten Sie, bis Ausgangswert stabilisiert hat.
3. Für Druckanwendung von Sender-Agonisten, füllen Sie eine Anwendung Pipette mit Verbindung (zB 0,5 mM Glutamat). Befestigen Sie die Pipette auf einem Mikromanipulator und koppeln sie mit einem Druckauftragseinrichtung.
4. Niedrigere Auftragspipette in das Gewebe und sorgfältig legen Sie sie in der Nähe der Spitze der ionenselektiven Mikroelektroden (~ 20-40 & mgr; m). Startdruck-Anwendung (beispielsweise 10 sec, 40 mbar) und Plattenspannung ändert, wie durch die ionenselektive Mikroelektroden überwacht.
5. Für Bad Anwendung von Medikamenten, swJuckreiz zwischen verschiedenen Perfusion salines für eine definierte Laufzeit.
6. Um das Experiment zu beenden, ziehen Sie vorsichtig die ionenselektiven Mikroelektroden aus dem Gewebe und notieren Sie jede Drift in Potentiale von der Original-Null-Wert, der bei längerer Aufnahmeperioden stattgefunden haben könnte.
7. Entfernen Schnittpräparat aus dem Bad, und führen eine zweite Eichung des ionenselektive Mikroelektroden.
   Hinweis: Dies ist notwendig, da die Elektrodenspitze während der Bewegung durch das Gewebe verstopft. Somit ist es wichtig sicherzustellen, dass die Elektrode noch richtig reagiert auf Änderungen der Ionenkonzentrationen. Die Experimente sollten abgelehnt werden, wenn die Antwort der Elektrode zu einem zehnfachen Änderung der Ionenkonzentration um mehr als 10% gesunken. Wohlarbeitselektroden können prinzipiell in mehreren Experimenten wiederverwendet werden. Dies gilt insbesondere für die konzentrischen Elektroden, die noch andauern kann für mehrere Tage. Es ist jedoch wesentlich, dass die Kalibrierungsverfahren sind Wiederwiederholt vor und nach jedem einzelnen Experiment, das ordnungsgemäße Funktionieren der Elektroden zu gewährleisten.

7. Datenanalyse

1. Um die Spannungsantwort der ionenselektiven Elektrode, um Änderungen in der extrazellulären Ionenkonzentration umzuwandeln, umwandeln Gleichung 2, um die Potentialänderung & Delta; V _ion (mV) wie folgt (für K ⁺ -sensitiven Elektroden hier gezeigt zu bestimmen, gilt analoges Verfahren für ^Na + -sensitive Elektroden):

V _{K +:} Änderungen in dem Potential der Valinomycin Trommel (mV)

s: Nernst-Steilheit

K ^+] _B: Basis Konzentration von Kalium (in unserem Fall 2,5 mM ^K +)

K ^+] _o: Veränderungen in der [K ^+] _o während des Experiments

2. Berechnen Sie das arithmetische Mittel der Steigungen aus den Einzel logarithmische Plots abgeleitet of die Kalibrierung vor und nach dem Experiment (siehe Abbildung 5b, 6b, siehe Punkt 4.8), um "s" abrufen.
3. Um Änderungen der [K ^+] _o (Δ [K ^+] _o, in mm), neu anordnen Gleichung 3 zu berechnen:

Ergebnisse

Zur Überwachung von [K ^+] _o und Veränderungen darin im Ansprechen auf exzitatorische Aktivität, eine doppelläufige kaliumselektive Mikroelektroden wurden in das Stratum radiatum von CA1-Bereich eingefügt. Wenige Minuten nach impalement, die ionenselektive Lauf der Elektrode erreicht eine stabile Basislinie (7A), entsprechend einer [K ^+] _o von etwa 2,8 mm, einen Wert nahe dem [K ^+] des ACSF verwendet ( 2,5 mm). Badanwendung von 0,5 mM Glutamat für 10 sec induzierte eine reversible Zunahme von [K ^+] _o von etwa 4 mm, gefolgt von einer Unterschreitung unter den Ausgangswert in Höhe von ~ 0,7 mM (Abbildung 7A). Absenken der Glutamatkonzentration auf 0,4, 0,3 und 0,2 mM verursacht eine entsprechende Verringerung der Amplitude von sowohl dem vorübergehenden Anstieg und dem Unter in [K ^+] _o (7A).

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Figur 7. Die extrazelluläre Kalium Transienten in Reaktion auf exzitatorische Aktivität. (A) [K ^+] _o Transienten, bestehend aus einem Anstieg, gefolgt von einer Unterschreitung unter den Ausgangswert von Badanwendung verschiedener Konzentrationen von Glutamat für 10 sec induziert, wie angegeben. (B) Einfluss einer Perfusion mit Glutamat-Rezeptor-Blocker (CNQX, 100 & mgr; M; APV, 100 & mgr; M) und Tetrodotoxin (TTX; 0,5 & mgr; M) auf [K ^+] _o Transienten von Bad Applikation von 0,5 mM Glutamat für 10 Sekunden ausgelöst. (C) Spontane [K ^+] _o Transienten in Gegenwart von 0 mg ²⁺ / BIC. Experimente in der AC gezeigt, wurden unter Verwendung von doppelläufigen Elektroden. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (SW 20) geglättet. Bitte click hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Frühere Experimente haben gezeigt, dass solche Glutamat induzierte [K ^+] _o-Signale werden nicht signifikant während der Anwendung der TTX verändert und sind damit weitestgehend unabhängig von der Öffnung der spannungsgesteuerten Natriumkanäle und neuronalen Aktionspotential Generation ^15,16. Die Mechanismen, die die beobachteten [K ^+] _o Veränderungen als Reaktion auf Glutamat zu untersuchen, verwendeten wir Glutamatrezeptor-Blocker, nämlich CNQX (100 uM; Blocker der AMPA-Rezeptoren) und APV (100 uM; Blocker des NMDA-Rezeptoren) in der Gegenwart von TTX (0,5 uM). Nach Badperfusion mit diesen Blocker, Glutamat induzierte [K ^+] _o Veränderungen waren praktisch abgeschafft, was bestätigt, ihre Abhängigkeit von der Eröffnung des ionotropen Glutamat-Rezeptor-Kanäle wie zuvor berichtet (zB ^17; 7B).

Um weiter zu zeigen ter Relevanz der glutamatergen Anregung für die Erzeugung von extrazellulären [K ^+] Signale wurden die Schnitte mit nominal ^Mg 2+ -freien Salzlösung, die 10 & mgr; M Bicucullin Methiodid (0 mg ²⁺ / BIC) perfundiert. Dies entlastet spannungsabhängigen ^Mg 2+ -block von NMDA-Rezeptoren und dämpft die Hemmung durch GABA _{A -Rezeptoren} blockiert, was spontan rezidivierende epileptiforme Aktivität in dem Netzwerk (zB ^18,19). Wie erwartet ^20, spontan, wiederkehrend [K ^+] _o Transienten, in Höhe von etwa 1,5 mm wurden in 0mg ²⁺ / BIC Kochsalzlösung (7C) nachgewiesen. Zwischen diesen Antworten kleinere [K ^+] _o Transienten mit einer mittleren Amplitude von etwa 0,2 mm eingetreten ist (7C).

In einem zweiten Satz von Experimenten wurden [Na ^+] -empfindliche Mikroelektroden [Na ^+] _o Änderungen durch die Anwendung der evozierten bestimmenGlutamat Agonisten. Hier haben wir auch im Vergleich das Ansprechverhalten doppelläufige und konzentrische Mikroelektroden, die zwei unterschiedliche Anwendungsparadigmen. [Na ^+] -empfindliche Mikroelektroden wurden in das Stratum radiatum in einer Tiefe von etwa 50 um angeordnet. Nachdem eine stabile Basislinie erreicht war, wurde die Glutamat-Agonisten L-Aspartat pro Badperfusion (10 mM, 120 sec, Badperfusion bei 2,5 ml / min) aufgetragen. Wie zuvor ²¹ beobachtet, die Anwendung von Aspartat verursacht eine langsame Abnahme der [Na ^+] _o von etwa 15 mm, was etwa 5 Minuten dauert, und dann gestartet, um wieder auf die Grundlinie zurückzugewinnen (8A). Bemerkenswert ist, während die Spitzenamplituden und Kinetik der [Na ^+] _O-Signale von beiden Elektroden bestimmt waren unter diesen Bedingungen praktisch identisch zeigte konzentrischen Elektroden eine stabilere Basislinie und einen geringeren Geräuschpegel (8A).

Um das zu testen r esponse Merkmale der verschiedenen Elektroden unter einer schnelleren Anwendungs ​​Paradigma wir druckbeaufschlagten Glutamat durch einen feinen Glaspipette im Stratum radiatum positioniert in einem Abstand von 20-40 & mgr; m von der Spitze des ionenselektive Mikroelektroden. Wie erwartet ^21. Applikation von Glutamat (10 mM) für 200 ms verursacht einen Abfall in der [Na ^+] _o (8B). Die Spitzenamplituden der [Na ^+] _o Rückgang waren im gleichen Bereich für beide Arten von Elektroden (doppelläufige: 4,5-13,5 mM, n = 14; konzentrische: 2,0-19,1 mM, n = 15). Doch im Gegensatz zu den mit langsamen Badperfusion (siehe oben), nicht nur das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, sondern auch der zeitliche Verlauf der [Na ^+] _O-Signale von den beiden Arten von Elektroden erfasst erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich signifikant. Die durchschnittliche Zeit bis zum Peak betrug 3,5 sec für die doppelläufige und nur 1,3 Sekunden für den konzentrischen Mikroelektroden.

ve_content "> Somit zeigen diese Ergebnisse zu bestätigen und die schnellere Reaktion Kinetik konzentrischen vs. doppelläufige Na ⁺ -selektiven Mikroelektroden (vgl 6C und 8B), als auch für Ca ^{2+ und} pH merkt selektive Gegen ¹⁰ . Im Gegensatz zu der früheren Studie, in der Kurz platzen synaptischen Stimulation durchgeführt, um schnell synaptisch induzierte Ionen Transienten hervorzurufen, gab es nur eine Tendenz, aber keinen signifikanten Unterschied in der mittleren Spitzenamplituden zwischen konzentrischen und doppelläufige Elektroden mit unseren Anwendungs Paradigma. Dies war wahrscheinlich auf die Tatsache, dass der Abstand des Angriffs Pipette von der Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode um einen Faktor von zwei (20-40 & mgr; m) variiert wird, und folglich, dass die maximale Glutamatkonzentration im Zielbereich war nicht die gleiche in verschiedenen Experimenten, behindern eine vorhandene Differenz der Spitzenamplituden.

(A) Top Spuren: Wechsel im voltage der Referenz Barrel (V _ref) einer doppelläufigen Elektrode (schwarze gestrichelte Linie) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in dem Bad Na ⁺ Konzentration ([Na ^+] _b), wie angegeben. Beachten, dass die Spannungsantworten beider Elektroden sind nahezu identisch. Bottom Spuren: Änderungen in der Spannung der ^Na + -Potential (V _{Na +)} einer doppelläufigen Elektrode (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in [Na ^+] _b. (B) Half-logarithmischen Graphen der [Na ^+] _b gegenüber dem V _{Na +} beider Elektroden. Linearen Plots der Daten zeigen eine Neigung von etwa 48 mV für beide Elektroden. (C) Reaktion des V _{Na +} aus einer doppelläufigen (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) zu einer schnellen Änderung der [Na ^+] _b von 152 mm bis 70 mm. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend faster. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter geglättet (Breite 20).

Abbildung 8: Die extrazelluläre Natrium-Transienten, wie durch Doppelnamen und konzentrischen Elektroden erfasst.
(A) Vorübergehende Änderungen im _V ref und [Na ^+] _o nach Bad Perfusion mit 10 mM Aspartat 120 Sekunden, wie durch den Balken angezeigt induziert. Die oberen Spuren zeigen eine Aufnahme mit einer doppelläufigen Elektrode durchgeführt, wurden die unteren Spuren unter Verwendung einer konzentrischen Elektrode erfasst. (B) Vorübergehende Änderungen im _V ref und [Na ^+] _o durch lokale Druckanwendung mit 10 mM Glutamat für 0,2 s induziert, wie durch den Pfeil angedeutet. Die oberen Spuren zeigen eine Aufnahme mit einer doppelläufigen Elektrode durchgeführt, wurden die unteren Spuren unter Verwendung einer konzentrischen Elektrode erfasst.Gepunktete rote Linien stellen linearen Anpassungen der Zeitraum zwischen dem Beginn des Signals auf seine maximale. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend schneller unter dieser Bedingung. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Flüssigträgergestützter, ionenselektiven Elektroden sind seit Jahrzehnten erfolgreich und für viele Ionen eingesetzt werden, sind hochspezifische Sensoren erhältlich ^22-26. Wenn sie in den extrazellulären Raum (ECS) des Wirbeltiergehirns Zubereitungen verwendet werden, muss man im Hinterkopf behalten jedoch, daß dies eine sehr invasive Technik: Während die Breite des ECS beträgt nur etwa 20-50 nm, der Durchmesser der ionenselektiven Mikroelektroden ist etwa 1 um (doppelläufige Elektroden) oder größer (konzentrischen Elektroden). Die Spitzen der ionenselektive Mikroelektroden wird das Gewebe während ihrer impalement des Gewebes also nicht nur zerstört, sondern vergrößern auch den ECS, wodurch ein Unterschätzung der Ionen Transienten. Trotz dieser Gefahren sind extrazelluläre Ionen Transienten in Reaktion auf die neuronale Aktivität bemerkenswert konsistent zwischen verschiedenen Labors ^7,8, zur Bestätigung der Zuverlässigkeit dieses Verfahrens.

Die Leistung und die Eignung von ionenselektiven Elektrodenist abhängig von der Empfindlichkeit und Selektivität, die mit dem Sensor-Cocktail ("Flüssigmembran Ionophor ') verwendet definiert ist. Sensor Cocktails enthalten eine spezielle Trägermolekül, zum Beispiel Valinomycin für K ⁺ -selektiven Mikroelektroden, die eine hohe Selektivität für Kalium ²⁷ aufweist. Trotzdem können bei Kreuzreaktivität mit anderen Ionen sind und getestet werden müssen. Valinomycin eine signifikante Kreuzreaktivität für Ammonium, die bei der Interpretation Ergebnisse werden muss (zB ^11,12). Da ferner die Spannungsantwort der Ionophoren folgt einer Nernst-Verhalten (siehe Gleichung 1), das Signal-zu-Rausch-Verhältnisses und des Schwellenwertes abhängig von der Konzentration des Ions zu messen. So, während kleine [K ^+] _o Transienten wecken große Spannungsänderungen gegenüber dem niedrigen Ausgangswert [K ^+] _o, klein [Na ^+] _o Transienten sind sehr viel schwieriger, gegen die hallo erkennengh Basis [Na ^+] _o (siehe Figur 5 und 6).

Die Leistung von ionenselektiven Elektroden ist auch durch die zeitliche Auflösung, die im Wesentlichen durch seine elektrische Zeitkonstante geregelt bestimmt. Letzteres wird vor allem durch den axialen Widerstand des Sensors ermittelt und durch die verteilte Kapazität entlang der Länge der Pipette zwischen ihren internen Lösungen und des externen Fluids. In der doppelläufigen Konfiguration ist der Widerstand hoch ist, aufgrund der langen Spalte verfüllt Ionensensor. Für eine gegebene isolierendes Dielektrikum (in diesem Fall Borosilikatglas), wird die Kapazität durch die Dicke des Dielektrikums bestimmt. In doppelläufige Elektroden beträgt die dielektrische Breite an der Glaswand der Pipette. Das Glas dünner in der Nähe der Spitze, fällt die dielektrische Breite und die Kapazität ansteigt. Diese Faktoren kombinieren, um Elektroden mit Reaktionszeiten, die von einigen hundert Millisekunden bis zu mehreren nahrungsmittelSekunden, da diese Faktoren variiert.

Ein Hauptvorteil des konzentrischen Konstruktion ist, daß sowohl der axiale Widerstand und die Kapazität an das Bad stark gesunken sind. Die konzentrischen Pipetten Shunts meisten der Widerstand des verfüllten Ionenaustauscher, so dass nur ein Rest in dem letzten Mikrometern vor der Spitze. Darüber hinaus wird die Füllung Lösung innerhalb des konzentrischen Pipetten physikalisch aus dem Bad entfernte, getrennt durch die Dicke von zwei Glaswänden, die Kapazität stark reduziert wird. Wie früher gezeigt ^10, ist die kombinierte Wirkung der verringerten Widerstand und Kapazität eine Verbesserung der zeitlichen Auflösung von zwei Größenordnungen. Im Fall von konzentrischen ^Ca 2+ und pH-Mikroelektroden, waren so günstig wie 10-20 msec ¹⁰ 90% Reaktionszeiten. Ein verwandter Vorteil der konzentrischen Design ist die geringeren Geräuschpegel (siehe Abbildung 8). Aufgrund der stark reduzierten Widerstand, Spannungsspitzen von jedem Ambient Rauschen minimiert. Außerdem ist die Wiederherstellung von solchen schnellen Transienten aufgrund der schnellen Zeitkonstante. Solche Artefakte sind daher klein und schnell und haben eine weniger störend auf physiologische Aufzeichnungen (siehe Abbildung 8).

Gibt es auch Nachteile des konzentrischen Technik. Erstens ist ihre Montage komplizierter und zeitraubend. Ein zweiter Nachteil ist die Notwendigkeit, eine separate Referenzmikroelektrode mit seiner Spitze zu platzieren und beinhaltet die Verwendung entweder eines getrennten Mikromanipulators oder eines spezialisierten Dual-Manipulator. Schließlich kann doppelläufige Mikroelektroden zu einer dreirohrige Design erweitert werden, was die Detektion von zwei verschiedenen Ionenspezies gleichzeitig ^28, die nicht für die konzentrischen Elektroden möglich.

Die häufigsten Fallstricke

Ineffiziente Silanisierung.

Der wichtigste Schritt, und Haupthindernis bei der Herstellung einer flüssigkeits sensoder auf der Basis ionenselektive Mikroelektroden ist die Silanisierung Verfahren. Wenn die Elektroden nicht auf Änderungen der spezifischen Ionenkonzentration reagieren oder zu antworten, mit einer Unter Nernst-Reaktion (dh, auch weniger als 58 mV pro zehnfacher Konzentrationsunterschied) ist schlechte Wirksamkeit der Silanisierung in der Regel die Ursache. Nach unserer Erfahrung kann dies auftreten, wenn der Luftfeuchtigkeit zu hoch ist, oder zu niedrig ist, typisch für die Bedingungen in der Höhe des Sommers oder Winters auf. Wenn es möglich ist, eine gewisse Kontrolle über Raumfeuchte ausüben können diese Probleme überwunden werden.

Elektrodenwiderstand ist zu hoch.

Falls nötig, kann der Widerstand des ionensensitiven Trommel durch Abschrägung reduziert werden. Zu diesem Zweck aussetzen seiner Spitze mit einem starken Strahl eines Schleif in Wasser für ein paar Sekunden ausgesetzt. Dies führt dazu, seine oberste Spitze zu brechen und senken Sie den Widerstand auf den gewünschten Wert.

Salzbrücken.

SalzBrücken zwischen den Ionen und Referenz Barrel führen zu schlecht oder gar nicht reagierenden Elektroden und somit auch stark ihre Leistung bei der Kalibrierung zu verwechseln. Wie bereits erwähnt (siehe Punkt 1.6.), Ist dies vor allem ein Problem, wenn doppelläufige Theta Glas gewählt wird, ist jedoch ein seltenes Ereignis, wenn Sie das hier beschriebene Offset, verdreht Barrel-Technik.

Mit Leichtigkeit der Herstellung vor Augen, kann die ursprüngliche doppelläufige Design Lux ²⁹ oft gewinnbringend eingesetzt werden. Dieses Verfahren nutzt Vorbefüllung der Ionen und Referenz Fässer mit Salzlösungen, eine schnelle Einwirkung einer Silanlösung durch sein Ansaugen und Ausstoßen aus der Spitze, gefolgt von der Einarbeitung Ionenaustauscher, auch mittels der Spitze (siehe ^30,31) . Diese Elektroden können in etwa 10 Minuten hergestellt werden, aber die Spitzengröße ist typischerweise 4 & mgr; m oder mehr, und sie sind anfälliger für während eines Experiments scheitern. Im Gegensatz dazu Silanisierung Methoden beinhalten Exposition gegenüber Silan Dampf und Wärmeing können Elektroden mit kleineren Tipps, die Tage dauern, und manchmal Wochen zu produzieren.

Zusammengenommen gibt es mehrere Protokolle und nähert sich, wie ionenselektive Mikroelektroden vorzubereiten. Hier haben wir zwei Hauptverfahren zur Herstellung von verdrillten Doppelnamen als auch konzentrische Mikroelektroden, die gut und zuverlässig in unseren Labors arbeiten beschrieben, mit einer Erfolgsquote von nahezu 100%. Wichtiger ist, dass diese Techniken zur Messung anderer Ionen Spezies, einschließlich pH oder Calcium übertragbar sein und wird auch auf andere Zubereitungen als das Gehirn, einschließlich flüssigkeitsgefüllten Hohlräumen oder Fluiden im Allgemeinen. Last, but not least, ionenselektiven Mikroelektroden ermöglichen die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in den Zellen. Aufgrund ihrer relativ großen Düsengröße (~ 1 & mgr; m), wird dies jedoch nur in Zellen mit einer großen Zellkörper, beispielsweise möglich, wie beispielsweise in wirbellosen Präparate ^28,32 gefunden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Abrasiv	Mikropolitur	Buehler GmbH	Gelöst in A.dest
Borosilikatglaskapillaren	1405059	Hilgenberg	Anwendung Pipette; 75 mm x 2 mm, Wandstärke 0,3 mm
Borosilikatglaskapillaren mit Filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatur	Für den Sensor von doppelläufigen Mikroelektroden
Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatur	Als Referenz für doppelläufige Mikroelektroden
Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament	GB-200TF-15	Wissenschaft Produkte	Konzentrischer, äußerer Kanal. Außendurchmesser 2,0 mm
Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament	GB-120TF-10	Science Products	Konzentrischer, innerer Kanal. Außendurchmesser 1,2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Elektrometerverstärker mit Kopftisch		Sonderanfertigung	Rin = 10 TΩ und Ibias=50 fA-1pA (kommerziell erhältlich  Alternativen: z.B. Dagan IX2-700, mit Kopftisch (10 Gig Rückkopplungswiderstand) oder EPMS-07, NPI, Tamm, Deutschland)
Experimentierkammer		Sonderanfertigung	Kommerziell erhältlich von <>z.B.   Warner Instruments, USA;   Scientifica, UK
Ofen		Heraeus	Muss konstant bei 200 &° bleiben; C
Hartes klebriges Wachs / Zahnwachs	Deiberit 502	Siladent Dr. Böhme & Schoeps GmbH
Kochplatte		nach Maß	Muss konstant bei 40 Grad bleiben; C
Mikroelektrodenhalter aus Plexiglas		Sonderanfertigung	Doppelläufig: Außendurchmesser   Kapillaren 1,5 mm, konzentrisch: AD   Kapillaren 2 mm
Mikromanipulator		Leitz
Mikromanipulator	MD4R	Leica
Stereomikroskop	M205C	Leica
Objektivplan	0,8xLWD	Leica
Pipettenabzieher	Modell PP-830	Narishige	Konzentrische Mikroelektroden
Pipettenabzieher	Modell P-97	Sutter Instruments	Sensor von konzentrischen Mikroelektroden
Pneumatisches System zur Abwurfung von Medikamenten	Picospritzter Typ II	General Valve TM Corporation
Travel Schwalbenschwanztisch	DT 25/M	Thorlabs
Zweikomponenten-Kleber	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	Man kann auch einen kleinen Streifen Aluminiumfolie verwenden, um die Kapillaren zusammenzukleben.
Silberdraht	99,9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertikaler Abzieher	Typ PE-2	Narishige Scientific Instruments	Mit drehbarem Spannfutter für doppelläufige Mikroelektroden
x/y Translationstisch		Sonderanfertigungen
1(S),9(R)-(−)-Bicucullinmethiodid	Sigma aldrich	14343	Kompetitiver Antagonist von GABAA-Rezeptoren (lichtempfindlich); VORSICHT toxischer
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/Kainat-Rezeptor-Antagonist; VORSICHT: toxisches
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA-Rezeptor-Antagonist; VORSICHT toxisch
Hexamethyldisilazan (HMDS)	Sigma aldrich	440191	ACHTUNG: Entzündlich, akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) und ätzend für Metalle und Haut
L-Asparaginsäure	Sigma aldrich	A9256	Aktiviert NMDA und Nicht-NMDA und EAATs
L-Glutaminsäure-Mononatriumsalzhydrat	Sigma aldrich	G1626	Aktiviert NMDA-R, AMPA-R, QA-R und KA-R),  mGluRs und EAATs
Kalium-Ionophor I - Cocktail B	Fluka	60403	Basierend auf Valinomycin; VORSICHT giftiges
Natriumionophor II - Cocktail A	Fluka	71178	Basierend auf ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor spannungsabhängiger Na+ Kanäle; VORSICHT giftiges
Wasser, ultrareines	Sigma aldrich	W3500