Enzymatische Mikroelektroden-Biosensoren ermöglichen Echtzeitmessungen der extrazellulären Zellsignalübertragung in biologisch relevanten Konzentrationen. Die folgenden Protokolle erweitern die Anwendungen von Biosensoren auf den ex vivo und in vivo Nachweis von ATP und H2O2 in der Niere.
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Methodenartikel
Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Enzymatische Mikro Biosensoren wurden weit verbreitet verwendet, um extrazelluläre Signalisierung in Echtzeit zu messen. Die meisten von ihr Einsatz zu Hirnschnitten und neuronalen Zellkulturen beschränkt. In jüngerer Zeit hat diese Technologie auf den ganzen Organen angewendet wurden. Fortschritte in der Sensordesign haben die Messung der Zellsignalisierung in durchbluteten Niere in vivo ermöglicht. Die vorliegenden Protokolle listen die erforderlichen Schritte, um ATP und H 2 O 2-Signalisierung in der Rattenniere Interstitium zu messen. Zwei separate Sensorkonstruktionen werden für die ex vivo und in vivo-Protokolle verwendet. Beide Sensortypen sind mit einer dünnen enzymatische Bioschicht auf einer Permselektivität Schicht überzogen, um schnell reagieren, empfindliche und selektive Biosensoren zu geben. Die Permselektivität Schicht schützt das Signal von den Interferenten in biologischem Gewebe, und die enzymatische Schicht die sequentielle katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phos nutztphosphat-Oxidase in Gegenwart von ATP, um H 2 O 2 zu produzieren. Der Satz von Sensoren für die Ex-vivo-Studien verwendet weiteren nachgewiesenen Analyten durch Oxidation von H 2 O 2 auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode. Die Sensoren für die in-vivo-Untersuchungen werden stattdessen auf die Reduktion von H 2 O 2 auf einen Mediator beschichteten Goldelektrode für bluteten Gewebe ausgelegt beruht. Endkonzentration Änderungen werden durch Echtzeit-Amperometrie gefolgt von Kalibrierung auf bekannte Konzentrationen des Analyten nachgewiesen. Zusätzlich kann die Spezifität des amperometrischen Signals durch den Zusatz von Enzymen wie Katalase und Apyrase, die unten H 2 O 2 und ATP entsprechend brechen zu bestätigen. Diese Sensoren stützen sich auch stark auf genaue Kalibrierungen vor und nach jedem Experiment. Die folgenden zwei Protokolle bauen das Studium der Echtzeit-Detektion von ATP und H 2O 2 in Nierengewebe, und kann weiter modifiziert werden, um die beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anderen biologischen Präparaten oder ganzen Organen zu verlängern.
Einleitung
Enzymatische Mikroelektroden-Biosensoren (auch als Sensoren in der vorliegenden Handschrift verwiesen wird) haben ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung dynamischer Signalprozesse in lebenden Zellen und Geweben. Die Sensoren liefern in biologisch relevanten Konzentrationen erhöhten zeitlichen und räumlichen Auflösung von Zellsignalmoleküle. Anstelle der Entnahme und Analyse extrazellulären Flüssigkeiten in Intervallen über einen langen Zeitraum angewendet, reagieren diese Sensoren so schnell ihre Enzyme reagieren mit dem Analyten, wodurch Echtzeitmessungen 1,2. Schnelle Erkennung von interstitiellen Konzentrationen von autokrinen und parakrinen Fakto....
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Protokoll
Folgende Tierverfahren im Rahmen der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten werden. Vorherige Genehmigung wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) erhalten.
HINWEIS: Lesen der Sensorherstellers soll während des Versuchs-Design und vor ihrer Verwendung erfolgen. Im Anschluss an diese Anweisungen werden optimale Ergebnisse zu erzielen, wenn Sie die Sensoren.
1. Sensorkalibrierung
- Frische Stammlösungen vor dem Beginn des Experiments.
- Erstellen Puffer A enthaltend 10 mM NaPi-Puffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 und 2 mM Glycerin. Den pH-Wert auf....
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Ergebnisse
Das Design der enzymatischen Mikroelektroden-Biosensor ermöglicht die Echtzeit-Detektion von Analyten in ganzen Nieren. Die allgemeinen Versuchsplanung für die beiden ex vivo oder in vivo-Studien in 1 .Die verwendeten Sensoren veranschaulicht und die chirurgischen Verfahren davon ab, ob die Studie je ist ex vivo oder in vivo.
Um reproduzierbare Ergebnisse, präzise vor und nach der Kalibrierung zu erhalten, sind kritisch. 6A zeigt eine
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Diskussion
Die vorliegenden Protokolle wurden entwickelt, um eine verbesserte zeitliche und räumliche Auflösung der ATP bereitzustellen und H 2 O 2 Signalisierung für ex vivo isolierten, perfundierten und in vivo durchbluteten Niere. Die Differenzen zwischen den Protokollen und den hier verwendeten Sensoren liefern eine optimale Datenerfassung entweder für pharmakologische Mittel oder physiologische Studien. Protokolle bestehen aus 1) Sensorkalibrierung, 2) chirurgische Verfahren, 3) Datenerfassungsein.......
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Offenlegungen
Sensoren für die Videoaufzeichnung dieser Handschrift wurden von Sarissa Biomedical Limited (Coventry, UK) zur Verfügung gestellt.
Danksagungen
Wir schätzen Sarissa Biomedical für ihre Arbeit bei der Entwicklung der in der vorliegenden Manuskript verwendeten Sensoren. Diese Forschung wurde von der National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) und HL 122662 (A. Staruschenko und A. Cowley), ein Projekt des Medical College of finanziert Wisconsin Komitee Forschung Angelegenheiten # 9306830 (O. Palygin) und Vorschieben eines gesünderen Wisconsin Forschungs- und Ausbildungsprogramm # 9520217, und das Young Investigator Grants des National Kidney Foundation (O. Palygin).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Sensor-Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | Das Kit enthält eine Aufbewahrungsflasche, eine Rehydrationskammer, Elektrodenkabel und Referenzelektroden. Ebenfalls im Kit enthalten ist die Auswahl der Sensoren des Benutzers. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μ m | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | vor Gebrauch bei 2-8 oC |
| aufbewahren Sarissagold ATP Biosensor 50 μ m | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | Vor Gebrauch bei 2-8 oC |
| aufbewahren Sarissaprobe Nullsensor 125 μ m | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | vor Gebrauch bei 2-8 oC |
| lagern Sarissagold Nullsensor 50 μ m | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | vor Gebrauch bei 2-8 oC |
| aufbewahren Sarissaprobe ATP Handbuch Sarissa | Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faradayscher Käfig | TMC | ||
| Zweikanal-Potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Typ II Faradayscher Käfig |
| Datenerfassungsprogramm | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusionspumpe | Razel Scientific Instruments | Modell R99E | |
| Faseroptische Beleuchtung | Schott | ACE 1 | |
| Mikromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Mikromanipulator Magnetständer | Narishige | GJ-8 | |
| Lufttisch | TMC | 63-500 | |
| Isofluran-Beatmungsgerät | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml Petrischale | Fisher Scientific | S3358OA | |
| Nadel | Santa Cruz | 26-30 G | |
| Stifte | Standard Dissektionsstifte | ||
| Katheter | Polyethylenschlauch (PE50) | ||
| Kleber für Katheter Vetbond | 1469SB | ||
| Nahtmaterial | Look | SP117 | |
| Gummibänder | beliebig 2-4 mm breite Gummibänder | ||
| Silikon | Momentive | RTV-615 Klar 1# | |
| Klemme | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| Das Standard-Präparierset | sollte ein Skalpell und eine Präparierschere enthalten. | ||
| Nierenbecher | Eigene | ||
| Standardchemikalien | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP-Lösung |
| Wasserstoffperoxid | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Isofluran | Clipper | 10250 | |
| Inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| Ketamin | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
Referenzen
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for con....
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Nachdrucke und Genehmigungen
