Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Summary

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Abstract

Die Fähigkeit des Gehirns, sensorische Informationen zu verarbeiten, beruht sowohl auf aufsteigenden als auch auf absteigenden Projektionssätzen. Bis vor kurzem war die einzige Möglichkeit, diese beiden Systeme und ihre Wechselwirkung zu untersuchen, die Verwendung von In-vivo-Präparaten. Große Fortschritte wurden mit akuten Hirnschnitten erzielt, die die thalamokortikalen und kortiko-thalamischen Bahnen im somatosensorischen, visuellen und auditiven System enthalten. Mit wichtigen Verfeinerungen unserer jüngsten Modifikation des auditorischen thalamokortikalen Schnitts¹ sind wir in der Lage, die Projektionen zwischen den meisten der wichtigsten auditorischen Mittelhirn- und Vorderhirnstrukturen zuverlässiger zu erfassen: dem Colliculus inferior (IC), dem medialen Genikulatkörper (MGB), dem thalamischen retikulären Kern (TRN) und dem auditorischen Kortex (AC). Da Teile all dieser Verbindungen erhalten bleiben, sind wir in der Lage, detaillierte Fragen zu beantworten, die die Fragen ergänzen, die mit In-vivo-Präparaten beantwortet werden können. Die Verwendung von Flavoprotein-Autofluoreszenz-Bildgebung ermöglicht es uns, die Konnektivität in einer bestimmten Schicht schnell zu beurteilen und das anschließende Experiment zu leiten. Durch die Verwendung dieser Schicht in Verbindung mit Aufzeichnungs- und Bildgebungstechniken sind wir nun besser gerüstet, um zu verstehen, wie die Informationsverarbeitung an jedem Punkt des auditorischen Vorderhirns abläuft, wenn Informationen in den Kortex aufsteigen, und welche Auswirkungen die absteigende kortikale Modulation hat. Der 3D-Druck zur Herstellung von Schichtkammerkomponenten ermöglicht eine doppelseitige Perfusion und einen breiten Zugang zu Netzwerken innerhalb der Scheibe und behält die weit verbreiteten Verbindungen bei, die für die vollständige Nutzung dieses Präparats entscheidend sind.

Introduction

Im auditorischen System, obwohl es eine wesentliche Verarbeitung von Informationen zwischen der sensorischen Peripherie und dem Colliculus inferior, gibt es erhebliche zusätzliche Verarbeitung, bevor es den auditorischen Cortex erreicht. Wir wissen sehr wenig darüber, wie die Verarbeitung durchgeführt wird und deshalb wenig darüber, wie die Transformation ermöglicht es dem Gehirn, um eingehende sensorische Information zu interpretieren. Mit Ausnahme des Geruchssinns, hat jede der Richtungen eine sehr ähnliche Organisation mit Peripheriesignale anfänglich mit hoher Wiedergabetreue, die als das Signal steigt zum Cortex lehnt weitergeleitet. Der Cortex sendet dann Projektionen zu den unteren Strukturen weiter zu modulieren, die eingehenden Informationen. Dieses komplexe System in eine Vielzahl von Arten sowohl in vivo als auch in einer Reihe von in vitro-Präparationen untersucht. In der ehemaligen, alle Verbindungen intakt sind, so dass die Forscher, jede Menge von Verbindungen zu untersuchen, während die sensorischen Input und MessenAusgabe in einem bestimmten Gebiet. Mit diesem Ansatz gibt es wenig bis gar keine Kontrolle über die große Auswahl an anderen Eingängen, einschließlich anderer Sinneseindrücke, Erregung und Aufmerksamkeit, was zu einem intensiv komplexe Ausgangs. In vitro Hirnschnitten geschnitten worden, um entweder einen einzigen Satz zu erfassen von Vorsprüngen oder zwei verbundenen Hirnareale, die Forscher zu stimulieren und zu evaluieren verschiedene Afferenzen oder Gehirnbereiche zu ermöglichen. Diese sind häufig entweder thalamocortical oder tectothalamic Scheiben, bei denen entweder der Eingang für den Thalamus oder den Thalamus und dessen Ausgang mit dem Kortex bewahrt ^2-5. Diese Präparate ermöglichen eine Vielzahl von pharmakologischen, elektrischen und optogenetischen Manipulationen. Jedoch mit nur zwei Hirnregionen, sie in erster Linie zu bewerten die Übertragung von Informationen und die Fähigkeit fehlt, die Umwandlung von Informationen auswerten, wenn er durch den Thalamus läuft. Auch die reticulo-Thalamus-Projektion, die in der Aufmerksamkeit Modulation eine Rolle spielen kann ^6-9 prESENT in dieser Scheibe. Hier zeigen wir Verbesserungen an unseren früheren ^{Herstellungsbeispiel} 1, das die Ermittler Steuerung verschiedener Eingänge zum Thalamus ermöglicht, eine einzigartige Perspektive, wie Thalamus Toren und Filter Informationen. Wir Paar dieser Roman Schnittpräparat mit Flavoprotein Autofluoreszenz für die Beurteilung der Scheibe Konnektivität und groß angelegte Aktivierungsanalyse, Kalzium-Imaging im Thalamus zur neuronalen Populationsanalyse und Einzelzellableitung, um die Auswirkungen der verschiedenen Eingänge auf einer Einzelzellebene zu messen.

Um bei der Aufrechterhaltung dieser weit verbreiteten Verbindungen unterstützen wir auch zum Halten der Hirnschnitt an Ort und Stelle und eine Brücke, um die Scheibe für eine verbesserte Durchblutung zu erhöhen entwickelt eine Reihe von Änderungen des normalen Schichtanker (aka "harp"). Die Harfe wird in einer modifizierten Hufeisenform entwickelt, um die Scheibe zu umgeben und ermöglichen anpassbare Befestigungspunkte für die Harfensaiten. Drei Saitenangebracht ist, dass i) eine horizontal liegt entlang der medialen Rand der Scheibe, ii) eine sich von der kaudalen Rand des IC bis zum kaudalen Rand des AC und iii) eines diagonal von der medialen Rand der Scheibe in einen Bereich erstreckt, rostral des AC (siehe 1A). Kleine Vertiefungen in dem Rahmen zum Kleben (mit Sekundenkleber) der Harfensaiten ermöglichen eine verringerte Menge an Druck auf die Scheibe zur Aufrechterhaltung Scheibe Integrität (siehe Abbildung 1B). Durch die Verwendung von dreidimensionalen Drucken, können wir kundenspezifisch anfertigen Harfen unserer einzigartigen Spezifikationen, sowie Brücken, die für eine ideale Strömung des künstlichen Liquor (aCSF) oberhalb und unterhalb des Gewebes zu ermöglichen. Dies hält auch große Flächen für Licht, um das Gewebe für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu durchdringen.

Protocol

Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Illinois zugelassen. Alle Tiere wurden in der Tierbetreuungseinrichtungen von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt gebracht. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren und Leid in allen Phasen der Studie zu reduzieren.

1. Vorbereitung und Beseitigung von Gehirn von Maus für Slicing

1. Bereiten Sie für die Perfusion und Scheibe Inkubation.
   1. Etwa 30 Minuten vor dem Schneiden, bereiten hohen Saccharose Schneidlösung und niedrige Kalzium aCSF für die Inkubation der Scheibe vor der Aufzeichnung oder Abbildung.
   2. Legen Sie alle notwendigen Werkzeuge (große stumpfe Ende Schere, kleine Feder Schere, anatomische Pinzetten, große Schere oder Guillotine, Iris Schere, Juweliere Zangen, 10 ml Spritze mit 27G x 1/2 Zoll Nadel, kleines Stück von 1 cm x 2 cm Filter Papier und ein gebrochen gekippt Pasteur-Pipette für slEis-Transfer) für die Durchblutung und Schneiden, und bereiten Perfusion Fach.
   3. Up Inkubation Kammer mit sauerstoff aCSF in einem 32 ^{° C} Wasserbad und einer Kulturschale mit Schnittlösung gefüllt wird.
2. Bereiten Schneidphase für das Schneiden.
   1. Schneiden Sie ein kleines Stück von 3% Agar etwa 1 cm ³ als Rücklaufsperre für das Gehirn und 1,5 cm x 1,5 x 3 mm für eine Beule zu verwenden, um zur Stützung der IC werden.
   2. Kleben die Rücklaufsperre auf die Bühne mit Cyanacrylatkleber sowie die Höcker auf der rechten Seite der Rücklaufsperre derart, dass sie eine 80 ^o Winkel bilden.
3. Entfernen Sie das Gehirn.
   1. Tief betäuben eine p12-p20 (idealer p14-18) Maus mit Ketamin 100 mg / kg und xylaxine 3 mg / kg (oder vergleichbar Ethikkommission genehmigten Verfahren).
      Hinweis: Bestätigen Sie die richtige Anästhesie Ebene über mangelnde Reaktion bis zu den Zehen Prise. Das Tier unter Narkose ist kurz gesagt, Augensalbe unnötig.
   2. Verwendung stumpfeEnde Schere, setzen den Brustkorb von der Schwertfortsatz bis zum Hals.
      1. Finden Sie den Schwertfortsatz, und machen einen horizontalen Schnitt von ca. 1,5 cm.
      2. Machen Sie zwei vertikale Schnitte von den Enden der vorherigen horizontalen Schnitt bis zu den Schultern, etwa 1,5 cm jeweils.
   3. Durch die Membran und den kostochondralen Gängen geschnitten, um das Herz freizulegen.
   4. Mit kleinen Federschere, machen Sie eine kleine, 2-5 mm im rechten Vorhof geschnitten, von der ventralen zur Seite des Herzens dorsal.
   5. Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 27G x 1/2 Zoll Nadel, spritzen den linken Ventrikel und schnell durchströmen das Tier mit hohen Saccharose Schneidelösung.
   6. Sobald das Blut läuft klar, verwenden Sie größere Schere, um den Kopf zu entfernen.
      Hinweis: Wir haben noch nicht systematisch den Nutzen der Perfusions bewertet. Aber nach unserer Erfahrung transcardiac Perfusion bei Mäusen dieser junge mit nahezu 100% Erfolg durchgeführt werden und hat den Vorteil der Beseitigung der roten blood-Zellen, die fluoreszieren und stören Bildgebung kann.
   7. Schneiden Sie die Haut nach unten die Mittellinie, um den Schädel freizulegen.
   8. Verwendung gebogen Iris Schere, schnitt den Schädel zwischen den Augen, dann ausgehend von der Schnitt zwischen den Augen, sorgfältig von anterior geschnitten, um entlang der Mittellinie Naht kümmert sich nicht um das Gehirn unter beschädigen posterior.
      Hinweis: Die Dura kommt in der Regel mit dem Schädel. Entfernen Sie gegebenenfalls die Dura, bevor sorgfältig Entfernen des Gehirns.
   9. Verwendung Juweliere Zangen, hebeln Sie den Schädel und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, dann das Gehirn in Schnittlösung. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Rinden.

2. Vorbereitung Gehirn für Slicing

1. Vorbereiten des Gehirns für die Montage auf Vibratom Bühne.
   1. Mit Hilfe eines Objektträgers mit zwei Linien bei 90 ^o markiert und eine diagonale Linie bei 17 ^o von oben links nach unten rechts, wo die beiden sich kreuzenden Linien treffen, legen Sie die Gehirnrückenseite auf, miteine Rasierklinge, entfernen 2-4 mm des rostralen Ende Gehirn die Schaffung einer ebenen Fläche.
   2. Legen Sie das Gehirn Schwanzseite nach oben auf die neu geschaffene flache Oberfläche, und richten Sie die dorsale Oberfläche des Gehirns mit der horizontalen und der Mittellinie des Gehirns mit der vertikalen Linie.
   3. Richten Sie die Rasierklinge mit der 17 ^O-Leitung, kippen Sie den Rasierer in einem ³⁰ ° Winkel und entfernen Sie etwa 3 mm von der rechten Cortex im Doppelschrägschnitt (17 ^o von der horizontalen Ebene und 60 ^o von der koronalen).
2. Montage Hirn auf Vibratom Bühne.
   1. Stellen ein kleines Stück Filterpapier 1 cm x 2 cm auf der ventralen Seite des Gehirns, so daß die lange Abmessung rechtwinklig zu der Mittellinie.
   2. Eine kleine Menge von Cyanacrylatkleber vorsichtig auf der den Bereich vor der Rücklaufsperre (und links des Höckers).
   3. Der doppelte diagonal geschnitten Gehirn Gesicht auf den Leim, so dass der kaudalen Teil des Gehirns und Hinterhirn sind prgeopt auf dem Höcker und der rechten Seite des Gehirns, ist gegen die Rücklaufsperre.
   4. Zart unten drücken Gehirn, so dass die gesamte Oberfläche in Kontakt mit der Schneidkammer.

3. Abrufen der Colliculo-thalamokortikalen Scheibe

1. Nehmen schnell die Schnitt Bühne und Platz in der Vibratom, füllen die Bühne mit modern Lösung.
2. Richten Sie die Klinge mit der Spitze (Bauchseite) des Gehirns.
3. Entfernen 1-1,5 mm von der Spitze des Gehirns, entfernen 300-500 & mgr; m Scheiben und bewerten Tiefe nach Entfernen.
   Hinweis: Wenn der IC, der MGB und das Corpus geniculatum laterale (LGN) sind sichtbar, und der Gyrus dentatus bildet ein "C" Form annehmen 1.59 600 um Scheiben schneiden. Siehe 3A.
4. Die Scheiben in beheizten (32 ^{° C)} Aufnahmekammer.

4. Imaging der Scheibe

1. Vorbereitung für Flavoprotein Autofluoreszenz-Bildgebung.
   1. Bereiten aCSF für die Perfusion von slice in einem Standard-elektrophysiologischen Aufzeichnungskammer, bubble aCSF mit 95% _{O 2/5%} CO 2.
   2. Ziehen Glaselektrode für die Stimulation. Man beachte, dass mehrere verschiedene Stimulationselektroden und Konfigurationen (Glas, Wolfram, Kohlenstoff-Faser, monopolar, bipolar) alle Arbeiten sehr gut in Verbindung mit Flavoprotein Autofluoreszenz.
   3. Schalten Sie Computer, Kamera, Mikromanipulator, Lichtquelle, Stimulationssoftware, Bildaufnahmesoftware.
   4. Perfundieren die Aufnahmekammer mit sauerstoff aCSF, legen Sie benutzerdefinierte Brücke (Design-in Zusätzliche Materialien verfügbar), um Scheibe in der Kammer zu erhöhen.
      Hinweis: Perfusionsrate kann mit jeder einzelnen Einrichtung zu variieren; 5-15 ml / min zum Einsatz.
   5. Zeigen Scheibe in der Kammer, senken Sie den Füllstand in der Kammer, um die Scheibe vom Abheben der Brücke zu verhindern, während Platzierung speziell konstruierten Harfe über Scheibe, wobei darauf zu vermeiden, dass Harfensaiten über Wege der interest (Abbildung 1A). Erhöhen Flüssigkeitspegel auf ca. 1-2 mm über Slice aCSF Satz ober- und unterhalb Scheibe zu halten.
      Hinweis: Wenn Neupositionierung notwendig ist, verwenden Sie den gebrochenen Ende Pasteur-Pipette oder erlauben dem aCSF Ebene zu erheben und verwenden Pinzette mit äußerster Vorsicht.
   6. Legen Silberchlorid-Elektrode in die Glaselektrode mit aCSF gefüllt, legen Sie die Glaselektrode in die Mikromanipulator und eine Verbindung zum Isolator Reiz, und sorgfältig zu platzieren Glaselektrode in IC / weißen Substanz, die zu Thalamus (siehe 1A).
2. Flavoprotein Autofluoreszenzbildaufnahme.
   1. Sammeln Bilder bei 4 Hz (mit einem unendlich korrigierte 2X Makro-Objektiv (NA 0,13)) und eine Kamera für 105 sec, während die elektrische Stimulation (jeder Stimulation besteht aus 1 s von 40 Hz 2 msec Impulse Gewebe bei 0,05 Hz fünfmal) während Beleuchtungs das Gewebe mit blauem Licht von 470 bis 490 nm und die Erfassung über 515 nm. Damit das Bild ist weder zuo dunkler, noch ausgeblasen siehe Abbildung 3 auf der linken Seite als Referenz.
      Hinweis: Sammelzeit, Sammlung Frequenz und Stimulationsfrequenz kann geändert werden, um das Experiment, das benutzerdefinierte Programm ergänzende Materialien enthalten können als solche geändert werden, zu entsprechen.
   2. Export von Bildern in Matlab, und mit Hilfe der benutzerdefinierten geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,05 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird angeschlossene Signalwege zu zeigen.
      Hinweis: Der individuelle Programm verwendet eine schnelle Fourier-Transformation der Pixelwerte in der Zeitreihe, um das Bild zu erzeugen.
3. Vorbereitung für die Kalzium-Imaging.
   1. Bereiten Sie kleine Inkubationskammer mit einem 3 cm Kulturschale und hob Kulturmembran, damit aCSF, um sowohl die Ober- und Unterseite der Scheibe, und auf ein Heizkissen erreichen Temperatur bei ca. 32 ^o C zu erhalten
   2. Füllen Sie kleine Inkubationskammer mit warmem aCSF und langsam Blase mit 95% O_{2/5% CO} 2.
   3. Mischungs 2 ul Pluronic F-127 Säure und 50 ug Fura-2AM in 48 ul DMSO gelöst.
   4. Platz Scheibe in kleinen Inkubationskammer auf erhöhten Membran und sorgfältig mit einer Mikropipette hinzufügen Färbemischung direkt über der MGB (oder eine andere Struktur von Interesse).
   5. Bedeckung Scheiben Bleichen vor der Bilderzeugung zu verhindern und zu ermöglichen Scheiben für 45 min inkubieren - 1 Std.
   6. Entfernen Scheiben Warmhalteraum für 10-15 min abzuwaschen überschüssiges Material.
   7. Führen Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.6 für die Zubereitung zu stimulieren und die Bild colliculo-thalamokortikalen Slice.
4. Calcium Bildaufnahme.
   1. Sammeln Sie Bilder mit 10 Hz (unter Verwendung eines 20X Wasserimmersionsobjektiv) für 25 sec, während elektrische Stimulation (jede Stimulation besteht aus einem 2 ms Puls) Gewebe bei 0,2 Hz fünf Mal beim Beleuchten des Gewebes mit Licht von 365 nm und die Erfassung Fluoreszenz oberhalb 510 nm.
   2. Export von Bildern in Matlab und das benutzerdefinierte geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,2 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird aktiven Zellen zu zeigen.

Results

Ein Beispiel colliculo-thalamocortical Maushirnschnitt in P15-Maus ist in Figur 2 gezeigt ist. Die ideale Scheibe werden die vier Haupthirn und Vorderhirn Gehörstrukturen IC, MGB, TRN und AC, die alle aktiviert werden, wenn die IC-stimuliert enthalten (2A). Verwendung von Fourier-Analyse wird die spektrale Leistung zu der elektrischen Stimulationsfrequenz gemessen wird, verbunden mit Hirnregionen, die Aktivität, die periodisch ist und an der ^{Stimulationsfrequenz}

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt Verbesserungen gegenüber einer zuvor beschriebenen kollikulo-thalamokortikalen Hirnschnitt bei p12-20-Mäusen zur Untersuchung des Informationsflusses im auditorischen System¹. Diese Methode hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen, ähnlichen Hirnschnittpräparaten, indem sie Verbindungen zwischen mehr Gehirnbereichen in einer einzigen Schicht beibehält, was den Forschern neue Werkzeuge an die Hand gibt, um die Interaktion und das Zusammenspiel zwischen den Hörkernen im Vorderhi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		mit hohem Saccharosegehalt	in mM: 206 Saccharose, 10,0 MgCl2, 11,0 Glukose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0,5 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
Niedriges Calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3,0 MgCl2, 10,0 Glukose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2,0 MgCl2, 10,0 Glukose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Los: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Los: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Los: 1499369
Große Kulturschale	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm Kulturschale
Kleine Kulturschale	Falcon	353001	35 x10 mm
Kulturschale Erhöhte Kulturmembran	Millicell	PICMORG50	Wird verwendet, um die sauerstoffhaltige Flüssigkeitsperfusion auf beiden Seiten der Scheibe aufrechtzuerhalten.
Flavoprotein Imaging Fluoreszenzwürfel	Olympus	UMNIB	470– 490 nm Anregung, 505 nm dichroitische, 515 nm Emission Langpass. Wir haben festgestellt, dass praktisch jeder grün fluoreszierende Proteinfilterwürfel hier funktioniert.
Calcium-Imaging-Fluoreszenzwürfel	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm Ausgang, XF2001 400 nm dichroitisch, XF3080 510 nm
Emission Agar zur Blockierung des Gehirns			3 Gew.-% in Wasser
Viper si Stereo-Lithographie-Gerät	3D-Systeme