Methodenartikel

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

DOI:

10.3791/53069

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30. März 2016

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1Department of General-, Visceral- and Transplantation Surgery, Charité University Medicine Berlin, 2Brandenburg Center for Regenerative Therapies, Charité University Medicine Berlin

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Zusammenfassung

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Neben parenchymal Hepatozyten besteht die Leber von nicht-Parenchymzellen (NPC) nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und hepatischen Sternzellen (HSC). Zweidimensionale (2D) Kultur von primären humanen Hepatozyten (PHH) gilt bis heute als "Goldstandard" betrachtet für in vitro - Untersuchung von Arzneimittelmetabolismus und Hepatotoxizität. Es ist bekannt, dass die 2D-Monokulturen von PHH von Entdifferenzierung und Funktionsverlust leidet. Kürzlich wurde gezeigt, dass hepatische NPC eine zentrale Rolle in der Leber (patho-) Physiologie spielen und die Wartung von PHH Funktionen. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Rekonstruktion von in - vivo - Gewebearchitektur von 3D- und Co-Kultur - Modelle , die Grenzen von 2D - Monokulturen zu überwinden. Vorveröffentlichten wir ein Verfahren menschlichen Leberzellen zu isolieren und untersucht um die Eignung dieser Zellen für ihre Verwendung in Zellkulturen in Experimental Biology and Medicine 1. Auf Basis des breiten Interesses an dieser tedas Ziel dieses Artikels chnique war ein detaillierteres Protokoll für den Leberzellisolierungsverfahren einschließlich eines Video zu schaffen, das eine einfache Reproduktion dieser Technik ermöglicht.

Menschliche Leberzellen wurden aus menschlichen Lebergewebeproben von chirurgischen Eingriffen einem zweistufigen EGTA / Kollagenase P Perfusionstechnik isoliert. PHH wurden aus dem NPC durch eine anfängliche Zentrifugation bei 50 x g abgetrennt. Dichtegradientenzentrifugation Schritte wurden zur Entfernung von abgestorbenen Zellen verwendet. Einzelne Leberzellpopulationen wurden aus dem angereicherten NPC-Fraktion unter Verwendung von spezifischen Zelleigenschaften und Zellsortierverfahren isoliert. Neben der PHH Isolation konnten wir KC, LEC und HSC für die weitere Kultivierung zu trennen.

Zusammengenommen können die präsentierten Protokoll die Isolierung von PHH und NPC in hoher Qualität und Quantität von einem Spender Gewebeprobe. Der Zugriff auf gereinigte Leberzellpopulationen könnte die Schaffung von in vivo wie menschliche li erlaubenver-Modelle.

Einleitung

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Menschliche Lebergewebe ist sehr komplex und besteht aus zwei verschiedenen Zelleinheiten, Parenchymzellen und nicht-parenchymale Zellen (NPC). Parenchymale Leberzellen umfassen Hepatozyten und Cholangiozyten. Hepatozyten repräsentieren 60 bis 70% der gesamten Leberzellen und machen die meisten der metabolischen Leberfunktionen, zB Gallensäure und Komplementfaktor Synthese, Biotransformation und Energiestoffwechsel 2,3.

Je kleiner NPC Fraktion bildet 30-40% der gesamten Leberzellen. NPC umfassen verschiedene Zellpopulationen, nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und die hepatischen Sternzellen (HSC).....

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Protokoll

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Anmerkung: Alle Zellen von resezierten nicht-tumorösen menschlichen Lebergewebe isoliert wurden, die nach partieller Leberresektion mit primären oder sekundären Lebertumoren geblieben. Universitätsmedizin Berlin - Einverständniserklärung der Patienten wurde nach den ethischen Richtlinien der Charité erhalten.

1. Herstellung von Materialien und Lösungen

  1. Sterilisieren alle Instrumente und die Materialien im Voraus eine bakterielle Kontamination während des Isolationsprozesses zu vermeiden.
  2. Herstellung der Lösungen für die Perfusion der Leber Gewebeprobe erforderlich, den Isolationsprozess der Hepatozyten und nicht-paren....

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Ergebnisse

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Die Trennung in eine parenchymalen und nicht-parenchymalen Fraktion Gradientenzentrifugation als Clean-up-Verfahren unter Verwendung von Dichte mit der Verwendung von Adhärenz kombinierten Eigenschaften und MACS führt zu erfolgreichen PHH und NPC Isolation. PHH und NPC befindet sich in der hohen Qualität und Quantität isoliert werden. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Einrichtung der Ausrüstung für die Leberperfusion und Verdauung. 10% FCS wurde der Kollagenase P gege.......

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Diskussion

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Die veröffentlichten Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung reiner PHH und NPC, nämlich KC, HSC und LEC, gleichzeitig in hoher Qualität und Reinheit aus der gleichen Probe von menschlichem Lebergewebe. Die Mehrzahl der Publikationen mit Leberzellisolationen Umgang decken nur eine dieser Zellpopulationen 18-20 und Isolierungsverfahren mit menschlichem Gewebe durchgeführt sind selten (rezensiert von Damm et al.) 21. Anpassung von Methoden mit tierischem Gewebe etabliert (zB

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

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Wir möchten Jia Li Liu für ihre Unterstützung bei der Erstellung von Abbildung 1. Diese Studie wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Projekt Virtuelle Leber unterstützt wurde zu danken: 0.315.741.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
General Equipment
PIPETBOYEppendorf
PipettenEppendorf
MikroskopCarl Zeiss
MikroskopOlympus
CO2-InkubatorBinder
Lamin AirHeraeus
Zentrifuge Varifuge 3.0RHeraeus
UrinbecherSarstedt2041101
Perfusor Spritze 50 mlB.Braun12F0482022
Flaschenaufsatz FilterNalgene1058787
Falcon 50 ml Polypropylen Konisches RöhrchenBD Biosciences352070
Falcon 15 ml konisches Polypropylen-RöhrchenBD Biosciences352096
GewebekulturplatteBD Biosciences533047mit 24 Well
BD Biosciences357525, 357551, 35754325 ml, 10 ml, 5 ml
PipettenspitzenSARSTEDT0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011100 µ L, 200 &Mikro; L, 1.000 &Mikro; l
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Isolationsausrüstung
WasserbadLauda
SchlauchpumpeCarl Roth
Zirkulation ThermostatLauda
pH-MessgerätSchott
FeinskalenSartorius
Stand
Bü chner TrichterHaldenwanger
Kunststofftrichter
Silikonschlauchkanülen
mit Olivenspitzen
Glasschale
Pinzette
SkalpellFeder12068760
Neubauer ZählkammerOptic Labor
ZellheberCostar
Chirurgisches AbdecktuchCharité Universitätä tsmedizin BerlinA2013027
KompresseFuhrmann40013331
sterile OP-HandschuheGammex PF1203441104
GewebekleberB. Braun1050052
GlasflascheVWR
Collagenase PRoche13349524
Percoll TrennlösungBiochromL6145Dichte 1.124 g/ml
Strang' s BSSPAAH00911-3938
Dulbecco" s PBSPAAH15 - 002ohne Mg/Ca
AmpuwaPlastipur 13CKP151 
AlbuminSigma-AldrichA7906
NaClMerck1.064.041.000
KClMerck49.361.000
Hepes Pufferan Roth133196836
EDTA SigmaE-5134
NameUnternehmen<strong>Katalognummer<>Kommentare
Media Equipment 
DMEMPAAE15-005Low Glucose (1 g/L) (ohne L-Glutamin)
HEPES Puffer Lösung 1  MGIBCO1135546
L-GlutaminGIBCO25030-024200 mM
MEM NEAAGIBCO11140-035
Penicillin/StreptomycinGIBCO15140-122
RPMI 1640PAAE15 - 039ohne L-Glutamin
NatriumpyruvatGIBCO1137663100 mM
Trypanblau LösungSigma-AldrichT81540.4%
William' s E   GIBCO32551-020
mit GlutaMAX™
EGTASigma-Aldrich03780-50G
FortecortinMerck493678 mg/2 ml
Human-InsulinLillyHI0210100 I.E./ml
N-Acetyl CysteinSigma-AldrichA9165-5G
Fötales Kälberserum (FCS)PAAA15-101
NameUnternehmen<>KatalognummerKommentare
Ausrüstung für Immunfärbungen
CD 68R& D Systems, USAmonoklonales
CK 19Santa CruzD2309polyklonales
CK18Santa CruzK2105monoklonales
VimentinSanta Cruzmonoklonales
GFAPSigma Aldrichmonoklonales
Triton X-100Sigma Aldrich23.472-9
Ziegen-Anti-Maus-IgG1-PESanta CruzC0712
Ziege Anti-Kaninchen IgG-FITCSanta CruzL0412
MethanolJ.T.Baker1104509006
Formaldehyd 4%HerbetaArzneimittel200-001-8
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma AldrichA7906-100G
serologische Pipetten

Referenzen

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  1. Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
  2. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev Cell. 18 (....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

EGTA Kollagenase PerfusionDichtegradientenzentrifugationKupffer Zell Isolierungleberspezifische Endothelzellenhepatische SternzellenZellsortierungsverfahrenTrypanblau F rbungPhasenkontrastmikroskopie

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