Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Zusammenfassung

Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.

Zusammenfassung

Obwohl die Mikrofluidik eine exquisite Kontrolle der zellulären Mikroumgebung bietet, kann die Kultivierung von Zellen in mikrofluidischen Geräten challenging. 3D Kultur von Zellen in Kollagen-Typ-I-Gelen zur Stabilisierung der Zellmorphologie und -funktion beitragen, was für die Erstellung von mikrofluidischen Gewebemodellen in Mikrogeräten notwendig ist. Die Übertragung traditioneller 3D-Kulturtechniken für Gewebekulturplatten auf mikrofluidische Geräte ist aufgrund der begrenzten Kanalabmessungen oft schwierig. In dieser Methode beschreiben wir eine Technik zur Modifikation von nativem Typ-I-Kollagen, um polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zu erzeugen, die mit schichtweiser Abscheidung verwendet werden können, um ultradünne Kollagenanordnungen auf Zellen zu erzeugen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden. Diese dünnen Kollagenschichten stabilisieren die Zellmorphologie und -funktion, wie am Beispiel von primären Hepatozyten gezeigt wird, was die Langzeitkultur von Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten ermöglicht.

Einleitung

Obwohl die Mikrofluidik die exquisite Kontrolle der zellulären Mikroumgebung ermöglicht, kann die Kultivierung von Zellen, insbesondere Primärzellen, in mikrofluidischen Geräten eine Herausforderung darstellen. Viele traditionelle Zellkulturtechniken wurden entwickelt, um die Zellfunktion bei der Kultivierung in Gewebekulturplatten zu erhalten und zu stabilisieren, aber die Übertragung dieser Techniken auf mikrofluidische Geräte ist oft schwierig.

Eine solche Technik ist die Kultivierung von Zellen auf oder zwischen Kollagengelen als Modell der physiologischen 3D-Zellumgebung. ¹ Kollagen Typ I ist aufgrund seiner Allgegenwart in der extrazellulären Matrix, der natürlichen Häufigkeit, der robusten Zellanheftungsstellen und der Biokompatibilität eines der am häufigsten verwendeten Proteine für Biomaterialien. ² Viele Zellen profitieren von einer 3D-Kultur mit Kollagen, darunter Krebszellen^3,45, mikrovaskuläre Endothelzellen⁶ und Hepatozyten⁷. Während die Verwendung von Kollagengelen in offenen Formaten, wie z. B. Gewebekulturplatten, einfach ist, machen die begrenzten Kanalabmessungen und die geschlossene Natur von mikrofluidischen Geräten die Verwendung von Flüssigkeiten, die gelieren, ohne den gesamten Kanal zu blockieren, unpraktisch.

Um dieses Problem zu lösen, haben wir die schichtweise Abscheidungstechnik⁸ mit chemischen Modifikationen von nativen Kollagenlösungen kombiniert, um ultradünne Kollagenanordnungen auf Zellen zu erzeugen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden. Diese Schichten können die Zellmorphologie stabilisieren und ähnlich wie Kollagengele funktionieren und können in mikrofluidischen Geräten auf Zellen abgeschieden werden, ohne die Kanäle mit polymerisierter Matrix zu blockieren. Das Ziel dieser Methode ist es, natives Kollagen zu modifizieren, um polykationische und polyanionische Kollagenlösungen herzustellen und Zellen in mikrofluidischen Kulturen zu stabilisieren, indem dünne Kollagenmatrix-Anordnungen auf den Zellen abgeschieden werden. Diese Technik wurde verwendet, um die Morphologie und Funktion von primären Hepatozyten in mikrofluidischen Geräten zu stabilisieren. ⁹

Obwohl zuvor über schichtweise Abscheidung mit natürlichen und synthetischen Polyelektrolyten¹⁰ berichtet wurde, um Hepatozyten in Plattenkulturen^11,12 und als Aussaatschicht für Hepatozyten in mikrofluidischen Geräten^13,14 abzudecken, beschreibt dieses Verfahren die Abscheidung einer reinen Kollagenschicht auf Hepatozyten, wobei die 3D-Kollagenkulturtechniken nachgeahmt werden. In diesem Protokoll verwenden wir Hepatozyten als Beispielzellen, die mit Hilfe von 3D-Kollagenschichten aufrechterhalten werden können. Die vielen anderen Zelltypen, die von der 3D-Kultur in Kollagen profitieren, können in ähnlicher Weise von der Kultur nach schichtweiser Abscheidung einer ultradünnen Kollagenmatrix-Anordnung profitieren.

Protokoll

1. Herstellung der Mutter Soluble Collagen-Lösung

1. Bereiten Sie oder kaufen 200 mg angesäuert, lösliche, Kollagen Typ I aus Rattenschwänzen bei 1-3 mg / ^{15 ml} mit Standard-Isolierung-Protokolle, wie durch Piez et al.
2. Skalieren der Menge des Ausgangsmaterials, bezogen auf das gewünschte Endvolumen modifizierte Kollagenlösungen. Etwa machen 25-30 ml methylierter und 25-30 ml succinylierte Kollagenlösungen, die jeweils auf 3 mg / ml, 200 mg lösliches natives Kollagen.

2. Collagen Methylierung

1. Verdünnen Sie 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern.
2. Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Beachten Sie die Kollagenniederschlag, so dass die Lösung trüb zu werden.
3. Spin down das ausgefallene Kollagenlösung bei 3.000 · g für 25 min. Eine klare, gelartige Ausfällung sollte der Boden der Röhrchen sichtbar. Absaugen und entsorgen der überstehenden Flüssigkeit.
4. Resuspendieren fällte Kollagen in 200 ml Methanol mit 0,1 N HCl und ermöglichen dem Methylierungsreaktion unter Rühren bei RT für 4 Tage auf. Das Kollagen wird nicht auflösen, sollte aber abgesehen in sehr kleine Stücke, die sichtbar die Lösung trübe machen zu brechen.
5. Nach der Methylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die methylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Methanolstand.
6. Auflösen methyliertes Kollagen in 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 & mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 & mgr; l in Schritten von 1 N NaOH.
7. Beurteilen Sie die concentration-Wert der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits Ratten Kollagen oder Hydroxyprolin-Testkit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS.
8. Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die methylierte Kollagen ist.
9. Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat.

3. Kollagen Succinylierung

1. Verdünnen Sie die anderen 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern.
2. Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Das Kollagen muss ausfallen, wodurch die Lösung trüb zu werden.
3. Man löst 40 mg succinic Anhydrid (0,4 mg pro mg Kollagen) in 10 ml Aceton ^(1/20 des Volumens der Kollagenlösung). Langsam (in ca. 0,5 ml-Schritten) diese Mischung zu der Kollagenlösung unter Rühren, während der pH kontinuierlich überwacht. Aufrechterhaltung des pH-Wertes über 9,0 durch Zugabe von 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH der pH-Wert 9,0 nähert.
4. Weiterhin Rühren bei RT 120 Minuten nach Zugabe des gesamten Bernsteinsäureanhydrid in Aceton. Beachten Sie die Lösung klar zu werden, wie die succinylierte Kollagen löst. Den pH-Wert in regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass es über 9,0 bleibt.
5. Einstellen des pH der Lösung auf 4,0 mit 20 ul Schritten von 1 N HCl. Beachten Sie die Lösung trüb wieder, wie die succinylierte Kollagen ausfällt.
6. Nach der Succinylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die succinylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Überstand mit nicht umgesetztem Bernsteinsäureanhydrid.
7. Man löst den succinyliert Kollagenin 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 & mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 & mgr; l in Schritten von 1 N NaOH.
8. Beurteilen Sie die Konzentration der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen Collagen Ratten ELISA-Kit oder Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS.
9. Sterilisieren Sie die succinylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die succinylierte Kollagen ist.
10. Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat.

4. Überprüfung des Collagen Änderungen

1. Bereiten Sie 1 ml-Proben von jedem der nativen, methylierte und succinylierte Kollagenlösungen und mit Wasser auf eine konzentration von 0,1 mg / mit sterilem Reinwasser für die Wasserstoffionen-Titration ml. Weitere verdünnen Puffer mindestens 1000-fach durch Dialyse gegen Wasser durch eine 10 kDa Cutoff membraneusing 3-Lösung Änderungen für jede mindestens 4 Std.
2. Einstellen des pH der Lösungen auf 7,3 mit kleinen Mengen von NaOH und HCl. Verwenden von pH 7,3 als eine willkürliche Referenz, führen Wasserstoffionen-Titration auf jede der Proben, wie durch Tanford ¹⁶ beschrieben, um Titrationskurven für die nativen, methylierte und succinyliert Kollagenlösungen erstellen.
3. Zur Erstellung der pH-Änderung pro Volumen an zugesetzter Säure gegenüber der Anzahl der gebundenen H ^{+ -Ionen} pro Molekül. Der hohe pH-Wert "Amino" Bereich sollte eine Verschiebung in der succinylierte Kollagen in Richtung der Sternpunkt (ein Verlust von Amingruppen) zeigen, und der niedrige pH-Wert "Carboxy" Bereich sollte eine Linksverschiebung im methyliertes Kollagen (ein Verlust von Carboxylgruppen zeigen ) und eine Rechtsverschiebung in der succinyliertes Kollagen (eine Verstärkung in Carboxylgruppes), im Vergleich zur nativen Kollagen.
4. Beurteilen Sie die Wirksamkeit des Succinylierung Reaktion durch die Bestimmung der% der Aminogruppen in der nativen Kollagens durch Succinylierung ersetzt mit dem 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBA) kolorimetrisches Verfahren, nach Standardprotokollen ^17,18.

5. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte und Zellaussaat

1. Fertigen mikrofluidischen Systemen mit Standardverfahren ^9. Verwenden Replik Formen von PDMS aus SU-8 Master auf Silizium unter Verwendung der Photolithographie zur mikrofluidischen Zellkulturkammern mit 100 & mgr; m groß, 0,4-1,5 mm breit und 1-10 mm lange Kanäle für das Zellwachstum zu schaffen definiert.
2. Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Gerätes und einen Glasobjektträger zu oxidieren, und drücken Sie dann zusammen zu binden. Nach der Sterilisierung der Vorrichtung durch Exposition gegenüber UV-Licht für mindestens 30 min, Füllen der Kammer mit 50 & mgr; g / ml Fibronectin in sterilem PBS und Inkubation bei 37 ° C für 45 min.
3. Samen der Vorrichtung mit Zellen, wie primären Ratten oder menschliche Hepatozyten, die ein Kollagen-Gel für die Stabilisierung des Phänotyps oder Differenzierungszustand erfordern. Wir verwenden 20 ul frisch isolierten primären Ratten-Hepatozyten ^7,19 oder handelsübliche kryokonservierten primären humanen Hepatozyten in 14 × ¹⁰ 6 Zellen / ml pro Gerät ausgesät.
4. Lassen Sie die Zellen für 4-6 h zu befestigen, und dann waschen Sie ungebundene Zellen und ersetzen Sie die Plattenmedien mit Wachstumsmedien. Inkubieren Sie O / N, um volle Zelle sicherzustellen verbreiten und eine konfluente Monoschicht von Zellen.

6. Schicht-für-Schicht Kollagenablagerung

1. In einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze, vorzubereiten ausreichenden Mengen methylierter und succinylierte Kollagenlösungen für 10 Anwendungen jeder Lösung pro Gerät, sowie ein paar ml Medium. Bewahren Sie die Lösung auf Eis. Wir verwenden 20 & mgr; l (10-15-fache des gesamten Gerätevolumen) Kollagen pro Schicht pro Gerät.
2. Seinfang mit der methylierten (polykationische) Lösung, alternative Spülen der Geräte mit 20 & mgr; l von methylierten und dann succinyliert Kollagenlösungen, wartet 1 Minute zwischen jeder Anwendung. Spülen Sie das Gerät insgesamt 10-mal pro Lösung, die etwa 20 Minuten dauern sollte. Arbeiten Sie schnell auf der Höhe der Zeit sind die Zellen ohne Medien minimieren.
3. Beobachten Kollagen langsam ansammeln am Einlass / Auslass in Abhängigkeit von seiner Größe. Wenn der Strömungswiderstand erhöht, spülen Sie das Gerät einmal oder zweimal mit Medien, und dann weiter Schichtung.
4. Nach der Anwendung alle Schichten, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und zum Inkubator. Je nach Zelltyp, der extrazellulären Matrix-induzierte morphologische Veränderungen, wie erhöhte Polarisation in Hepatozyten, sollte innerhalb von wenigen Stunden sichtbar.
5. Vorbereitung repräsentativen Vorrichtungen für die Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Standardverfahren, ^{9, um die} Anwesenheit von einer Kollagenmatrix zu überprüfenAnordnung auf der Oberseite der kultivierten Zellen.

7. Die Stabilisierung der Zell-Phänotyp und Funktion

1. Bild der Zellmorphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarität mit Standardmethoden für den Zelltyp. Hepatozyten, Bilder zu sammeln über 14 Tage unter Verwendung der Phasenmikroskopie lebend / tot-Färbung auf Lebensfähigkeit und CMFDA Farbstoff zur apikalen Polarisation, um die Wirkungen des Kollagenablagerung zu demonstrieren.
2. Für Zellmorphologie, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul PBS und Bild das Gerät unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie.
3. Für lebend / tot-Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul von LIVE / DEAD Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie die Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
4. Für Gallen canaliculi Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul 2 uM CMFDA Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie das Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
5. Sammeln der verbrauchten Medien und messen zellulären Stoffwechselprodukte zu geeigneten Zeitpunkten über die Kulturdauer, um die Zellfunktion zu bestimmen. Hepatozyten, messen die Menge von Albumin und Harnstoff in den verbrauchten Medien.
6. Zuführen Endpunktfunktionsanalysen auf den Zellen selbst, wie die Beurteilung Enzymaktivitätsniveaus, Antikörperfärbung oder RNA-Analyse. Für Hepatozyten, zu induzieren und zu messen Cytochrom-P450-Enzymaktivitäten oder Phase-II-Konjugation Enzym Glutathion-S-Transferase.

Ergebnisse

Natives Kollagen kann durch Methylierung und Succinylierung an polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zur Verwendung in Schicht-für-Schicht-Abscheidungs ​​schaffen modifiziert werden. Succinylierung modifiziert die ε-Aminogruppen des nativen Kollagens mit Succinylgruppen und Methylierung modifiziert die Carboxylgruppen des nativen Kollagens mit einer Methylgruppe (1A). Diese Modifikationen der Kollagen-Protein Aminosäure-Seitenketten verändern die pH-Titrationskurven für die Lösungen. Succi...

Diskussion

Ultradünne reinem Kollagen Baugruppen auf geladenen Zellen oder Materialoberflächen mit Layer-by-Layer Deposition von modifizierten Kollagene hinterlegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Methylierung und Succinylierung von nativem Kollagen polykationische und polyanionische Kollagenlösungen (Abbildung 1), die mit der Schicht-für-Schicht-Technik verwendet werden kann, um ultradünne Kollagenmatrix Anordnungen an Zellen (2) zu hinterlegen oder andere geladene erstellen Materia...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagen Typ I, Rattenschwanz	Life Technologies	A1048301	Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen
Kollagen Typ I, Rattenschwanz	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen
Kollagen Typ I, Rattenschwanz	EMD Millipore	08-115	Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen
Kollagen Typ I, Rattenschwanz	R%D Systeme	3440-100-01	Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen-Bernsteinsäureanhydrid
	Sigma-Aldrich	239690-50G	Succinylierungsreagenz
wasserfreies Methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	Methylierungsreagenz
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH-Fällungsreagenz
Salzsäure	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH-Fällungsreagenz
Rattenkollagen Typ I ELISA	Chondrex	6013	Option zum Nachweis des Kollagengehalts
Hydroxyprolin-Assay-Kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT,	Option zum Nachweis des Kollagengehalts
Hydroxyprolin-Assay-Kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	Option zum Nachweis des Kollagengehalts