Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Zusammenfassung

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Zusammenfassung

Verschiedene Gerüste, die im Tissue Engineering verwendet werden, benötigen eine kontrollierte biochemische Umgebung, um die physiologische Zellnische nachzuahmen. Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern (IPC) können für die kontrollierte Abgabe verschiedener biologischer Wirkstoffe wie niedermolekulare Medikamente, Zellen, Proteine und Wachstumsfaktoren verwendet werden. Die Einfachheit der Methodik bei der Herstellung von IPC-Fasern bietet Flexibilität bei der Anwendung für die kontrollierte Verabreichung von Biomolekülen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Einbau von IPC-Fasern in zwei verschiedene polymere Gerüste, hydrophiles Polysaccharid und hydrophobes Polycaprolacton, um ein Mehrkomponenten-Verbundgerüst zu schaffen. Wir haben gezeigt, dass IPC-Fasern leicht in diese Polymerstrukturen eingebettet werden können, was die Fähigkeit zur verzögerten Freisetzung und verbesserten Konservierung von Biomolekülen verbessert. Wir haben auch ein zusammengesetztes Polymergerüst mit topographischen Hinweisen und anhaltender biochemischer Freisetzung entwickelt, die synergistische Effekte auf das Zellverhalten haben können. Verbundpolymere Gerüste mit IPC-Fasern stellen eine neuartige und einfache Methode dar, um die zelluläre Nische nachzubilden.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix hat inhärente biochemische und biophysikalische Hinweise, die das Verhalten der Zellen steuern. Die Nachahmung dieser physiologischen dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung ist eine weit verbreitete Strategie für Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering. Zum Beispiel wurden sowohl natürlich gewonnene als auch synthetische Substrate mit topographischen Hinweisen modifiziert, um die biophysikalische zelluläre Umgebung nachzuahmen. ¹ Zum Beispiel können Polycaprolacton (PCL)-Gerüste leicht strukturiert werden, indem auf gemusterte PDMS-Substrate gegossen wird. ² Die meisten synthetischen Gerüste reka....

Protokoll

1. Herstellung von Polyelektrolytlösungen

1. Reinige Chitosan, wie in Liao et al beschrieben. Kurz gesagt, erstellen Sie eine 1% (w / v) Lösung von Chitosan in 2% (v / v) Essigsäure und Vakuumfilter mit Grad 93-Filterpapier. Neutralisiert das Filtrat mit 5 M NaOH, bis der pH-Wert stabilisiert bis 7. Zentrifugieren Sie das ausgefallene Chitosan bei 1.200 × g für 10 min. Überstand dekantieren und fügen VE-Wasser, um das Chitosan zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritt noch zweimal. Einfrieren der ausgefallene Chitosan bei -80 ° C und lyophilisiere O / N, um die gereinigte Form zu erhalten. Bewahren Sie gereinigte Chitosan in ein....

Ergebnisse

In diesem Artikel haben wir versucht, Verbund Gerüste mit IPC-Fasern für die verzögerte Freisetzung verschiedener Biomoleküle zu schaffen. Eigenschaften der in dieser Studie verwendeten Biomoleküle sind in Tabelle 1 gefunden. IPC Faser wurde in eine hydrophile PD Hydrogel eingebettet ist, um einen PD-IPC Verbundgerüst (1B) zu schaffen. Modellmolekuls BSA wurde zuerst untersucht, um die Durchführbarkeit der Verwendung eines Verbundgerüst zur kontrollierten Freisetzung Biomoleküls zu best.......

Diskussion

IPC Fasern durch die Interaktion von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten gebildet sind. Das Verfahren nutzt die Gewinnung des Komplexes aus der Schnittstelle der Polyelektrolyte, einen Selbstorganisationsprozess für stabile Faserbildung erleichtert wird. Der Mechanismus der IPC Faserbildung sorgt dafür, dass jedes Biomolekül ergänzt in einen ähnlich geladenen Polyelektrolyten während der Komplexbildung eingearbeitet werden. ^10,11 umge Zugabe eines Biomoleküls in die entgegengesetzt geladenen Polye.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pullulan	Hayashibara Inc, Okayama, Japan, Molekulargewicht		(MW): 200 kDa. Bei diesem Material handelt es sich um Pullulan in pharmazeutischer Qualität, das zur Herstellung von Pullulan-Rahmen und PD-IPC-Gerüsten verwendet wird.
Dextran	Sigma Aldrich	D1037	MW 500 kDa. Dieses Material wird von Sigma Aldrich nicht mehr hergestellt. Alternativ wird die Katalognummer 31392 (Sigma Aldrich) vorgeschlagen. Dieses Material wird zur Herstellung von PD-IPC-Gerüsten verwendet.
Natriumbicarbonat	Sigma Aldrich	S5761	Natriumbicarbonat muss langsam zur Pullulan-Dextran-Polysaccharidlösung zugegeben werden. Die schnelle Zugabe von Natriumbikarbonat führt zu Ausfällungen.
Natriumtrimetaphosphat	Sigma Aldrich	T5508	Diese Chemikalie ist hygroskopisch und muss im Entfeuchtungsschrank gelagert werden. Wässrige Lösung von Natriumtrimetaphosphat muss immer frisch gemacht werden.
Natriumhydroxid	Sigma Aldrich	S5881	Dieses Material ist gefährlich und muss mit geeigneter Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhen gehandhabt werden.
Chitosan	Sigma Aldrich	448877	MW 190-310 kDa. Acetylierungsgrad von 75 % bis 85 %. Die Reinigung von Chitosan ist erforderlich, um stabile IPC-Fasern zu erzeugen.
Essigsäure	Merck		Diese kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Dieses Material ist korrosiv und brennbar. Schutzausrüstung wie Gesichtsschutz, Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schuhüberzieher müssen getragen werden, wenn diese Chemikalie im Abzug gehandhabt wird.
Alginsäure-Natriumsalz aus Braunalgen, niedrigviskos	Sigma Aldrich	A2158	Über Nacht in Wasser auflösen. Filtrieren Sie durch steril 0,2  &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch. Bei 4 °C lagern.
Rinderserumalbumin	Sinopharm Chemisches Reagenz		In sterilem PBS auflösen und mit 0,2 & Mikro filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch.
BCA-Assay-Kit	Pierce	23225	Dieses Kit wurde zur Messung der BSA-Freisetzung aus PD-IPC-Gerüsten verwendet.
Humaner rekombinanter vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor	R& D systems	293-VE	Wachstumsfaktor in 0,2%iger Heparinlösung auf eine Endkonzentration von 5  mg/ml.
Heparin-Natriumsalz vom Schwein	Sigma Aldrich	H3393	Dies kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Heparinsalz in sterilem Wasser bei einer Endkonzentration von 1 % auflösen und durch 0,2 & Mikro filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch.
Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC)	Lonza	C2517A	Dieser primäre Zelltyp wurde im Assay zur Bestimmung der VEGF-Bioaktivität nach Freisetzung aus PD-IPC-Gerüsten verwendet.
Alamar blue	Life Technologies	DAL1025	Dies wird verwendet, um die Stoffwechselaktivität von Zellen zu messen. Inkubieren Sie Alamar Blue mit Zellen und halten Sie es 2 bis 4 Stunden lang unter Standard-Zellkulturbedingungen. Messen Sie die Absorption bei 570 nm, um die prozentuale Reduktion von Alamar-Blau zu bestimmen, die mit der Zellaktivität korreliert.
ScanVac Coolsafe Gefriertrockner	Labogene	7.001.200.060	Dies ist ein nicht programmierbarer Gefriertrockner, der bei -105 bis -110  arbeitet °C. Dieser kann durch andere Standard-Labor-Lyophilisierer ersetzt werden.
Polycaprolacton (PCL)	Sigma Aldrich	181609	MW 65 kDa. Diese wird von Sigma Aldrich nicht mehr hergestellt. Diese kann durch die Sigma Aldrich Katalognummer 704105 ersetzt werden.
Dichlormethan	Sigma Aldrich	V800151	Dieser kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Dieses Material ist gefährlich und muss im Abzug gehandhabt werden. Beim Umgang mit dieser Chemikalie muss jederzeit Schutzausrüstung getragen werden.
Polydimethylsiloxan (PDMS; 184 Silikonelastomer-Kit)	Dow Corning	(240)4019862	Das Elastomer-Kit wird mit Polymerbasis und Vernetzer geliefert. Das Mischen der Polymerbasis und des Vernetzers in unterschiedlichen Verhältnissen führt zu einer unterschiedlichen Steifigkeit des PDMS.
Humaner rekombinanter Beta-Nerven-Wachstumsfaktor (NGF)	R& D-Systeme	256-GF	Rekonstituiert in sterilem Wasser mit VE bis zu einer Endkonzentration von 100 μd.M. &Mikro; g⁠/⁠ml. Aliquotieren und lagern in -20 & Grad; C bis zum Gebrauch.
Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC)	Cambrex		Dieser Zelltyp wurde im Assay verwendet, um den synergistischen Effekt von NGF und Nanotopographie zu bestimmen.
Ratte PC12 Phäochromozytom-Zellen	ATCC		Dieser Zelltyp wurde im Neuriten-Outgrowth-Assay verwendet, um die Bioaktivität von NGF zu bestimmen. Messen Sie nach der Exposition gegenüber Freisetzungsmedien mit NGF die Anzahl der Zellen mit Neuritenerweiterungen und normalisieren Sie sie auf die Gesamtzahl der Zellen.
Filterpapier der Güteklasse 93	Whatman	Z699675	Es wird zur Reinigung von Chitosan nach dessen Ausfällung mit Natriumhydroxid bei einem pH-Wert von 7 verwendet.
Schwenkschaufelzentrifuge	Eppendorf	5810R	Zur Verwendung bei der Reinigung von Chitosan mit einer Geschwindigkeit von 1.200 x g.
Motor mit Dorn, der sich mit konstanter Drehzahl dreht	Rhymebus	RM5E	Der Motor wird für die Herstellung von IPC-Fasern auf Pullulan- oder PCL-Rahmen verwendet.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	FirstBase		Sterilize durch Filtration (0,2 &; Mikro; M-Filter) und Autoklav.
Gewebekultur-Polystyrolschale (TCPS) mit 10 mm DurchmesserGreiner			Die TCPS-Schale wird zum Gießen von Pullulanrahmen verwendet.
Humanes VEGF-ELISA-Kit	R& D systems	DVE00	Das ELISA-Kit dient zur Detektion von VEGF im Freisetzungsmedium.
Humanes NGF-ELISA-Kit	R& D systems	DY256	Das ELISA-Kit wird zum Nachweis von NGF im Freisetzungsmedium verwendet.
Kunststoffbeschichtetes Klebeband	Bel-Art	9040336	Das Klebeband dient dazu, die Krokodilklemme sicher auf den rotierenden Dorn zu kleben