Ein screenbaren In-vivo- Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll für den in vivo Nachweis der Wirkungen von mitochondrialen Inhibitoren im Modellorganismus Caenorhabditis elegans und für die Identifizierung potenziell verstärkender Verbindungen beschrieben. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Arzneimittelbibliotheken auf Verbindungen zu untersuchen, die die mitochondriale Funktion modulieren.

Zusammenfassung

Der mehrzellige Modellorganismus Caenorhabditis elegans ist ein kleiner Fadenwurm von etwa 1 mm Größe im Erwachsenenalter, der genetisch und experimentell manipulierbar ist. Es ist wirtschaftlich und einfach in flüssigem Medium zu kultivieren und zu dosieren, wodurch es sich gut für das Screening mit mittlerem Durchsatz eignet. Wir haben bereits die Verwendung von transgenen Luciferase-exprimierenden C. elegans-Stämmen validiert, um eine schnelle In-vivo-Bewertung des ATP-Spiegels des Fadenwurms zu ermöglichen. ^1-3 Hier stellen wir die erforderlichen Materialien und Verfahren vor, um Bioassays mit den biolumineszierenden C. elegans-Stämmen PE254 oder PE255 (oder einem ihrer abgeleiteten Stämme) durchzuführen. Das Protokoll ermöglicht den In-vivo-Nachweis subletaler Wirkungen von Arzneimitteln, die eine mitochondriale Toxizität identifizieren können, sowie den In-vivo-Nachweis potenzieller vorteilhafter Arzneimittelwirkungen. Repräsentative Ergebnisse liegen für die Chemikalien Paraquat, Rotenon, Oxalacetat und für vier Glühwürmchen-Luciferase-hemmende Verbindungen vor. Die Methodik kann skaliert werden, um eine Plattform für das Screening von Wirkstoffbibliotheken auf Verbindungen zu bieten, die in der Lage sind, die mitochondriale Funktion zu modulieren. Die präklinische Bewertung der Arzneimitteltoxizität wird häufig an immortalisierten krebsartigen menschlichen Zelllinien durchgeführt, die ATP hauptsächlich aus der Glykolyse gewinnen und oft tolerant gegenüber mitochondrialen Giftstoffen sind. ^4,5 Im Gegensatz dazu ist C. elegans auf oxidative Phosphorylierung angewiesen, um die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter aufrechtzuerhalten, was eine Parallele zum Menschen zieht und eine einzigartige Gelegenheit zur Bewertung von Verbindungen im physiologischen Kontext eines ganzen lebenden mehrzelligen Organismus bietet.

Einleitung

Der Zweck dieses Verfahrens ist die schnelle Quantifizierung des Energiestatus von C. elegans in vivo im Hinblick auf die mit dieser als ein Endpunkt in Verbindung Screening. Das Grundprinzip ist bei der transgenen Expression der Luciferase in dem Fadenwurm C. basierend elegans ^1-3 über das Plasmid pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862). Die Luciferase-Enzyms zu dem grün fluoreszierenden Protein GFP fusioniert ist und konstitutiv und ubiquitär im Zytoplasma exprimiert (die Luciferase Peroxisomen-Targeting-Signal entfernt wurde). Dies führt zu einer Lichtemission, wenn das Substrat Luciferin wird exogen bereitgestellt. Da die Schnecken transparent ist, kann das Licht in einem Luminometer als relative Lichteinheiten (RLU) gemessen werden. Zellulären ATP-Kraftstoffe der Biolumineszenzreaktion und seine Verfügbarkeit bestimmt die erzeugte Lichtpegel. Folglich bietet Luminometrie eine convenient Mittel zur Bewertung in Bezug ATP-Spiegel und durch die Erweiterung der mitochondrialen Funktion, da die ATP-Produktion erfolgt hauptsächlich in den Mitochondrien. Eine Verbindung zwischen mitochondrialen Funktion und Biolumineszenz Ebenen zuvor durch das Silencing der mitochondrialen Elektronentransportkette Gene und damit einhergehenden reduzierten Lichtleistung gezeigt. ¹

Die Biolumineszenz-Stämme erzeugt wurden PE254 (feIs4) bezeichnet und PE255 (feIs5) ^{1 (siehe} Materialliste) und können untereinander ausgetauscht werden. ³ Eine Reihe von Studien haben diese Sensor-Stämme verwendet werden, um auf die zelluläre ATP-Spiegel in vivo berichten nach Exposition gegenüber verschiedenen xenobiotischen Chemikalien wie Natriumazid ^1, Cadmium ^2, Abwasser Schlammextrakt ^3, 5'-Fluor-2-desoxyuridin ^{6 und eine} tabakspezifische Nitrosamin ^7. Die Stämme sind auch nützlich gewesen, um Auswirkungen der Bestrahlung mit UV-C-Strahlung zu überwachen 8 und Wirkungen der Störung der mitochondrialen Atmungskette. ^1,9 Eine frühe Version Lumineszenzsensor das Luciferase-Gen exprimieren, ohne GFP-Fusion (PE39) wurde ebenfalls in die Untersuchung der Wirkung von Schwermetallen und eines Atmungs verwendet . Entkoppler ¹⁰ Stämme PE254 und PE255 tragen das Luciferase: GFP-Fusions und GFP-Fluoreszenz wurde gezeigt, proportional mit Nematodenmasse zu erhöhen und bietet ein bequemes Mittel zur Normalisierung der Lumineszenz-Werte ^6,9 Die Auswirkungen der Unterschiedsbetrag von Würmern pro Vertiefung kann auch sein. indem mehrere technische Replikate in dem Test (mindestens 5 Vertiefungen pro Bedingung) berücksichtigt. ³

Das Protokoll bietet die Möglichkeit der in vivo-Überwachung von Energieniveaus (im Gegensatz zu technisch umständlich in vitro ATP Bestimmungen) ermöglicht Wirkstoff-Screenings und Neupositionierung im physiologischen Kontext der gesamten multicellular Organismus. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von genetischen Hintergründen durch Kreuzung der chromosomal integriertes Transgen in verfügbar Mutantenstämme und / oder durch Abschaltung von Genen durch RNA-Interferenz verlängert werden; somit unter voller Nutzung der C elegans als Modellorganismus. Das Verfahren soll helfen, Spätphasenausfall von Wirkstoffkandidaten zu reduzieren durch mitochondriale Toxizität und einen Beitrag zur Verringerung der höheren Tierversuche.

Protokoll

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen (Sterilbank) und mit vorab sterilisierten Materialien (durch Autoklavieren 126 ° C, 11 min). Eine LB-Platte mit ausgestrichen E. coli OP50 bei 4 ° C gehalten wird benötigt, streifen out auf frische LB-Platten zu restreak jeden Monat.

1. Die bakterielle Food (Escherichia coli OP50) Herstellung

1. Tag 1 beimpft 2 x 5 ml LB in zwei Universal-Flaschen mit einer Einzelkolonie von E. coli OP50 und Platz im Schüttelinkubator bei 37 ° C (220 rpm) für 8 h.
2. Nach 8-stündiger Inkubation, verwenden Sie 2 ml E. coli OP50 LB-Kultur zu je 3 x 200 ml LB zu inokulieren Ort Kolben in Schüttelinkubator (220 UpM) O / N (17 Stunden) bei 37 ° C.
3. Wiegen 20 x 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schreibgewicht auf dem Schlauch.
4. Tag 2. Mit einem serologischen Pipette aliquote 30 ml O / N E. coli OP50 Kultur in das vorgewogen Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 7.741 xg, 10 ° C, 8 min.
5. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand, halten Sie den Schlauch mit Deckel umgekehrt auf und lassen Sie es für einige Minuten stehen lassen. Mit einer Pipette zu entfernen überschüssiges Überstand, der im Deckel angesammelt haben kann. Wiegen des Rohres und berechnet das Gewicht des Pellets.
6. Berechnen die benötigt wird, um eine Suspension von 30 g / L bereitzustellen, und markieren dieses Volumen an der Rohrvolumens. Datum, Bezeichnung und Ort Röhrchen bei -20 ° C für den Einsatz innerhalb von 1-3 Monaten oder bei - 80 ° C, wenn die Speicherung länger als 3 Monate.
7. Bereiten Bakteriensuspension für den Anbau von Nematoden; ermöglichen Bakterienpellet auftauen und fügen erforderliche Volumen des S Komplettmedium ^11,12 in jedes Röhrchen, Vortex vorsichtig, um Pellet resuspendieren, Pool Inhalte der verschiedenen Rohren, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Arbeiten unter sterilen Bedingungen.

2. Herstellung von Drug Standards in einer 96-Well-Plattenformat

HINWEIS: Bei Verwendung eines Medikamentenbibliothek, sind Drogenplatten an einem einzigen bereitgestelltKonzentration der Verbindung in DMSO. Primärscreening werden Verbindungen in einer einzigen Konzentration zu testen. Anweisungen für die Vorbereitung der Drogenplatte für den Zweitverbindung Tests in einem Bereich von Konzentrationen zwischen 0 bis 160 & mgr; M, nachdem eine statistische Signifikanz bei 10 uM ausgewählt. Die folgenden Schritte können angepasst, um andere Konzentrationen zu testen.

VORSICHT! Folgen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Drogen (im allgemeinen Gesichtsmaske, Schutzbrille, Schutzhandschuhe sind erforderlich).

1. Bereiten Drogenplatte mit Arbeitsnormen für den Zweitscreening: wiegen die erforderliche Menge an Verbindung in sterile 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten 16 mM Verbindung in DMSO (dh konzentrierte 100x relativ zum gewünschten Spitzenkonzentration für die Exposition).
2. Seriell zu verdünnen 16 mM Stamm 1: 2 in DMSO zu erhalten, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,25 mM Standards (steril). Diese sind 100x konzentriert und wird bis auf Endkonzentrationen von 0 (nur Vehikel) verdünnt werden,2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 & mgr; M (in 1% DMSO) während der Arzneimittelexposition.
3. In einer Sterilbank, legen 20-50 ul pro Vertiefung der Verbindung Standards innerhalb einer Spalte einer 96-Well-Platte, zum Beispiel Plattenposition A1: 16 mm, B1: 8 mm, C1: 4 mm, D1: 2 mm, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0.25 mM Wirkstoff und H1: DMSO. Verwenden Sie verschiedene Spalten für Verdünnungsreihe von verschiedenen Drogen.
4. Aliquot Fahrzeug zu den Vertiefungen der Spalte 12 in dem Arzneimittel Platte.
   Hinweis: das Testen von Fahrzeugsteuer Spalten nach unten zusätzlich zu der Prüfung entlang der Zeile H zu erleichtern, so dass Fahrzeug in Positionen repräsentativ für die gesamte Platte getestet.
   HINWEIS: Jedes Medikament Platte für den Zweit Screening hält Verdünnungsreihe für maximal 11 verschiedene Medikamente getestet werden und der Fahrzeugsteuerung.
5. Label und Dichtungsplatte, mit Folie abdecken und Ort bei -20 ° C bis zur Verwendung.

3. Nematode Experimente

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte under sterilen Bedingungen, aseptisch und mit vorher sterilisiert Materialien und Reagenzien. Pflegen C. elegans Stämme routinemäßig auf NGM-Platten mit E. coli OP50. ¹² Vorgeschlagene Zeitpunkte für die verschiedenen Protokollschritte sind in Tabelle 1 angegeben.

1. Tag 1 Aufgabe: bis Flüssigkultur von Biosensor-Stamm für die spätere Synchronisation eingestellt.
   1. Nehmen Sie Nematoden von einem 6 cm NGM Platte (mit viel jungen Larven, wo Lebensmittel ist soeben abgelaufen) in 2 ml S vollständig und zu übertragen, mit 30 g / l E. Kanne coli OP50 in S komplette (Gesamtvolumen 30 ml in einem 250 ml fassenden konischen Glaskolben). Inkubiere 3 Tage lang bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute.
2. Tag 4 Task (gewähren ungefähr 30-35 min): Bleich Kultur, Eier zu ernten und Wurmpopulation zu synchronisieren. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte für 1 min, 600 x g.
   1. Bereiten Sie Bleichmittel-Lösung unmittelbar vor Gebrauch: zu je 16 ml 0,156 M KOH / NaOH 4 ml Bleichmittel.
   2. Gießen Sie 2 x 14 mlWurmkultur in 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Erlauben Würmer durch die Schwerkraft (3 min) zu begleichen. Entfernen und entsorgen Sie Flüssigkeit über siedelt Nematoden. 5 ml Bleichlösung in jedes Röhrchen und starten Timer. Kombinieren Sie Datenträger in einem Rohr.
   3. Kehren Rohr vorsichtig für 2 min, check Stereoskop für das Brechen von Würmern und der Veröffentlichung von Eier in Suspension. Wenn die meisten Eier freigesetzt werden oder an einer maximalen Zeit von 2 min in der Bleichlösung, zentrifugieren.
   4. Überstand entfernen sorgfältig. Waschen Pellet 1x mit 14 ml S vollständig und Zentrifuge.
   5. Überstand verwerfen, 10 ml Bleichlösung und starten Timer (diese zweite Bleichstufe stellt sicher, dass die meisten der Wurm Karkassen zerfallen und nicht mehr unter Stereoskop sehen). Nach einer maximalen Zeit in Bleichlösung von 2 min, Zentrifuge.
   6. Wash Pellet 3x in S abgeschlossen ist, vorsichtig dekantieren Überstand und Pellet in 14 ml S komplett nach jeder Zentrifugation. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Ei Pellet in 14 ml S complete.
   7. Übertragen Sie die Lautstärke auf einen kegelförmigen Glaskolben. Inkubiere 18-24 h bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute.
      HINWEIS: Die geernteten Eiern schlüpfen O / N und Verhaftung Entwicklung bei der ersten Larvenstadium (L1) aus Mangel an Nahrung, damit sie alle auf der gleichen Stufe des Wachstums sein.
3. Tag 5 Aufgabe: bis synchronisiert Wurmkulturen gesetzt für Drogentests.
   HINWEIS: Worms in Hungermedium suspendiert sind in der Regel an hydrophobe Kunststoffoberflächen wie beispielsweise Pipettenspitzen und Rohre entsprechen. 0,01% Tween-20 ist ein Tensid, hier verwendet, um Kunststoffoberflächen übertragen hydrophilere und eine größere Genauigkeit beim Zählen (0,01% Triton-X100 kann auch verwendet werden). Wenn Nematoden sind in der Bakterien ergänzten Medium, sie nicht dazu neigen, den Kunststoffstab.
   1. Bestimmen Sie Anzahl von schraffierten L1 in Kolben, Kolben zu halten beim Schütteln Plattform (160 Umdrehungen pro Minute).
      1. Nehmen Sie 3x 100 ul Proben von Kolben (mit einem sauberen Spitze jedes Mal) in einzelne 1,7 ml Mikroröhrchen mit 900 ul Flüssigkeit medium 0,01% Tween-20.
         HINWEIS: Aspire 100 ul Probe in die saubere Spitze nur einmal. Dann bei der Abgabe, Pipette nach oben und unten ein paar Mal in den zwischen ergänzten Medium, um alle Würmer an der Spitze anhaftenden freizugeben.
      2. Zählen Sie die Nematoden in 4x 10 ul Tröpfchen aus jeder Dreifachverdünnungsröhrchen. Berechnen Sie Mittelwert und schätzen die Zahl der in der konischen Glaskolben vorhanden Würmer.
   2. Berechnen Sie das Volumen des schraffierten erforderlich, um mit 10 Nematoden pro 10 & mgr; l Einrichtung einer 2 x 20 ml-Kultur Nematodensuspension. Erhöhen berechnete Volumen um 10%, für einige nachfolgende Nematodenverlust während Zentrifugationsschritte ausmachen.
   3. (Vorgewogen) dekantieren Volumen in 2 x 15 ml Zentrifugationsröhrchen erforderlich. Wiegen Rohre tatsächliche Volumen verzichtet, Vortex vorsichtig zu erhalten und stellen Sie die Lautstärke, indem überschüssiges Volumen mit einer 5 ml Pipette (nur der sterile Spitze sollte das Rohr geben) zielen.
   4. Make up Volumen bis 14 ml mit frischem S vollständig warh Nematoden. Zentrifuge (1 min, 600 g). Entfernen und entsorgen Sie Stand mit darauf, dass die Nematoden Pellet stören.
   5. 5 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50 zu pelletiert Nematoden. Übertragen die 5 ml in jedem Röhrchen in eine konische Glaskolben mit 15 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50. Notieren Sie sich Zeit Nematoden wurden zuerst mit Nahrung versorgt.
   6. Schüttelkolben sanft (160 rpm), nehmen Sie 9 x 10 & mgr; l Tröpfchen auf Objektträger (mit frischen Spitzen jedes Mal), um Nematoden zählen und zu bestätigen, durchschnittlich etwa 10 (± 2) pro 10 & mgr; l.
   7. Platzieren Nematoden Kolben in Schüttelinkubator bei 20 ° C, 160 Upm für 42-44 Std.
4. Tag 7 Aufgabe: Übertragung Nematoden auf 96-Well-Platten und initiieren Arzneimittelexposition.
   1. Kombinieren Nematodenkulturen in einem einzigen Kolben, halten wirbelnden Kolben vorsichtig und legen Sie 3 x 4 ml Nematodenkultur in 60 ml sterile Trog. Zeigen Trog auf einem Schütteltisch (160 rpm).
   2. Verwenden Sie 8 channel Pipette 25 ul suspendiert Nematoden pro Well von 96-Well schwarze Mikrotiterplatten mit einem flachen transparenten Boden Aliquot (für die Aufnahme sowohl Lumineszenz und Fluoreszenz-Messwerte, oder weiße Platten für Lumineszenz-only). Deckel mit Deckelplatte und beiseite stellen.
      1. Nach oben von je 2 Platten setzen, stellen weitere 2 x 2,5 ml Nematoden im Trog, um verlorene Volumen zu ersetzen (halten Sie einen "Totvolumen" in Rinne von ca. 7 ml).
      2. Bis 13/14 Platten mit Nematoden gesetzt. 11 Nematodenplatten werden benötigt, um zwei 96-Well-Platten Medikament testen. Der ^12. Nematodenplatte wird ausschließlich mit Fahrzeug als eine Steuerung geladen werden. Die ^13. Platte wird verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz am Tag 8 (siehe unten) festzulegen. Eine zusätzliche Platte für den Einsatz vorbereitet werden sollen Fehler bei der Einrichtung auftreten.
   3. Aliquot 74 ul S komplett in jede Vertiefung und Ort Platte in einer feuchten Kammer (siehe Materialliste) in einem Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) until bereit aliquoten Testverbindungen an der vorgewählten Entwicklungszeit (zB 45 h 30 min nach Essen zur Verfügung gestellt). [Volume pro Vertiefung ist jetzt 99 & mgr; l].
   4. Auftauen Drogenplatte (n) zu testen.
   5. Verwenden Sie Mehrkanalpipette um Nematodenplatten mit Drogen Einrichten, Ändern Spitzen jedes Mal. Erhalten Sie 5 min pro Platte mit 96 Vertiefungen für die Aliquotierung Droge.
      1. Nehmen Sie 1 ul ^vom 1. Säule der Drogenplatte und in den Spalten 1-5 von einer Platte, die Nematoden; wiederholen ^vom 2. Spalte in der Drogenplatte in Spalten 8-12 der Platte, die Nematoden. 1 ul Fahrzeug Spalten 6 und 7 der Nematode Platte.
         Hinweis: 100-Verdünnung der Verbindung / Fahrzeugs: Das Gesamtvolumen pro Vertiefung in dem Fadenwurm Platte werden 100 & mgr; was zu einem 1 sein.
      2. Wiederholen Sie den Vorgang durch Zugabe von 1 & mgr; l ^des 3. / ^{4-ten Spalte} des Medikaments Platte, um Spalten 1-5 / 8-12 des zweiten Fadenwurm Platte; Fahrzeug in den Spalten 6 und 7 des Fadenwurms Platte.
      3. Weiter zum übrigen Drogenbodenkolonnen zu testen. Richten Sie ein Minimum von einem Nematoden Platte mit Fahrzeug in alle Vertiefungen durch Abtasten von Spalte 12 der Arzneimittelplatte. Platz Platten zurück in feuchten Kammern im Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) für 20 bis 22 h (siehe Hinweis für Tag 8).
   6. Part-Vorbereitung der Lumineszenz-Puffer zum nächsten Tag: add DMSO und 10% Triton-X-100 auf das erforderliche Volumen des S vollständig auf 1% DMSO und 0,15% Triton X-100 zu erhalten. Lassen Sie 5 ml pro Platte Lese für Lumineszenz, plus 1 ml zur Grundierung Luminometer Injektor.
5. Tag 8 Aufgabe: Lesen experimentellen Endpunkten - Fluoreszenz und Biolumineszenz. (GFP Fluoreszenzmesswerte werden als ein Mittel, um Daten zu normalisieren Biolumineszenz empfohlen).
   HINWEIS: Richten Sie den Endpunkten von 66-67 Stunden nach dem Essen zu lesen, um Nematoden, um signifikante Nachkommen Produktion unter den beschriebenen Versuchsbedingungen zu verhindern.
   1. Richten Sie Platte, die als Hintergrund Steuerung für GFP Messwerte zu verwenden. Combine auch Inhalte ^vom 13. Platte in eine 15-ml-Tube. Erlauben Nematoden zu begleichen (2-3 min). Verwenden Sie Überstand, um eine Mikroplatte (schwarz mit transparentem Boden) mit 100 ul Bakteriensuspension pro Vertiefung zu laden.
      1. Beachten Sie Hintergrundsteuerplatte unter Mikroskop notieren Brunnen, wo Nematoden zu sehen. Auszuschließen diese vom Hintergrundschätzung in nachfolgenden Datenanalyse verwendet.
   2. Lesen Fluoreszenz jeder Platte mit 96 Vertiefungen, einschließlich der Hintergrundsteuerung. (Einstellungen: Optik von der Unterseite der Platte; Filter 485/20 Anregungs; 528/20 Emissions.)
   3. Bereiten Puffer für Lumineszenz-Messungen: add Luciferin (20 mM) auf Teil vorbereitet Puffer (vom Vortag), Lumineszenz-Puffer mit 1% zu erhalten DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) und 0,3 mM Luciferin (3x ). Prime Luminometer Injektor 6x mit 150 ul Puffer Lumineszenz.
      1. Vorheriger Schritt wird davon ausgegangen 1% DMSO als Fahrzeug während Arzneimittelexposition. Als Vehikel Wasser ist, stellen Sie die Zusammenarbeitncentration DMSO in Lumineszenz-Puffer auf 3% (dh 3 ×).
   4. Arbeiten mit einer Platte zu einem Zeitpunkt. Dispense 50 ul Lumineszenz Puffer pro Vertiefung. (150 & mgr; l Endvolumen in gut; 3x Verdünnung von Lumineszenz-Puffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 und 0,1 mM Luciferin Endkonzentrationen.) Unmittelbar am Bewegungstisch und starten Timer.
      1. Nach 3 min auf Schütteltisch (160 rpm), lesen Sie Lumineszenz (1 Sekunde pro Messung).

4. Datenanalyse

1. Subtrahieren durchschnittliche GFP Hintergrund Lesen von Fluoreszenz Ergebnisse. Teilen Sie Biolumineszenz durch entsprechende GFP Lesen.
   1. Wenn eine hohe GFP-Wert wird für Nematoden in eine Verbindung ausgesetzt detektiert messen Fluoreszenz der Verbindung auf ihren eigenen, für jede Verbindung, Fluoreszenz zu berücksichtigen. Wenn höher als der Durchschnitt, verwenden Sie diese als Hintergrund statt.
2. Express Biolumineszenz, GFP normalisierten Biolumineszenz einnd GFP-Fluoreszenz-Daten als Prozentsatz des Durchschnittswerts für die Fahrzeugsteuerung in jeder Platte.
3. Plot Durchschnittswerte und Fehlerbalken für jede Konzentration.
4. Test auf statistische Signifikanz unter Verwendung von 2-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Wirkung von 'Konzentration', 'Experiment' und ihre Wechselwirkung (jeder Datenpunkt bezieht sich auf eine einzige gut), und verwenden Sie den Dunnett-Test als post-hoc-Test (vs . Fahrzeugsteuerung).
   HINWEIS: Wenn das "Experiment" oder die "Interaktion" Begriffe sind signifikant, können weitere Experimente erforderlich, um Antwort zu bestätigen. Wo keine Variabilität zwischen Experimenten ist aus der Beobachtung der Datengrundstücke ersichtlich ist, kann ein Einweg-ANOVA auf gepoolten Daten aus unabhängigen Experimenten durchgeführt werden.
   1. Für die statistische Analyse der Platte (n) nur mit Fahrzeug, wählen Sie alle Vertiefungen in den Spalten 6 -7 und alle Vertiefungen in der Reihe H als Kontrollgruppe (das sind die Positionen während Verbindung Tests routinemäßig Fahrzeug zugeordnet).

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse, um das Verfahren zu veranschaulichen wurden Rotenon (Abbildung 1), Paraquat (Abbildung 2), Oxalacetat (Abbildung 3) und 4-Verbindungen, die sich als Leuchtkäfer-Luciferase-Hemmer im Screening einer Medikamentenbibliothek ¹³ (Figur 4) aufgenommen wurden erhalten. Das Medikament Exposition wurde auf der L4-Stadium in allen Fällen begonnen, aber die Paraquat Exposition Experimente wurden bei 41 h begann nach dem Essen als erster Nematoden zur Verfügung gestellt im Vergleich zu 45-46 Stunden für die anderen Verbindungen. Das Protokoll ermöglicht eine Flexibilität bei der Auswahl der Zeit für die Initiierung der Exposition und der Belichtungslänge. Zu Screening-Zwecken, Untergangszeiten sollten eingehalten werden, wenn ausgewählt, für die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten werden. Endpunkte sollte von 66-67 h Entwicklungszeit, um umfangreiche Eiablage und Schlüpfen der Nachkommen in den Vertiefungen zu verhindern, gemessen werden. Richtlinien für die Zeitpunkte sind in T bereitgestelltLage 1.

Rotenon, einem mitochondrialen Komplex I-Inhibitor, verringert Biolumineszenz, nachdem beide relativ kurz (2 h) und längere Belichtungszeiten (24 h), um einen Bereich von Konzentrationen (Abbildung 1). In diesem Fall wurden keine GFP Messungen vorgenommen, aber die Anzahl der technische Replikate verwendet (n = 6) ist ausreichend zu glätten irgendwelche Unterschiede in Wurmzahlen zwischen ^Wells 3. Die 24-Stunden-Exposition ist ein Fenster der Zeit, über die Nematoden zu wachsen, und langsamere Entwicklung als Folge der komplexen I Hemmung wurde erwartet, dass sie auf den Rückgang der Biolumineszenz beizutragen. Dies wurde durch visuelle Beobachtung unter Stereoskop mit verzögerter Entwicklung angesehen, insbesondere bei Konzentrationen von 20 uM und darüber bestätigt; zusätzlich einige Letalität von 40 & mgr; M bemerkt (qualitative Beobachtungen nicht quantifiziert). Kein Letalität wurde nach 2 h Exposition beobachtet, die jedoch Auswirkungen auf die Schneckenbewegung beobachtet. Ein starker Rückgang der Biolumineszenz relativ zu Kontrollen OCCUbei der niedrigsten Konzentration von Rotenon Rred getestet 2,5 um, für die Effekte wurden nicht einfach durch schnelle visuelle Beobachtung bei 2 St. Exposition erkannt. Dieser Rückgang der Biolumineszenz ist konsistent mit reduzierten zellulären ATP. Maximale Hemmung wurde mit der niedrigsten Konzentration von Rotenon verwendet (2,5 uM), die anzeigt, dass alle nachfolgenden Experimente gezielt Rotenon sollte zwischen 0 und 5 & mgr; M [der Konzentrationsbereich 0-160 uM durchgeführt werden erzielt wurde als Teil eines Vergleichs mit anderen Arzneimitteln ausgewählt zunächst als erhebliche Auswirkungen bei 10 uM identifiziert (an anderer Stelle veröffentlicht)].

Das Herbizid Paraquat wirkt mitochondrialen Funktion durch Erhöhung von reaktiven Sauerstoffspezies. Hier, auf Biolumineszenz von C. zeigen wir seine Wirkung elegans Stamm PE254 nach Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen über 24 Stunden (Abbildung 2). Als der Stamm trägt eine luc :: GFP-Fusions, GFP-Fluoreszenz wurde also als Mittel zur Normalisierung gemessen. ^6,9 Paraquat verringert Biolumineszenz GFP-Fluoreszenz und normalisiert Biolumineszenz bedeutend. Dunnet die post-hoc-Test zeigte, daß die Konzentrationen von Paraquat mit signifikanten Unterschieden in Bezug auf die Fahrzeugsteuerung wurden 4 und 8 mm für Biolumineszenz und normalisiert Biolumineszenz sowie 2 mM für normierte Biolumineszenz. Die einzige Konzentration GFP-Fluoreszenz signifikant reduziert war 8 mm, eine Konzentration, bei der Wachstumseffekte und die gelegentliche toten Wurm wurden (qualitative Beobachtungen) zu sehen. Die Abnahme der Biolumineszenz (und normalisiert Biolumineszenz) größer war als die der Fluoreszenz, die mit verringerten mitochondrialen Funktion und Auswirkungen auf die ATP-Produktion.

Der Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat auf C getestet elegans-Stamm PE254 bei einer einzigen Konzentration von 8 mM, führte zu einer Zunahme der Biolumineszenz (Abbildung 3). Kein GFP fluoreszierennce Messungen erhalten wurden oder zusätzliche visuelle Beobachtung durchgeführt wird; aber solche Reaktion auf einen einzigen Zusammenschluss weitere bestätigende Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen, und detailliertere Beobachtungen von Effekten zu verdienen. Eine Verbesserung der Biolumineszenz durch diese Verbindung ist nicht überraschend, da sie postuliert, dass eine größere Aktivität des Zitronensäurezyklus führen, wobei letztendlich größere Produktion von ATP (werden dennoch wäre es ratsam, für alle Auswirkungen auf die Luciferase-Niveaus durch die Beurteilung GFP-Fluoreszenz zu steuern In nachfolgenden Experimenten). Die angegebenen Oxalacetat Datensätze zeigen das Ausmaß der Variabilität in Reaktion auf Luciferase-basierte Experimente gesehen. Nach unserer Erfahrung diese Variabilität ist eine Funktion des Testsystems vor allem für weniger schädlich Expositionsbedingungen.

Die Glühwürmchen-Luciferase-Inhibitorverbindungen DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 und DDD00023047 wurden sowohl in vitro, indem du Auswirkungen auf den pu getestetrified Enzym und in vivo unter Verwendung des C. elegans luc: GFP-Stamm,. Es gab keinen Beweis, daß irgendeiner der getesteten Verbindungen verursachte Nematoden Tod unter den Belichtungsbedingungen. Alle 4 Verbindungen beeinflußt, die die Luciferase-Aktivität in vitro auf die 2 Konzentrationen getestet 25 und 100 um (4A). DDD00001434 tötete die Aktivität des gereinigten Luciferase fast vollständig, die eine glaubwürdige Begründung für die große Rückgang der in vivo Biolumineszenz (4B) zur Verfügung gestellt. Obwohl die in vitro und in vivo-Tests nicht direkt vergleichbar sind, die Antwort auf DDD00023047 war in beiden Assays. DDD0001477 und DDD00000635 verursacht einen größeren Rückgang in vivo als in in vitro. Diese Verbindungen wurden in den lebenden Würmer 22 Stunden vor dem Luciferin-Substrat bereitgestellt, und die Ergebnisse können zu reflektieren, dass sie nicht leicht aus der Luciferase aktiven Stelle verschoben, wenn Luciferin wurde avaiEtikett vorzeigen. Alternativ DDD0001477 und DDD00000635 kann eine zusätzliche Wirkung auf die zelluläre ATP-Spiegel. Dies müsste durch die Glühwürmchen-Luciferase an keine beurteilen. Bemerkenswert war die starke Verbesserung der GFP-Signal in Live-Würmer DDD00000635 Verbindung ausgesetzt. Dies wird nachfolgend erörtert.

Abbildung 1. Die mitochondriale Komplex I-Inhibitor Rotenon verringert den Energiestatus von C. elegans durch Biolumineszenz-Stamm PE254 gemessen. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 Stunden nach dem Essen um Larven L1 vorgesehen) auf 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 uM Rotenon in 1% DMSO für 2 frei hr (kurz) oder 24 Stunden (Langzeitbelichtung) vor Lesungen der Biolumineszenz jeweils in 48 und 69 h Schnecken Entwicklung nach dem Essen zur Verfügung gestellt. Biolumineszenz (Einheit relativen Lichteinheiten, RLU) wurde als Prozentsatz des Fahrzeugs (1% DMS exprimiertWerte O). Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen an jedem Rotenon Konzentration (n = 6). Alle getesteten Konzentrationen führte zu einer statistisch hochsignifikant Differenz zur Vehikelkontrolle (p <0,001).

Abbildung 2. oxidativen Stressor Paraquat verringert den Energiestatus von C. elegans-Stamm PE254 in einer konzentrationsabhängigen Weise (durch Biolumineszenz gemessen). Synchronized L4-Stadium Würmer (der Einfachheit halber im vorliegenden Fall auf 41 Stunden nach dem Essen um L1-Larven zur Verfügung gestellt) wurden auf 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 oder 8 ausgesetzt mM Paraquat 24 h. GFP-Fluoreszenz (Einheit relativen Fluoreszenzeinheiten, RFU) wurde verwendet, um Biolumineszenz-Daten (Einheit RLU), beide Endpunkte bei 65 Personalentwicklung erhalten normalisieren. Daten sind als Prozentsatz der Kontrollgruppe (1% DMSO) ausgedrückt. Fehlerbalken zeigen SEM von technischen Replikaten(n = 5 für verschiedene Konzentrationen; n = 18 für die Kontrollen). Einweg-ANOVA: *** p <0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung.

Abbildung 3. Die Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat (8 mm) verstärkte die Biolumineszenz von C. elegans Stamm PE254. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 h nach Nahrung zu L1-Larven zur Verfügung gestellt) ausgesetzt waren frisch zubereitet 8 mM Oxalacetat 18 h ± 30 min. Biolumineszenz (Einheit RLU) wurde bei einer Entwicklungszeit von 63,5 h ± 1 h lesen und wurde als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt Fahrzeug (ddH _{2 O).} Verschiedene Spalten stellen verschiedene Datensätze von 8 technische Replikate auf verschiedene Platten mit 96 Vertiefungen in dem gleichen Experiment zugeordnet. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). 2-Wege-ANOVA mit "set" und "Konzentration" als Faktoren: ̵6; Set 'p> 0.05, "Konzentration" p <0,001 und Interaktionsterm p> 0.05.

EIN

B

Abbildung 4. Prüfung der Antworten auf 4 Verbindungen aus der Dundee Wirkstoffforschung Verbindungsbibliothek ¹³ (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 und C4: DDD00023047) mit bekannter Hemmaktivität auf Glühwürmchen-Luciferase-Lumineszenz. (A) Wirkung von Verbindungen auf die Aktivität der gereinigten Glühwürmchenluciferase (gemessen als Lichteinheiten, RLU), ausgedrückt als Prozentsatz der Fahrzeugsteuerung. Der ATP-Biolumineszenz CLSII Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen mit der gleichen Menge an Luciferase-Enzym in die Vertiefungen (weiße 96-w aliquotiert verwendetell Mikrotiterplatten). ATP wurde zu einer Endkonzentration von 10 uM und 1 ul der Verbindung vorgesehen (Endkonzentration angegeben) oder DMSO (1%) zugegeben. Lumineszenzsignal wurde 10 sec integriert. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 4). Analyse: one-way ANOVA; * p <0,05 bzw. *** p <0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. Unterschiede zwischen 25 und 100 & mgr; M von großer Bedeutung für C1 (DDD00001434; p <0.001) und eine signifikante für C2 und C3 (jeweils DDD0001477 und DDD00000635; p <0,05). (B) In-vivo-Messungen der Biolumineszenz, Biolumineszenz normiert auf GFP-Fluoreszenz und GFP-Fluoreszenz von C elegans Stamm PE254 mit 67 h Entwicklungszeit nach Exposition mit Testverbindungen für 22 Std. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). Die statistische Analyse (Ein Weg-ANOVA) durchgeführt auf gepoolten Daten aus drei Datensätzen (3 xn = 8). * p <0,05 bzw. *** p <0,001 in Bezug auf jeweilige Fahrzeugsteuerung. Differences zwischen 25 und 100 uM nur statistisch signifikant (p <0,05) für normierte Biolumineszenz nach Einwirkung C4 (DDD00023047).

Uhrzeit	Tag 1	Tag 2	Tag 3	Tag 4	Tag 5	Tag 6	Tag 7	Tag 8
9-10								Schritt 5
10-11								Schritt 5
11-12							Schritt 4	Schritt 5
12-13							Schritt 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Schritt 1				Schritt 3
17-18
18-19				Schritt 2

Tabelle 1 Übersicht über die Protokollschritte, die an jedem Tag der Nematoden Experimenten (Abschnitt 3) durchgeführt werden und schlug Timings.

Diskussion

Der Modellorganismus C. elegans stellt ein leistungsfähiges experimentelles System. Es ist leicht, Kultur und produziert reichlich genetisch identische Nachkommen mit einer 3,5 Tage Lebenszyklus vom Ei bis zum Reproduzieren Erwachsenen (über juvenile Larvenstadien L1 bis L4). Aufgrund seiner geringen Größe, kann es bequem in 96-Well-Platten gezüchtet werden, die Erleichterung Substanz-Screening. Wir präsentieren eine phänotypische Screening-Protokoll basierend auf Stämme von C. elegans, die als in vivo Sensoren von Energieniveaus dienen. ¹⁴ Das Protokoll ist anwendbar auf jedes Labor, obwohl eine 96-Well-Platte Luminometer und einem sterilen Gehäuse ist nicht notwendig. Es ist wichtig, um eine Kontamination in Assays durch die Verwendung eines Labortechnik verhindern. Wenn sie manuell arbeiten, ist die maximale Anzahl der Nematodenplatten erzielbare 13 pro Versuch ermöglicht die Prüfung von 2x 96-well Platten Medikament ist und zwei Fahrzeug-Platten. Repräsentative Ergebnisse sind für die mitochondriale Komplex I Inhibitor Rotenon vorgestellte, die Superoxid-Generator Paraquat, dem Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat und vier Verbindungen mit bekannten Leuchtkäfer-Luciferase-inhibitorische Aktivität. Die ersten beiden Verbindungen führte zu einer Abnahme der Biolumineszenz wie vorherwohin Oxalacetat führte zu einer Verbesserung, eher von größer Erzeugung von ATP führen. Die Oxalacetat Datensätzen auch die intrinsische Variabilität bei Experimenten basierend auf Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu demonstrieren. Ein Minimum von drei unabhängigen Experimenten sind ratsam, um die Robustheit der Antworten auf nicht bekannten Verbindungen festzustellen.

Inhibition der Firefly-Luciferase-Aktivität war erkennbar mit einem in vitro-Assay unter Verwendung eines kommerziellen Kits. ³ Eine der Verbindungen führte zu einem erheblichen Anstieg der GFP-Fluoreszenz, die mit dem Inhibitor die Erhöhung des Niveaus der GFP-markierten Luciferase durch Bindung an das Luciferase-Enzym die aktive Stelle und macht sie stabiler. ¹⁵ In einigen Fällen(in diesem besonderen Fall) kann dies zu erhöhten Werten von Biolumineszenz ¹⁵ führen, wenn der Inhibitor durch überschüssiges Substrat verschoben wird. Es ist daher wichtig, nicht zu Ergebnissen irrtümlich aus Verbindungen, die mit dem Glühwürmchen-Enzyms in Wechselwirkung zu interpretieren, wie verringerte oder erhöhte ATP-Spiegel / Funktion der Mitochondrien. Veränderungen in Lumineszenzsignal korrelieren oft mit zusätzlichen Messungen der Gesundheit wie Bewegung, Entwicklung und Wachstum. Als ein Beispiel, ist eine Verbindung, ein Verdächtiger Luciferase-Inhibitor, wenn ein dramatischer Rückgang der Biolumineszenz-Signal erkannt wird, aber Würmer sind nicht von Kontrollen durch mikroskopische Beobachtung. Eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz, nicht durch das Wachstum oder die Autofluoreszenzverbindung erläutert, kann auch auf eine Inhibitor. Eine Anzahl von Luciferase Inhibitoren ¹⁵ sind bekannt und wurden in PubChem eingegeben. Daher in erster Linie ist es gute Praxis, Informationen über Luciferase Inhibitoren durch PubChem gehalten zu konsultieren; gefolgt von testing der Wirkungen der Verbindung in in vitro-Tests mit dem gereinigten Enzym ^{3 und /} oder die Bestätigung von Wirkungen auf die Funktion der Mitochondrien durch zusätzliche Mittel. ^16,17

GFP-Fluoreszenz-Messungen ermöglichen die Erkennung von Glühwürmchen-Luciferase-Ebenen (und das Potenzial Nachweis einiger Luciferase-Enzym-Inhibitoren, wie oben erörtert) machen ein starkes Argument für die Messung dieser Endpunkt neben Biolumineszenz, soweit möglich. Normalisierung der Messwerte auf Biolumineszenz GFP ist auch ein Mittel zur Berücksichtigung der Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Vertiefungen (obwohl dies auch durch Einschluss von mehreren technischen Wiederholungen erreicht werden). Zu einer höheren Empfindlichkeit, ist es wichtig, um Hintergrundfluoreszenz von den Messungen subtrahiert. Das Protokoll beurteilt Beitrag der Bakteriensuspension auf die Hintergrund-Fluoreszenz jedoch Nematodenautofluoreszenz ist nicht für (eine Begrenzung der Strom Assay für jede Alterungs stu besonders kritisch entfielenstirbt da Nematoden Autofluoreszenz steigt mit dem Alter). Autofluoreszenz der Testverbindungen sollten auch parallel bewertet werden. GFP Normalisierung scheint unverzichtbar, wo Forscher wollen Protokoll anzupassen, um zelluläre ATP-Pools in verschiedenen genetischen Mutanten oder nach dem Schweigen der verschiedenen Genen zu vergleichen, um für Dehnungsunterschiede auf dem Niveau der Expression des Transgens Biolumineszenz steuern.

Kritischen Parameter innerhalb des Protokolls sind die Entwicklungsstufe, bei der Belichtung initiiert wird, der Dauer der Einwirkung und Erhalten ähnliche Anzahl von Nematoden in verschiedenen Vertiefungen. Die Belichtung kann in jedem Stadium der Entwicklung der Nematoden L3 Stadium beginnen jedoch älter ist vorzuziehen. Von diesem Zeitpunkt an, Nematoden sind abhängig von der oxidativen Phosphorylierung für die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter, wie durch einen sehr deutlichen Anstieg der mtDNA Gehalt, Sauerstoffverbrauch und ATP-Spiegel zeigt. ^18,19,20 Das vorliegende Protokoll initiiert Ausstellungenure im L4-Stadium. Der Grund für das Aliquotieren von Nematoden auf 96-Well-Platten in diesem Stadium nur (und nicht, wenn sie zum ersten Mal mit der Nahrung im L1 Stufe vorgesehen ist), ist, dass obwohl Platten in feuchten Kammern angeordnet, um Verdampfung zu minimieren, eine Verdampfungsgrad noch auftritt unsere Schüttelinkubator, wie sehr kleine Tröpfchen bilden auf den Deckeln zu sehen (das kann nicht ein Problem mit anderen Schüttelinkubatoren sein). Aliquotieren von Nematoden, Platten unmittelbar vor der Zugabe von Arzneimittel-Standards, dem eigentlichen Wirkstoffkonzentration nicht durch irgendeine kleine Veränderung des Volumens durch Verdunstung beeinflusst wird. Laden eines Nematodenplatte mit dem Vehikel allein ist sinnvoll, zu prüfen, ob Nematoden wurden gleichmäßig zwischen Vertiefungen verteilt. Signifikante Unterschiede für das Fahrzeug nur Schild wäre bezeichnend für schlechte Technik werden bei der Abgabe die Nematoden in die Vertiefungen.

Die Belichtungsdauer ist ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Wenn Auswirkungen auf den Energiestatus unabhängig von Wachstum sind von Interesse, die Pro-Protokoll modifiziert werden, um kürzere Expositionen (fast unmittelbaren Reaktionen auf, zum Beispiel, 2 h) unterzubringen. Auf der anderen Seite, Eintrag von Verbindungen in C. elegans Geweben kann einige Zeit dauern. Beispielsweise 12-24 h erforderlich sind, um maximale innere Konzentrationen von Resveratrol und 5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUdR) zu erreichen. ²¹ daher eine längere Belichtungszeit (18 bis 24 h) kann gerechtfertigt Belichtungspegel zu maximieren. Die Belichtungszeit sollte auf Zeiten, in denen nicht ein erhebliches Maß an Wiedergabe, um Platz in der gut zu nehmen beschränkt werden. Wir empfehlen, dass die Gesamtentwicklungszeit von Nematoden unter 66-67 h gehalten. Obwohl praktisch, sind Nematoden bis dahin trächtig und haben Eiablage begonnen. Dennoch fanden wir Biolumineszenz-Messwerte von Eierzubereitungen vernachlässigbar zu sein (nicht dargestellt). Die sur-5-Promotor gesteuerte Expression des Transgens zuerst erkannt nur zwei bis zweieinhalb Stunden nach der Befruchtung bei der 100-Zellstadium ^{22 und der} chitinous Eierschale ist wahrscheinlich, um den Eintritt von Luciferin zu begrenzen. Andere haben festgestellt, dass embryonierten Eiern nicht wesentlich dazu beitragen, den Stoffwechsel von schwangeren Erwachsenen. ²³ jedoch zu vermeidende Bedingungen, die für bedeutende Nachkommen Produktion sind. Falls gewünscht, kann der experimentellen Zeitskala wieder verschoben werden: Wir haben zuvor initiierten Exposition gegenüber einem Umweltgift am späten L3 Larvenstadium (36 hr) und aus Biolumineszenz und GFP-Messungen bei 55 h durchgeführt ² Alternativ genetischen Hintergründen, die bedingt steril sind. kann verwendet werden, um Nachkommen Produktion zu verhindern, wie zum Beispiel die fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV-Doppelmutante, die bei 15 ° C gehalten werden kann, ist aber sterile bei 25 ° C. ^24. Die Verwendung von FUDR zur ​​Sterilität induziert wird nicht empfohlen, da dies kann selbst betreffen Nematodenstoffwechsels. ^25. Der Test konnte auch in Stämmen mit permeabler cuticles wie partielle Verlust-Funkt geführt werdenIonen-Bus-8-Mutanten, die Multidrug-sensitive aufgrund Lässigkeit von Medikamenten zu erhöhen. ²⁶ Dies wird kürzere Belichtungen und niedrigere Verbindungskonzentrationen erleichtern. Die Bedingungen für das Hinzufügen von Luciferin zu diesen Nematoden müssen möglicherweise auch Anpassung dh 1% DMSO und 0,05% Triton-X100 in der Lumineszenz-Puffer kann nicht verlangt werden Luciferin Verfügbarkeit zu verbessern.

Das Protokoll verwendet 1% DMSO als Vehikel für Verbindung Lieferung. Obwohl nicht tödlich, diese Konzentration des DMSO hat einige biologische Wirkungen, wie wir in einer früheren ^{Veröffentlichung.} 3 diskutiert Viele der verfügbaren Medikamentenbibliotheken werden in 100% hergestellt DMSO, bei Konzentrationen, die nach Verdünnung Fahrzeug für zellbasierte Assays sein wird bis 0,1%. Höhere Konzentrationen der Verbindung erforderlich sind, um Antworten in C hervorzurufen elegans, wenn sie mit menschlichen Zellen, so daß es oft nicht möglich, Tests bei weniger als 1% DMSO durchzuführen, verglichen. Wiederum ist die Verwendung von Stämmen mitlässiger Nagelhaut kann auf die Prüfung mit geringeren Konzentrationen von Fahrzeug zu führen. Konzentrationen von DMSO von über 1% sind nicht zu empfehlen.

Eine Reihe Inkubationszeit mit Luciferin vor Lesungen sollten eingehalten werden. Seinen Maximalpegel innerhalb der zweiten Minute, wie zuvor gezeigt, erreicht Lumineszenz nach Zugabe von Luciferin, relativ stabil bleibt für die ersten 5 min, gefolgt von einer langsamen Abnahme der Lumineszenz schrittweise über die nächsten 30 ^min 1. Kinetischen Antworten auf eine bestimmte Chemikalie kann während dieser ersten Phase von 30 min nach der anfänglichen Dosierung von Luciferin durchgeführt werden.

Das Protokoll beinhaltet eine Hungersnot Schritt nach der Entnahme von Eiern, um die Synchronisation der Nematodenpopulation zu erreichen. Wir empfehlen Synchronisation von Nematodentest Populationen seit verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden sich in zellulären ATP-Spiegel und können unterschiedlich auf die Testverbindungen zu reagieren. Durch die Durchführung der Hunger in S KomplettMedium gegenüber M9 werden die Brut Nematoden mit einer Kohlenstoffquelle (Ethanol) ^27,28 versehen, so daß Larven entwickeln sich nicht, sind aber nicht vollkommen ausgehungerte. Es hat sich auch gezeigt, dass L1 verhaftet sind für eine schnelle Reaktion auf Lebensmittel grundiert und normale L1 Wachstumsrate wird innerhalb von 3 Stunden nach dem Essen zur Verfügung steht ²⁹ jedoch die Möglichkeit erreicht., es, dass der Hunger-Schritt kann den Stoffwechsel von C. ändern elegans kann nicht ausgeschlossen werden. ³⁰ Aus diesem Grund ist die Länge des Hungers sollte 24 Stunden nicht überschreiten (18 Stunden ist ausreichend für die Synchronisation). Einige Labors haben die Möglichkeit, mit Hilfe eines Copas Biosorter für Alter Synchronisation Umgehung des Hungers Schritt ganz. Andere Laboratorien können eine Präferenz für die Erweiterung des Nematodenpopulation auf festen Medien (NGM-Platten mit OP50) vor dem Bleichen (Schritt 3.1) haben, und das wird auch gut funktionieren. Wir verwenden S Medium während der Verbindung Exposition als Standardmedium für Nematodenkultivierung, however andere Medien ausgewählt werden, zum Beispiel K Medium oder EPA mäßig hartem Wasser werden oft für ökotoxikologische Untersuchungen verwendet. ^31,32

Das Protokoll bietet eine Möglichkeit, zu screenen und zu Kandidaten für weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien zu identifizieren. Auf der Stufe der primären Screening ist es wahrscheinlich, dass einige Verbindungen wird durch nur eine Konzentration getestet sehen wurden daher Drogen-Bildschirme sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden. Zugriffe kann durch die Verwendung von Techniken zur Bewertung verschiedener Aspekte der mitochondrialen Funktion beispielsweise der Sauerstoffverbrauch, C. validieren elegans-Stämme mit GFP-exprimierenden Mitochondrien, Flecke für mitochondriale Membranpotential und / oder ROS-Messungen. ^16,33,34 Die größte Bedeutung der Methodik ist es, eine Einrichtung zum Sortieren von großen Anzahl von Verbindungen und / oder Bedingungen an der vielzelligen Organismen Pegel haben, und vor allem in der Lage sein, die Vorteile der th nehmene genetische Lenkbarkeit von C. elegans, um Wirkmechanismen zu untersuchen. Die Technik kann helfen, zu beschleunigen und zu finden, neue Wege zur Entdeckung interessanter Verbindungen und Ziele. Es ist vorgesehen, dass die Kombination des Sensors mit genetischen Hintergründen mit menschlichen Krankheiten für das Screening von Substanzbibliotheken in einem krankheitsrelevanten Kontext zugeordnet wird viel zu bieten haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Orion II Mikroplatten-Luminometer	Berthold Detektionssysteme		mit Injektor und der Simplicity 4.2 Software; Übertragung der Daten nach Excel am Ende der Plattenmessung
FLx800 Fluorimeter	Biotek		mit Gen5 Software; Übertragung der Daten nach Excel am Ende der Plattenmessung
Ks 130 Basic Schüttelplattform	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Kühlinkubator Schüttler
Eppendorf Zentrifuge 5804R	Eppendorf		mit Eppendorf Rotor A-4-44  (für 50/15  ml Röhrchen)
Stripette, Costar	Corning	#4489	Serologische Pipette
Cellstar 50 ml Röhrchen	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml Röhrchen	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 mm Gewebekulturplatten	Greiner bio-one	#628160
Superfrost Objektträger	VWR	#631-0909
Steriler Spatel	Corning	#3007; #3004	zum Wiegen von Chemikalien
0,22 mM Millex GP Filter	Millipore	#SLGP033RS
Axygen eppendorf Röhrchen 1,5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 Well Assay Platte	VWR	#3603	Schwarze Platte mit klarem Boden und Deckel
Nunc 96 Well Assay	Platte Fisher Scientific	#236105	Weiße Platte mit Deckel
Reservoir Reagenz 60 ml	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	als Trog für Nematoden im Protokoll verwendet Abschnitt 4.4.1
Vorratsbox/Feuchtigkeitskammer	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56,6 mm, wird als Feuchtkammer mit nassen Papiertüchern verwendet; 2x 96-Well-Platten mit Deckel passen in eine, wobei die untere auf einem Mikrotiterplattendeckel sitzt
Bleichmittel: Natriumhypochloritlösung 4-4,99% Chlorgehalt	Sigma Aldrich	#239305	In Aliquoten bei 4  lagern; ° C,  Versiegelung mit Parafilm, um Chlorverlust zu verhindern und Abdeckung in Folie
D-Luciferin, Kaliumsalz	Biotium Inc	# 10101-2	Molekulare Sonden können auch als Lieferant verwendet werden; bereiten Sie einen 20 mM Vorrat in ddH2O vor, halten Sie ihn bei -20 & Grad; C in aliquots
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Reinheit 99,99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Diltute bis 10% in ddH2O
Nystatin	CalBiochem	#475914
C. elegans biolumineszierende Stämme	Eigene Laboratorien	PE254, PE255	enthalten integrierte Arrays feIs4 und feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] jeweils auf Chromossom V und X; selektieren für eine homogene und starke Expression von luc::GFP durch Fluoreszenzmikroskopie (z.B. 15 Würmer auswählen) von Zeit zu Zeit.
E. coli OP50	CGC
Allgemeine Chemikalien	Sigma Aldrich/Fisher Scientific