Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

Zusammenfassung

Caco-2-Zellen können als In-vitro-Modell dienen, um den Enterozytentransport von Lipiden und fettlöslichen Medikamenten/Vitaminen zu untersuchen. Das permeable Membransystem trennt das apikale vom basolateralen Kompartiment, während das Lentivirus-Expressionssystem eine effektive Genüberexpressionsmethode bietet. Die Isolierung von Lipoproteinen wird durch TEM bestätigt.

Zusammenfassung

Studien zur Fettabsorption in der Nahrung werden im Allgemeinen unter Verwendung eines Tiermodells durchgeführt, das mit einer Lymphkanüle ausgestattet ist. Obwohl dieses Tiermodell weithin als In-vivo-Modell der Fettabsorption in der Nahrung akzeptiert ist, sind die damit verbundenen chirurgischen Techniken anspruchsvoll und teuer. Auch die genetische Manipulation des Tiermodells ist kosten- und zeitaufwendig. Das alternative In-vitro-Modell ist wohl erschwinglicher, zeitsparender und weniger herausfordernd. Wichtig ist, dass das In-vitro-Modell es den Forschern ermöglicht, die Enterozyten als isoliertes System zu untersuchen, wodurch die Komplexität des gesamten Organismusmodells reduziert wird. In dieser Arbeit wird beschrieben, wie humane Kolonkarzinomzellen (Caco-2) als In-vitro-Modell dienen können, um den Enterozytentransport von Lipiden sowie von fettlöslichen Medikamenten und Vitaminen zu untersuchen. Es erklärt die richtige Pflege der Caco-2-Zellen und die Zubereitung ihrer Lipidmischung; Und es wird auch die wertvolle Option des Einsatzes des permeablen Membransystems diskutiert. Da differenzierte Caco-2-Zellen polarisiert sind, besteht der Hauptvorteil der Verwendung des permeablen Membransystems darin, dass es das apikale vom basolateralen Kompartiment trennt. Folglich kann das Lipidgemisch in das apikale Kompartiment gegeben werden, während die Lipoproteine aus dem basolateralen Kompartiment gesammelt werden können. Darüber hinaus wird die Wirksamkeit des Lentivirus-Expressionssystems bei der Hochregulierung der Genexpression in Caco-2-Zellen diskutiert. Abschließend wird beschrieben, wie die erfolgreiche Isolierung von intestinalen Lipoproteinen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt werden kann.

Einleitung

^{4 -} Studien der intestinalen Aufnahme von Nahrungsfett und lipidlösliche Arzneimittel und Vitamine können in vivo unter Verwendung eines Lymphfistel Modell ¹ durchgeführt werden. Jedoch sind die Operationstechniken involviert nicht nur anspruchsvoll, sondern auch kostspielig. Obwohl in vivo-Ansätzen auf fäkale Analysen können verwendet werden, basieren, sind sie hauptsächlich verwendet, um die prozentuale Aufnahme durch den ^{Magen-Darm-2,5} bestimmen. Die in diesem Dokument beschriebenen in vitro-Modell ist kostengünstiger, und die Techniken beteiligt sind wohl weniger anspruchsvoll. Genetische Veränderung Stu....

Protokoll

1. Wartung der Caco-2-Zellen

1. Verwenden von regulären Gewebekulturschalen
   1. Tauen die Caco-2-Zellen, die aus einem gefrorenen Fläschchen durch Platzieren des Gefäßes in einem 37 ° C Wasserbad, und fügen Sie sie sofort auf eine 10 cm Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmten Wachstumsmedien (15% fötalem Rinderserum (FBS ) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM)).
      1. Wenn die Caco-2-Zellen 50-70% Konfluenz erreicht, spalteten sich 1: 6, indem die Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin / 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 ° C, bis sie abgenommen werden (15 min) . Zu Zelle Verklumpung zu vermeiden, mischen Sie die Zellen mehrfach durc....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die normale 13-Tage nach der konfluenten Caco-2-Zellen. Das Aussehen des kuppelförmigen Strukturen und intrazellulären Lipidtröpfchen Charakteristik unterschieden Caco-2-Zellen. Wenn die Caco-2-Zellen werden nicht in gleicher Weise während der Aussaat dispergiert werden sie verklumpen und wuchern in bestimmten Bereichen der Schale; und es gibt ein paar Bereiche in der Schale ohne Zellen sein. Wirbelnden und Platzieren der Schale auf einer schrägen Fläche zu vermeiden. Es ist auch wicht.......

Diskussion

In diesem Papier, um die beiden Systeme, die verwendet werden können, zu erhalten Caco-2-Zellen beschrieben werden, nämlich die normale Gewebekulturschale und die durchlässige Membran. Die Vorteile der Verwendung der permeablen Membransystem umfassen die Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten, und die Fähigkeit, das Lipid-Mischung zu inkubieren, und gleichzeitig sammelt die Lipoproteinsekretion. Jedoch sind die durchlässigen Membraneinsätze teuer, und ihre Polycarbonat-Membran nicht für eine gute Sichtba.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	VWR	16750-112	Erwärmen Sie das Wachstumsmedium in der einzelnen Gewebekulturschale, bevor Sie Zellen hinzufügen
FBS	Fisher 3600511		Wir inaktivieren unser Serum nicht
Trypsin	VWR	45000-660	Zellen können vor der Trypsin-Behandlung mit PBS gewaschen werden
Permeables Membransystem	Fisher	7200173	10-cm-Schale, 3 mm Porengröße, Polycarbonat-Membran
10 cm	Schale Fisher	08-772-E	Gewebekulturschale
15 cm Schale	Fisher	08-772-24	Gewebekulturschale
24-Well-Platte	Fisher	12565163	Gewebekulturplatte
Transfektionsreagenz auf Lipidbasis	Fisher	PRE2691	Kann durch andere Transfektionsreagenz ersetzt werden
Reduziertes Serummedium	Invitrogen	11058021	Für die Transfektion
pLL3.7 eGFP	Addgene	11795<	a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/
Filter mit Flaschenaufsatz	Fisher	9761120	0,45 mm Pore
Polybrene	Fisher	NC9840454	10 mg/ml
Ölsäure	Sigma	01383-5G	Verhindern Sie den Frost-Tau-Zyklus
Lecithin	Fisher	IC10214625	Ei Lecithin
Natriumtaurocholat	Fisher	NC9620276	Produkt eingestellt; alternative Katalognummer: 50-121-7956
Protease-Inhibitor-Cocktailtablette (EDTA-frei)	Fisher	5892791001	Wird hauptsächlich für Proben verwendet, die eine TEM-Analyse benötigen
Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat	Fisher	NC9696153	Mehrfache Wiederverwendung führt zum Zusammenklappen des Röhrchens
Deckel für Ultrazentrifugenröhrchen	Fisher	NC9796914	Entfernen des Schlauchs/Deckels vom Rotor ist ein Werkzeug erforderlich
Spritze	Fisher	50-949-261	Einweg-Spritzenfilter
	Fisher	09-719C	Porengröße = 0,2 mm; Nylon
Phosphotungssäure	Fisher	AC208310250	Zur Herstellung von 2%iger Phosphotungssäure, pH 6,0
Pinzette	Fisher	50-238-62	Extra fein und starke Spitzen
Formvar/Carbon-Gitter	Fisher	50-260-34	Formvar/Carbon-Folie quadratisches Gitter 400 Kupfer

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