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Methodenartikel

Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

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DOI:

10.3791/53086

⸱

20. August 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Caco-2-Zellen können als In-vitro-Modell dienen, um den Enterozytentransport von Lipiden und fettlöslichen Medikamenten/Vitaminen zu untersuchen. Das permeable Membransystem trennt das apikale vom basolateralen Kompartiment, während das Lentivirus-Expressionssystem eine effektive Genüberexpressionsmethode bietet. Die Isolierung von Lipoproteinen wird durch TEM bestätigt.

Zusammenfassung

Studien zur Fettabsorption in der Nahrung werden im Allgemeinen unter Verwendung eines Tiermodells durchgeführt, das mit einer Lymphkanüle ausgestattet ist. Obwohl dieses Tiermodell weithin als In-vivo-Modell der Fettabsorption in der Nahrung akzeptiert ist, sind die damit verbundenen chirurgischen Techniken anspruchsvoll und teuer. Auch die genetische Manipulation des Tiermodells ist kosten- und zeitaufwendig. Das alternative In-vitro-Modell ist wohl erschwinglicher, zeitsparender und weniger herausfordernd. Wichtig ist, dass das In-vitro-Modell es den Forschern ermöglicht, die Enterozyten als isoliertes System zu untersuchen, wodurch die Komplexität des gesamten Organismusmodells reduziert wird. In dieser Arbeit wird beschrieben, wie humane Kolonkarzinomzellen (Caco-2) als In-vitro-Modell dienen können, um den Enterozytentransport von Lipiden sowie von fettlöslichen Medikamenten und Vitaminen zu untersuchen. Es erklärt die richtige Pflege der Caco-2-Zellen und die Zubereitung ihrer Lipidmischung; Und es wird auch die wertvolle Option des Einsatzes des permeablen Membransystems diskutiert. Da differenzierte Caco-2-Zellen polarisiert sind, besteht der Hauptvorteil der Verwendung des permeablen Membransystems darin, dass es das apikale vom basolateralen Kompartiment trennt. Folglich kann das Lipidgemisch in das apikale Kompartiment gegeben werden, während die Lipoproteine aus dem basolateralen Kompartiment gesammelt werden können. Darüber hinaus wird die Wirksamkeit des Lentivirus-Expressionssystems bei der Hochregulierung der Genexpression in Caco-2-Zellen diskutiert. Abschließend wird beschrieben, wie die erfolgreiche Isolierung von intestinalen Lipoproteinen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt werden kann.

Einleitung

4 - Studien der intestinalen Aufnahme von Nahrungsfett und lipidlösliche Arzneimittel und Vitamine können in vivo unter Verwendung eines Lymphfistel Modell 1 durchgeführt werden. Jedoch sind die Operationstechniken involviert nicht nur anspruchsvoll, sondern auch kostspielig. Obwohl in vivo-Ansätzen auf fäkale Analysen können verwendet werden, basieren, sind sie hauptsächlich verwendet, um die prozentuale Aufnahme durch den Magen-Darm-2,5 bestimmen. Die in diesem Dokument beschriebenen in vitro-Modell ist kostengünstiger, und die Techniken beteiligt sind wohl weniger anspruchsvoll. Genetische Veränderung Studien sind auch wirtschaftlicher und weniger zeitaufwendig, wenn sie mit diesen in-vitro-Modell durchgeführt.

Da lipidlöslichen Materialien, die von Enterozyten genommen werden, in Lipoproteinen 6,7 verpackt ist, wird die Wirksamkeit dieser in vitro-Modell zu erzeugen Lipoproteine ​​entscheidend. Die zwei Haupt intestinal Lipoproteine ​​Chylomikronen und sehr geringer Dichte (VLDL). Chylomikronen, definiert als Lipoproteine ​​mit 80 nm oder mehr im Durchmesser, werden ausschließlich durch den Dünndarm produziert, wenn Lipide in Fülle im Magen-Lumen vorhanden sind. Da sie die größte Lipoproteine ​​Chylomikronen sind denkbar die effizientesten Lipidtransportern. Dieses in vitro-Modell, das in der Lage ist Chylomikronen 8 kann verwendet werden, um Nahrungsfettabsorption, lipidlösliches Vitamin Absorption durch den Darm und die orale Bioverfügbarkeit lipophiles Arzneimittel zu untersuchen. Die Anwesenheit von lipidlösliche Moleküle, Vitamine oder Drogen in der Lipoproteinfraktion ist ein Indikator für deren Absorption durch den Dünndarm. Wie zuvor erläutert, kann dieses Modell verwendet werden, um die orale Bioverfügbarkeit lipophilen Arzneimittel 6 zu verbessern.

Dieses Papier beschreibt, wie Caco-2-Zellen sollten in durchlässige Membran oder regelmäßige Gewebekulturschalen, wie die Lipid-mi beibehalten werdenBefestigung zur Stimulierung Lipoproteinsynthese sollten darauf vorbereitet sein, wie die Lentivirus-Expressionssystem verwendet werden, um effektiv eine Überexpression zu erreichen, und wie die isolierte Lipoproteine ​​sollten analysiert werden.

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Protokoll

1. Wartung der Caco-2-Zellen

  1. Verwenden von regulären Gewebekulturschalen
    1. Tauen die Caco-2-Zellen, die aus einem gefrorenen Fläschchen durch Platzieren des Gefäßes in einem 37 ° C Wasserbad, und fügen Sie sie sofort auf eine 10 cm Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmten Wachstumsmedien (15% fötalem Rinderserum (FBS ) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM)).
      1. Wenn die Caco-2-Zellen 50-70% Konfluenz erreicht, spalteten sich 1: 6, indem die Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin / 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 ° C, bis sie abgenommen werden (15 min) . Zu Zelle Verklumpung zu vermeiden, mischen Sie die Zellen mehrfach durch vorsichtiges Pipettieren. 0,5 ml der Trypsin-Zellen auf eine 10 cm-Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmtem Nährmedium.
    2. Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. Vermeiden Sie wirbeln die Gerichtewie es in einer ungleichen Zelldispersion führen.
    3. Die Schalen werden auf eine flache Oberfläche in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 zugeführt wird. Geneigten Flächen kann auch in einer ungleichen Zelldispersion führen.
    4. Ändern Sie den Wachstumsmedien einen Tag nach Beginn der Inkubation.
    5. Überwachen Sie die Zellen, und notieren Sie den Tag ihrer Zusammenfluss zu erreichen. Es wird ca. 1 Woche dauern, bis die Zellen bis zur Konfluenz ab dem Tag sie aufgeteilt werden zu erreichen.
    6. Ändern Sie den Wachstumsmedien zweimal pro Woche, bevor die Zellen Konfluenz erreichen. Sobald die Zellen Konfluenz erreicht, ändern Sie die Wachstumsmedien jeden zweiten Tag. Nachdem die Zellen 7 Tage post-konfluente, ändern Sie die Wachstumsmedien täglich.
      Anmerkung: Die Zellen sind bereit für Experimente, wenn sie 13 Tage nach der Konfluenz (Abbildung 1). Da die Zellen werden schließlich weniger wirksam in der Herstellung von Lipoproteinen, verwenden Zellen, die zwischen 13 bis 17 Tage post-konfluente 8 sind. Zum, wie man das Experiment durchführen Schritt 3.
  2. Verwendung der permeablen Membransystem
    1. Samen der Caco-2-Zellen in der durchlässigen Membran Einsatz wie in Schritt 1.1.1.1 beschrieben. über. Vermeiden Sie Zellen aus einem zugefrorenen Fläschchen, weil ihre Zellwachstum ist in der Regel langsamer (Erholungszeit). Kurz gesagt, werden 0,5 ml der Zellen mit Trypsin behandelt, um die apikale Kammer (Oberkammer), die mit 10 ml vorgewärmtem Nährmedium enthält. Außerdem werden 10 ml des vorgewärmten Nährmedium zur basolateralen Kammer (unteres Fach).
      Hinweis: Für Best Practice, fügen Sie die Wachstumsmedien zur apikalen Kammer und dann zur basolateralen Kammer. Beim Entfernen der alten Medien, entfernen Sie den basolateralen Medien vor den apikalen Medien. Vermeiden Stossen die Polycarbonatmembran, da es die Membran reißen.
    2. Aufgrund der schlechten Sicht durch die Zelle Polycarbonatmembran, Saatgut die Caco-2-Zellen in einem normalen Gewebekulturschale mit ähnlicher Dichte, und verwenden Sie dieses Gericht, das Zellkonfluenz beurteilen.
    3. Folgen Sie sTEPs 1.1.2-1.1.6 oben.

2. Genüberexpression

  1. Mit Hilfe der regulären Transfektionsansatz
    1. Samen der Caco-2-Zellen auf einer Gewebekulturschale wie oben in 1.1.1.1.-1.1.4 beschrieben.
      Hinweis: Wenn die Zellen etwa 40-50% konfluent, bereit, transfiziert werden, sind sie.
    2. Hinzuzufügen 67 ul des Transfektionsreagenz auf 472 & mgr; l der reduzierten Serum-Medium in einem Reaktionsgefäß. Kontakt mit unverdünntem Transfektionsreagenz mit der Rohrwand zu vermeiden.
    3. Hinzuzufügen 23 ug pLL3.7 enhanced green fluorescent protein (eGFP) 9 in das Transfektionsreagenz / reduziert Serum Mediengemisch.
    4. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei RT.
    5. Ersetzen Sie die Caco-2-Zellen "Wachstumsmedien mit 8 ml 10% FBS in DMEM.
    6. Fügen Sie die DNA / Transfektionsreagenz / reduziert Serum Medien Mischung tropfenweise in die Schale.
    7. Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und backward Richtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung.
    8. Die Schale in der 37 ° C-Inkubator.
    9. Ersetzen Sie die Medien in der Schale mit 10 ml Wachstumsmedium einen Tag nach Beginn der Inkubation.
    10. Überwachen Sie die Genexpression.
      1. Überwachen Sie die Genexpression ohne 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Färbung. Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, bestimmen den Prozentsatz der Zellen, die grün sind. Der Anteil stellt die Transfektionseffizienz.
      2. Überwachen Sie die Genexpression mit DAPI-Färbung.
        1. Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dreimal Waschen der Zellen.
        2. Fixieren die Zellen durch Zugabe von 10 ml von 4% Formaldehyd in PBS (10 min Inkubation bei RT).
        3. Dreimal mit PBS waschen der Zellen.
        4. Die Zellen im Dunkeln inkubieren für 15 min bei RT mit 8 ml PBS, das 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% Digitonin.
        5. Dreimal mit PBS waschen der Zellen.
        6. Usingen ein Fluoreszenzmikroskop, bestimmen die Anzahl der Zellen, die grün / blau im Vergleich zu denen, die blaue (Abbildung 2 oberes Feld) sind. Der errechnete Prozent stellt die Transfektionseffizienz.
  2. Verwenden des Lentivirus Expression System 10
    1. Seed menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T-Zellen in einer 15 cm Gewebekulturschale (10% FBS in DMEM als Wachstumsmedien).
      Hinweis: Wenn die Zellen etwa 60-70% konfluent, bereit, transfiziert werden, sind sie.
    2. Fügen Sie 162 ul der Transfektionsreagenz auf 1.133 & mgr; l der reduzierten Serum-Medien in ein Mikrozentrifugenröhrchen 11. Kontakt mit unverdünntem Transfektionsreagenz mit der Rohrwand zu vermeiden.
    3. In 24 ug pLL3.7 eGFP (oder ein anderes Konstrukt), 15,6 ug Rev-Response-Element (RRE), 6,0 & mgr; g REV, und 8,4 ug des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG) in das Transfektionsreagenz / reduced Serum Medienmischung.
    4. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei RT.
    5. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 16 ml 10% FBS in DMEM.
    6. Fügen Sie die DNA / Transfektionsreagenz / reduziert Serum Medien Mischung tropfenweise in die Schale.
    7. Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. Es ist normal, einige der HEK293T-Zellen freistehend an dieser Stelle zu sehen.
    8. Die Schale in den Inkubator.
    9. Nach 24 Stunden Inkubation, ersetzen Sie die Medien in der Schale mit 25 ml Wachstumsmedium.
    10. Am folgenden Tag, sammeln das Wachstumsmedium, das die Lentivirus (erste Kollektion).
    11. Wiederholen Sie Schritt 2.2.10 mehr Lentivirus (die zweite Sammlung) zu sammeln.
    12. Bündeln die erste und die zweite Sammlung, und entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation (2500 × g für 5 min).
    13. Filtern Sie die Sammlung mit einem Einweg-Flaschenaufsatz-Filter (0,45 um Poren) undKonzentrat, das Virus durch Zentrifugation der Sammlung 31.400 × g für 2 Stunden bei RT (JA-20-Rotor). Markieren den Boden des Zentrifugenrohrs, wo das Pellet entfernt. Den Überstand umfüllen, und lassen Sie das Rohr bei RT invertiert für etwa 15 min.
    14. Resuspendieren virushaltige Pellet mit 100 ul 1X PBS. Vermeiden Sie Luftblasen.
    15. Bewahren Sie die konzentrierte Virus bei -80 ° C. Vermeiden Einfrieren und Auftauen.
    16. Bestimmung der optimalen Menge des Virus benötigt, um die Caco-2-Zellen durch Titration zu transduzieren. Um Kosten zu sparen, verwenden Sie eine 24-Well-Platte (0,3 ml Wachstumsmedium / well) anstelle eines 10 cm Gewebekulturschale für die Titration.
      1. Hinzuzufügen zunehmenden Mengen des konzentrierten Virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, und 50 ul / Vertiefung), ergänzt mit Polybren (Endkonzentration = 5 & mgr; g / ml) auf 40-70% konfluent Caco-2-Zellen. Schütteln Sie die Platte mit 24 Vertiefungen vorsichtig wie in 1.1.2 beschrieben.
      2. Überwachung ihrer Genexpression (Schritt 2.1.10.) (Abbildung 2 unten4 Platten).
    17. Da die Expression des Transgens in der Regel aufrechterhalten, pflegen die transduzierten Zellen für zukünftige Experimente und ihre Genexpression kontinuierlich zu überwachen (Schritt 2.1.10.).

3. Förderung der Lipoproteinsekretion

  1. Mit Hilfe der regulären Gewebekulturschale
    1. Vorbereitung einer 100X Lipidgemisch durch Mischen von 50 mg Ölsäure 40 mg Lecithin und 48 mg Natriumtaurocholat. Bringen Sie die Lautstärke auf 900 ul mit PBS (ausreichend für 8 Geschirr). Mischen Sie den Lipidmischung kräftig.
    2. Add 900 ul 100X Lipidgemisch in 89,1 ml Wachstumsmedium. Zu mischen, und Filtern der lipidhaltigen Medien. Die Endkonzentrationen (1X) Ölsäure, Lecithin und Natriumtaurocholat sind 2,0 mM, 1,36 mM und 1,0 mM.
    3. 10 ml des lipidhaltigen Medien zu den Zellen.
    4. Die Zellen mit dem lipidhaltigen Medien Inkubieren 4 Stunden in eine 37° C Inkubator.
    5. Dreimal mit PBS waschen der Zellen.
    6. 10 ml Wachstumsmedium zu den Zellen, um die Lipoproteinsekretion sammeln.
    7. Inkubieren für 2 Stunden in einem 37 ° C Inkubator.
    8. Sammeln Sie die Lipoprotein-haltigen Medien.
  2. Verwendung der permeablen Membransystem
    1. Führen Sie die Schritte, um den Lipid 3.1.1-3.1.2 Mischung herzustellen.
    2. 10 ml des lipidhaltigen Medien zur apikalen Kammer und 10 ml des Wachstumsmediums zur basolateralen Kammer.
    3. Inkubieren für 4 Stunden in einem 37 ° C Inkubator. Sammeln Sie die Lipoprotein enthaltenden Medien in der basolateralen Kammer.

4. Lipoprotein Isolation (Abbildung 3)

  1. Entfernen der Zelltrümmer aus der Lipoprotein enthaltenden Medien durch Zentrifugation (2.000 × g für 5 min).
  2. Dekantieren Sie das Medium in einen 50-ml-Tube.
  3. Hinzuzufügen 5,95 g Natriumchlorid zu den Medien.
  4. Wenn der sample wird durch die TEM untersucht werden, fügen 1 Proteaseinhibitor-Cocktail-Tablette, die Integrität der Lipoproteine ​​aufrechtzuerhalten.
  5. Bringen Sie die Lautstärke auf 23 ml mit Wasser (1,2 g / ml NaCl-Lösung Dichte).
  6. Lösen sich die gelösten Stoffe vollständig.
  7. Dekantiert die gesamte Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat.
  8. Überlagern Sie vorsichtig die 1,2 g / ml Dichte Lösung mit 0,5 ml Wasser (1,0 g / ml Dichte).
  9. Gleichgewicht der Röhre beträgt und nicht auf das Volumen.
  10. Die Rohre in dem T865 Rotor sanft zu laden.
  11. Dreh die Proben in der Ultrazentrifuge bei 429.460 xg für 24 h bei 4 ° C.
  12. Sofort isolieren die Spitze 0,5 ml Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Halten Sie das Rohr so ​​ruhig wie möglich.

5. TEM-Analyse

  1. Vorbereitung 5 ml 2% Phosphorwolframsäure (w / v) und der pH-Wert auf 6,0.
  2. Filtern Sie die 2% Phosphorwolframsäure mit einem Spritzenfilter (Porengröße: 0,2 um).
  3. Drop 20 ul der Probe auf einem Lipoprotein sterile Schüssel.
  4. 20 ul Tropfen der filtrierten 2% Phosphorwolframsäure neben der Probe auf der gleichen Schale.
  5. Fallen sanft ein EM Gitter mit der stumpfen Seite auf der Probe aufliegt.
  6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
  7. Klopfen Sie leicht die Seite des EM Gitter auf einem Filterpapier, um die Probe aus dem Netz zu entfernen.
  8. Drop Sie vorsichtig die EM Gitter mit der stumpfen Seite auf der 2% Phosphorwolframsäure ruhen.
  9. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
  10. Klopfen Sie leicht die Seite des EM Gitter auf einem Filterpapier, um die Phosphorwolframsäure aus dem Netz zu entfernen.
  11. Verwendung eines TEM, erfassen die Bilder der Lipoproteine ​​(Abbildung 4).

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die normale 13-Tage nach der konfluenten Caco-2-Zellen. Das Aussehen des kuppelförmigen Strukturen und intrazellulären Lipidtröpfchen Charakteristik unterschieden Caco-2-Zellen. Wenn die Caco-2-Zellen werden nicht in gleicher Weise während der Aussaat dispergiert werden sie verklumpen und wuchern in bestimmten Bereichen der Schale; und es gibt ein paar Bereiche in der Schale ohne Zellen sein. Wirbelnden und Platzieren der Schale auf einer schrägen Fläche zu vermeiden. Es ist auch wicht...

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Diskussion

In diesem Papier, um die beiden Systeme, die verwendet werden können, zu erhalten Caco-2-Zellen beschrieben werden, nämlich die normale Gewebekulturschale und die durchlässige Membran. Die Vorteile der Verwendung der permeablen Membransystem umfassen die Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten, und die Fähigkeit, das Lipid-Mischung zu inkubieren, und gleichzeitig sammelt die Lipoproteinsekretion. Jedoch sind die durchlässigen Membraneinsätze teuer, und ihre Polycarbonat-Membran nicht für eine gute Sichtba...

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Offenlegungen

Der Autor hat nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Seed Grant Award des California Northstate University College of Pharmacy (an AMN) unterstützt. Die Autoren danken dem California Northstate University College of Pharmacy für die Übernahme der Veröffentlichungskosten dieses Artikels und George Talbott für seine Hilfe bei der Bearbeitung dieses Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMVWR16750-112Erwärmen Sie das Wachstumsmedium in der einzelnen Gewebekulturschale, bevor Sie Zellen hinzufügen
FBSFisher 3600511Wir inaktivieren unser Serum nicht
TrypsinVWR45000-660Zellen können vor der Trypsin-Behandlung mit PBS gewaschen werden 
Permeables MembransystemFisher720017310-cm-Schale, 3 mm Porengröße, Polycarbonat-Membran
10 cmSchale Fisher08-772-EGewebekulturschale
15 cm SchaleFisher08-772-24Gewebekulturschale
24-Well-PlatteFisher12565163Gewebekulturplatte
Transfektionsreagenz auf LipidbasisFisherPRE2691Kann durch andere Transfektionsreagenz ersetzt werden
Reduziertes SerummediumInvitrogen11058021Für die Transfektion
pLL3.7 eGFPAddgene11795<a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/
Filter mit FlaschenaufsatzFisher97611200,45 mm Pore
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
ÖlsäureSigma01383-5GVerhindern Sie den Frost-Tau-Zyklus
Lecithin FisherIC10214625Ei Lecithin 
NatriumtaurocholatFisherNC9620276Produkt eingestellt; alternative Katalognummer: 50-121-7956
Protease-Inhibitor-Cocktailtablette (EDTA-frei)Fisher5892791001Wird hauptsächlich für Proben verwendet, die eine TEM-Analyse benötigen
Ultrazentrifugenröhrchen aus PolycarbonatFisherNC9696153Mehrfache Wiederverwendung führt zum Zusammenklappen des Röhrchens
Deckel für UltrazentrifugenröhrchenFisherNC9796914Entfernen des Schlauchs/Deckels vom Rotor ist ein Werkzeug erforderlich
SpritzeFisher50-949-261Einweg-Spritzenfilter
Fisher09-719CPorengröße = 0,2 mm; Nylon
PhosphotungssäureFisherAC208310250Zur Herstellung von 2%iger Phosphotungssäure, pH 6,0
PinzetteFisher50-238-62Extra fein und starke Spitzen
Formvar/Carbon-GitterFisher50-260-34Formvar/Carbon-Folie quadratisches Gitter 400 Kupfer
Zum

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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