Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein 3D-Kulturmodell des menschlichen Brustepithels, das geeignet ist, die Hormonwirkung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Der Prozess der Morphogenese des Brustepithels wird durch Hormone beeinflusst. Die Untersuchung der Hormonwirkung auf das Brustepithel mit Hilfe von 2D-Kulturen beschränkt sich auf die Zellproliferation und die Endpunkte der Genexpression. Im Organismus findet die Morphogenese der Brust jedoch in einer 3D-Umgebung statt. 3D-Kultursysteme helfen, die Lücke zwischen Monolayer-Zellkultur (2D) und der Komplexität des Organismus zu schließen. Darin beschreiben wir ein 3D-Kulturmodell des menschlichen Brustepithels, das sich zur Untersuchung der Hormonwirkung eignet. Es verwendet die kommerziell erhältliche hormonempfindliche humane Brustepithelzelllinie T47D und Rattenschwanzkollagen Typ 1 als Matrix. Dieses 3D-Kulturmodell reagiert auf die wichtigsten mammotropen Hormone: Östradiol, Gestagene und Prolaktin. Der Einfluss dieser Hormone auf die epitheliale Morphogenese kann je nach Endpunkt nach 1- oder 2-wöchiger Behandlung beobachtet werden. Die 3D-Kulturen können für die Analyse der epithelialen Morphogenese, der Zellproliferation und der Genexpression entnommen werden.

Einleitung

Im Gegensatz zu Standard-2D-Kulturen erlauben Surrogat 3D-Zellkulturmodelle für die Untersuchung von epithelialen Zellverhalten in einem physiologisch relevanten Kontext man eine Gewebe ähnelt. 3D-Kulturen der Brustdrüse viele Aspekte der Brustdrüse Entwicklung und Neoplasie aufzuklären haben dazu beigetragen. Die Mehrzahl der 3D-Kulturmodellen jedoch derzeit verfügbar sind ungeeignet Hormonwirkung zu studieren, weil die menschlichen epithelialen Zelllinien für die Aufgabe eingesetzt ^6,7,9 fehlt Hormonrezeptorexpression.

Hier beschreiben wir eine 3D-Kultur-Modell der menschlichen Brust-Epithel, die geeignet ist, um die Hormonwirkung ¹² studieren. Dieses Modell verwendet die im Handel erhältlich Hormone ansprechenden menschlichen Brust epithelialen Zelllinie T47D ^3,11,13, die ursprünglich von einem Pleuraerguss von einer 54-jährigen Patientin mit einer Infiltrations duktale Mammakarzinom erhalten abgeleitet wurden. Wir verwenden Rattenschwanz Kollagen vom Typ 1 als Matrix. Diese 3D-Kulture-Modell ist für die Untersuchung der Wirkung von den drei Haupt mammotropic Hormone (Östradiol, Promegeston (ein Analogon von Progesteron) und Prolaktin) angemessen auf die menschliche Brust Epithelzellen. Hormonbedingten können epitheliale Morphologie quantitativ im Laufe der Zeit durch morphometrische Analyse ¹² bewertet werden.

Eine geeignete Aussaatdichte ermöglicht diese 3D-Kulturen für 2 Wochen aufbewahrt werden. Zu dieser Zeit ist die Entwicklung von Strukturen für eine ausreichend robust quantitative Bewertung der Hormonwirkung auf epitheliale Morphologie. Gele können auch zu früheren Zeitpunkten für die Zellproliferation und die Genexpression analysiert geerntet werden. Darüber hinaus ist dieses Modell die Auswirkungen einer sequentiellen Hormonbehandlung zu testen geeignet; zum Beispiel nach der Behandlung mit Estradiol während der ersten Woche und Austausch mit anderen Hormon / Kombination von Hormonen während der folgenden Woche. Die Wirkung des Östrogen-Verbindungen und Antiöstrogene, wie ICI 182,780, können auch stu werdenstarb dieses 3D-Kultur-Modell ¹² mit.

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Man löst das synthetische Gestagen Promegeston (R5020) und 17-β-Estradiol (E2) in Ethanol zu machen ^{10 -3 M} Stammlösungen. Löse Prolaktin in destilliertem deionisiertem Wasser auf eine 1 mg / ml Stammlösung machen. Man löst das Antiöstrogen ICI 182,780 in DMSO auf 10 ^-2 M Stammlösung machen. Bewahren Sie diese Lösungen bei -20 ° C bis zu 6 Monaten.
2. Holzkohle-Dextran (CD) gereinigten Serum und CDFBS Medium:
   1. Wärme-Inaktivierung von fötalem Rinderserum (FBS) in einem 57 ° C Wasserbad für 30 min.
      Hinweis: Verwenden Sie nur säuregewaschenen Glaswaren für den Rest dieses Protokolls.
   2. Berechnen der Menge an Aktivkohle benötigt. Verwendung von 10% größeres Volumen als die Menge an Serum für die Verschiebung von der Holzkohle, wiegen 5% wt / vol Aktivkohlepulver zu kompensieren.
   3. Waschen Kohle zweimal mit kaltem entionisiertem destilliertem Wasser das gleiche Volumen wie die Menge des Serums. Für jede Wasch centrifuge bei 50 g für 2 min die Holzkohle zu pelletieren. Entfernen Sie das Wasser zwischen den Waschgängen. In 0,5% w / v Dextran T-70 bis zum letzten Kohle Pellet. Resuspendieren mit destilliertem, entionisiertem Wasser und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. Saugen Sie das Wasser.
   4. Fügen Sie den entsprechenden Volumen von Serum zu dem Pellet und erneut zu suspendieren die Holzkohle-Dextran-Pellet in das Serum. Man inkubiert, während (6 RPM) Walzen, bei 37 ° C für 60 min. Zentrifuge bei 2.000 × g für 20 min. Wenn überstehende trübe erscheint, wiederholen Zentrifugation; jedoch Serum kann nicht völlig klar sein, zu diesem Zeitpunkt aber wird während der Filtration geklärt werden.
   5. Man filtriert durch ein 0,80-Mikron-Filter und dann erneut durch ein 0,45 Mikrometer-Filter, um größere Partikel zu entfernen. Schließlich Filter-Sterilisieren mit einem 0,20-Mikron-Filter. Shop gefiltert CDFBS in Glasröhrchen oder T-25 Kulturflaschen bei -20 ºC.
   6. Charcoal Dextran Stripped Fetal Bovine haltigen Medien (CDFBS Medien): mix 375 ml Phenolrot-freiem DMEM und 125 ml DMEM/ F-12. Entfernen 37,5 ml und ersetzen Sie es mit dem gleichen Volumen von Holzkohle Dextran Stripped Fetal Bovine Serum. Fügen Sie 10 ⁶ U / ml Penicillin und L-Glutamin in eine 2 mM Endkonzentration. Das resultierende Medium beträgt 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Charcoal Dextran abgestreift-FBS, 2 mM L-Glutamin und ^{10 & sup6;} U / ml Penicillin.
3. Bereiten 10X PBS, 1 N NaOH und destilliertem deionisiertem Wasser. Bereiten genügend Volumen von jedem nach dem Volumen der Kollagenlösung benötigt. Sterilisieren Sie alle Lösungen durch Filterung. Bewahren Sie die 10x PBS und sterilem destilliertem entionisiertem Wasser bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Bewahren Sie das 1 N NaOH-Lösung.
4. Bereiten Kollagenlösung bei einer 1 mg / ml Endkonzentration nach dem Protokoll für "Alternate Gelierung Verfahren für Kollagen I, Rat tail" durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. Jedes Gel wird von 1,5 ml Kollagenlösung hergestellt. Zum Beispiel, bereiten 18,5 ml Kollagenlösung (0,5 ml für den Verlust beim Pipettieren zu berücksichtigen) vorbereiten12 Gele. Verwenden Sie die Kollagenlösung sofort oder halten auf dem Eis für bis zu 2-3 Stunden.
5. Carmine Alum Farbstoff:
   1. Kombinieren Sie 1 g Carmine und 2,5 g Aluminiumkaliumsulfat in 500 ml destilliertem Wasser. Kochen während 20 Minuten unter Rühren. Achten Sie sorgfältig Überkochen zu vermeiden. Passen endgültige Volumen wieder auf 500 ml mit zusätzlichem destilliertem Wasser.
   2. Fügen Sie einen Kristall von Thymol auf antimikrobielle Aktivität und decken Flasche mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. Man filtriert durch ein Laborqualität Papierfilter vor jedem Gebrauch. Wiederverwendung der Carminlösung für bis zu drei Monaten. Aufbewahren bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
6. Kollagenase-Lösung: Man löst die Kollagenase in DMEM / F12-Medium in einer Konzentration von 0,125% w / v. Sie diese Lösung nicht speichern.

2. 3D Culture von T47D Zellen in Rattenschwanz Kollagen Typ 1 Gels und Hormonbehandlung

Hinweis: Halten Sie sterilen serologischen Pipetten und Pipettenspitzen bei 4 ° C.

1. Prepaerneut eine Einzelzellsuspension und führen Sie eine Zellzahl. Split T47D Zellkulturen, bevor sie erreichen 70% Zusammenfluss. Zentrifugieren Sie die Lautstärke, die die Menge von Zellen benötigt enthält. Bedenken Sie, dass ein Gel sollte etwa 75.000 T47D Zellen enthalten.
2. Verwendung eines kalt Pipette resuspendieren das Zellpellet in dem entsprechenden Volumen von Kollagen. Bedenken Sie, dass jeder Gel von 1,5 ml Kollagen aus. Mischen Sie die Zellen und das Kollagen sanft zu vermeiden Blasen einzuführen.
3. Um die Wirkung von statischer Elektrizität auf Zellverteilung verhindern, Pinsel die Ränder, oben und unten an der 12-Well-Platte mit einer statischen reduzierenden Bürste nach den Teller auspacken. Um zu vermeiden, statische Aufladung bei Berührung mit der Arbeitsfläche der Haube, legen Sie diese Platte auf eine andere 12-Well-Platte (Blindplatte), die auch mit der statischen mindernde brush.Gently gebürstet wurde, gießen 1,5 ml der Mischung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte.
4. Die Platte wird in einem Brutschrank bei 37 ° C für 30 Minuten. entfernen the Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Kapuze zurück.
5. Mit einer p200 sterile Spitze, nehmen sorgfältig das Gel in einer sanften kreisenden Bewegungen von der Grenze des Brunnens. Das Gel sollte auch aus dem Boden des Bohrlochs zu lösen.
6. Verdünnte Hormone in CDFBS Medien zu den Vertiefungen hinzugefügt werden. Verwenden E2 und R5020 bei einer ^{10 -10} M Endkonzentration und Prolaktin auf eine bei 10 ^{-7 M} Endkonzentration. Als Kontrolle verwenden CDFBS Medien ohne Hormone zugesetzt, aber immer noch das höchste Volumen von DMSO in Höhe der Hormon Lagerbestände enthält. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung 1,5 ml Medium enthält. Platzieren Sie die 3D-Kulturen in einem 37 ° C, 5% CO _{2, 100%} Feuchtigkeit Gewebekultur-Inkubator. Pflegen Sie die Kulturen für ein oder 2 Wochen die Medien alle 2 Tage zu ändern.

3 Gel-Verarbeitung für Whole Mounts

1. Entfernen Kulturmedien und fügen Sie in jede Vertiefung 1,5 ml PBS.
2. Übertragen Sie das Gel auf einen Objektträger. Schneiden Sie das Gel in ein halbes Kurved chirurgischen Klinge. Weiter Verarbeitung mit der Hälfte und die andere Hälfte zur histologische Analyse speichern.
3. Übertragen Sie die Hälfte Gel für ganze auf einen Objektträger montieren. Lassen Sie Gel trocken für 5 Minuten und dann übertragen Sie die Folie in eine Coplin-Gefäß 10% Formalin enthält.
   Anmerkung: Alle Inkubationen sollte bei RT geschehen.
4. Fix Gele in einem Coplin-Gefäß auf einem Schüttler O / N.
5. Wash gleitet zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten auf einem Schüttler. Objektträger nach 70% EtOH; 1 h auf einem Schüttler inkubiert. Objektträger zu Carmine Alum O / N.
6. Am nächsten Tag entwässern gleitet auf Schüttler in 70% EtOH, 95% EtOH und 100% EtOH für 1 Stunde jede. Objektträger zweimal 1 Stunde jeden und halten am Schüttler zu Xylol. Verwenden Toluol-basierte Montage Medium der Gele und 1,5 mm dicken Deckgläser zu montieren.
7. Untersuchen ganze Halterungen unter normalen Licht (Mikroskop oder Stereoskop). Für eine genauere Analyse der Form und Lumen nutzen konfokale Mikroskopie und Carmine Farbstoff mit He-Ne-633-nm-Laser visualisieren.

4. Gel Verfahren für die Verarbeitung für die Histologie Analyse

1. Die restliche Hälfte des Gels auf eine 20 ml-Glasfläschchen, das 10% Formalin und legen Sie auf den Schüttler O / N.
2. Waschen Sie Gele zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten auf einem Schüttler. Platz Gele in Verarbeitung Kassetten für Paraffineinbettung.
3. Transfer Gele bis 70% EtOH, Inkubation für 1 Stunde und folgen mit 95% EtOH für 1 Stunde, ändern an die frische 95% EtOH für 1 h, 100% EtOH für 1 Stunde, und wechseln Sie in frischem 100% EtOH für 1 Stunde. An diesem Punkt, Gele können für 1 Stunde und dann wieder in frischem Xylol für 1 Stunde in 100% EtOH O / N bei RT oder inkubiert mit Xylol gespeichert werden.
4. Transfer Kassetten für 1 h bei 60 ° C im Vakuum Inkubator wiederholt mit frischem Paraffin zweimal mehr Paraffin.
5. Füllen Kunststoffformen mit sauberem Paraffin. Öffnen Sie die Kassette entfernen Sie das Gel und legen Sie sie in der Kunststoffform, die Paraffin. Füllen Sie mit Paraffin up und top In der Kassette mit dem Etikett nach oben enthalten, und lassen Block cool.
6. Entfernen Sie die plastic Form und Abschnitt der Block mit einem Mikrotom. Erhalten Sie 5 um dicke Abschnitte für HE-Färbung und Immunzytochemie.

5. Gewinnung von Zellen aus Zellen aus Gele Collagenase-Behandlung

1. Entfernen Gel aus dem Brunnen und überträgt es auf eine Petrischale mit PBS. Spülen Gel kurz.
2. Übertragen Sie das Gel in ein 15 ml Röhrchen mit 2 ml 0,125% Collagenase. Pipette auf und ab 4-5 mal, um das Gel in kleine Stücke zu brechen.
3. bei 37 ° C inkubieren für 25 min (bis-Gel aufgelöst und die Zellen werden in Suspension)
4. 2 ml Serum ergänzten Kulturmedium. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (1000 × g, 5 min), Überstand verwerfen, resuspendieren Zellen und zählen.

Ergebnisse

Abbildung 1 fasst die Vorgehensweise für die hormonsensitive 3D-Kulturen vor. Epithelialen Strukturen werden in ganze Halterungen von Gelen kultiviert für 2 Wochen in Gegenwart von E2 allein und in Kombination mit anderen Hormonen beobachtet. Nur einzelne Zellen oder Gruppen von 2-3 Zellen vorhanden sind, wenn keine Hormone zu dem Kulturmedium (CDFBS mittel) (Bild 2) zugesetzt werden. Dieser Zustand dient als Negativkontrolle.

Die Zellen in 3D-Kultur bilden ...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein hormonsensitives 3D-Kulturmodell, um die Wirkung von Hormonen auf das Brustepithel zu testen. Die Reaktion auf Hormone kann auf den Ebenen der Gewebemorphologie, der Zellproliferation und der Genexpression beurteilt werden ¹². Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass die Visualisierung während der Kulturperiode auf die Lichtmikroskopie beschränkt ist, da die Kulturen in einer Kunststoffbodenplatte gezüchtet werden. Das 3D-Kultursystem konnte an Glasbodenplatten angepasst w...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-Gewebekulturplatten (Falcon)	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml konische Polystyrol-Röhrchen	Fisher Scientific	14-959-49D
Aktivkohle	Sigma	C-5510
Karmin Alaun	Sigma	C1022-100G
Kollagenase, Typ 3	Worthington	S0C11784
Konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM510	Ausgestattet mit HeNe 633nm Laser
Dextran T-70	Abersham/Pharmacia	17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, kein Phenol rot	Life Technologies	11339-021	Phenolrot-freie Medien für die Hormonanwendung
DMEM, niedrige Glukose, Pyruvat, kein Glutamin, kein Phenolrot	Life Technologies	11054-020	Phenolrot-freie Medien für die Hormonanwendung
17-β-Estradiol	EMD Millipore	3301	In Ethanol gelöst
Ethanol	Koptec	V1001
Fötales Rinderserum-Hyklon		SH30070.03	Zur Verwendung mit Hormonen muss Aktivkohle-Dextran abgestreift werden
Filter (115 ml)	Nalgene	380-0080, 245-0045, 120-0020	0,88, 0,45, 0,20 Mikron bzw.
Formalin, 10%	Fisher Scientific	SF93-20
L-Glutamin (200 mM)	Life Technologies	25030-081
ICI 182,780 (Fulvestrant)	Sigma Aldrich	I4409-25MG	Gelöst in DMSO-Mikrotom
	Leica	RM2155
Einbettungsmedium	für Gewebe McCormick Scientific	39502004
Penicillin	Sigma	7794-10MU	Gelöst in 10 ml destilliertem Wasser
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4	Sigma Aldrich	P3813-10PAK
Prolaktin	Sigma Aldrich	L4021-50UG	Gelöst in destilliertem deionisiertem Wasser
Promegestone	Perkin Elmer	NLP004005MG	Gelöst in Ethanol
Rattenschwanzkollagen	Corning	354236	Chargen können unterschiedliche Konzentrationen enthalten, entsprechend beachten Skalpell
	Miltex	4311
Halbgeschlossener Tisch-Tissue-Prozessor	Leica	TP1020
Natriumhydroxid	Sigma Aldrich	S5881	Vorbereiten 1N NaOH-Lager
StaticMaster Antistatik-Bürste	Amstat	C3500
Serologische Stripettenpipetten	Corning	4101
T-25 Kolben	Corning
Gewebekassetten	Fisher Scientific	15-200-403E
Wheaton Fläschchen, Glas, 20 ml	Fisher Scientific	03-341-25D
Xylol	VWR	95057-822

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