Methodenartikel

Ferromagnetische Bare Metal Stent für Endothelzellen-Abscheidung und Retention

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DOI:

10.3791/53100

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18. September 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Unser Ziel war es, entwickeln, produzieren und testen ferro Stents für Endothelzellen-Capture. Zehn Stents wurden zur Fraktur getestet und 10 weitere Stents wurden für einbehaltene Magnetismus getestet. Schließlich wurden 10 Stents in vitro getestet und 8 weitere Stents wurden in 4 Schweinen implantiert, um die Zellaufnahme und Retention zu zeigen.

Zusammenfassung

Schnelle Endothelialisierung kardiovaskuläre Stents erforderlich ist, um Stent-Thrombose zu verringern und die Anti-Thrombozyten-Therapie, die das Blutungsrisiko zu verringern, zu vermeiden. Die Durchführbarkeit der Verwendung von magnetischen Kräfte zu erfassen und behalten endothelialen Zellen Auswuchs (EOC) mit Super-paramagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) markiert wurde zuvor gezeigt. Aber diese Technik erfordert die Entwicklung eines mechanisch funktionale Stent aus einem magnetischen und biokompatiblen Material, gefolgt von in-vitro und in-vivo-Tests, um eine schnelle Endothelisierung zu beweisen. Wir entwickelten ein schwach ferromagnetischen Stent aus 2205 Duplex-Edelstahl mit Computer Aided Design (CAD) und sein Design wurde weiter unter Verwendung von Finite-Elemente-Analyse (FEA) verfeinert. Das endgültige Design des Stents zeigten eine Hauptdehnung unterhalb der Bruchgrenze des Materials bei der mechanischen Crimpen und Expansion. Einhundert Stents wurden hergestellt und eine Teilmenge davon wurde für die mechanische Prüfung, ret verwendetained Magnetfeldmessungen, in-vitro Zelleinfang Studien und in-vivo-Implantation Studien. Zehn Stents wurden für den Einsatz getestet, um zu überprüfen, ob sie anhalt Crimpen und Expansionszyklus ohne Ausfall. Weitere 10 Stents wurden unter Verwendung einer starken Neodym-Magneten magnetisiert und ihre beibehalten Magnetfeld gemessen. Die Stents zeigten, dass die zurückgehalten Magnetismus war ausreichend, um SPION-markierten EOC in unserer In-vitro-Studien zu erfassen. SPION-markierten EOC-Abscheidung und Retention wurde in Großtiermodellen durch Implantation von 1 magnetisierten Stent und 1 nicht-magnetisierten Kontrollstent in jedem der 4 Schweinen nachgewiesen. Stent versehenen Arterien wurden nach 7 Tagen explantiert und histologisch ausgewertet. Die in dieser Studie entwickelt schwach magnetischen Stents waren in der Lage, die Gewinnung und Bindung SPION-markierten Endothelzellen, die schnelle Heilung fördern können.

Einleitung

Patienten, denen vaskuläre Stents aus thrombogenen Materialien wie Edelstahl, Kobalt-Chrom und Platin-Chrom implantiert wurden – sowohl Bare-Metal-Stents (BMS) als auch medikamentenfreisetzende Stents (DES) – benötigen eine Thrombozytenaggregationshemmung, um die Thrombusbildung zu verhindern. BMS heilen schnell, unterliegen aber aufgrund unvollständiger Heilung einer Restenose im Spätstadium. DES erfordert aufgrund der verzögerten Heilung eine langfristige Thrombozytenaggregationshemmung. Eine Thrombozytenaggregationshemmertherapie, die zur Vermeidung von Thrombosen infolge einer unvollständigen oder verzögerten Heilung verabreicht wird, führt zu einem erhöhten Blutungsrisiko und ist bei bestimmten Patienten möglicherweise nicht geeignet1,2. Ein idealer Stent heilt vollständig und schnell ab, wodurch eine langfristige Thrombozytenaggregationshemmung und eine Restenose im Spätstadium vermieden werden. Diese vollständige Heilung kann nur erreicht werden, wenn der Stent nach der Implantation schnell mit einer Monoschicht aus Endothelzellen beschichtet wird. Es hat sich gezeigt, dass die Beschichtung der Stents mit biokompatiblen Materialien wie Gold oder anderen Biopolymeren die Thromboresistenz verbessert, aber keine dieser Techniken erreichte eine ideale Blutverträglichkeit, wie sie durch eine Beschichtung mit Endothelzellen möglich wäre3,4.

Ein Stent kann nach der Implantation mit Endothelzellen beschichtet werden, indem zirkulierende Vorläuferzellen angezogen werden. Diese Self-Seeding-Technik kann durch die Verwendung von Liganden und Antikörpern erreicht werden. Diese Technik ist jedoch durch die geringe Anzahl zirkulierender endothelialer Vorläuferzellen begrenzt. Eine vielversprechende Strategie besteht darin, die Zellen unmittelbar nach der Implantation während einer kurzen Phase des Blutflussverschlusses direkt in den Stent zu bringen3,5. Diese Strategie erfordert eine Technik, um Zellen schnell einzufangen und sie auch nach Wiederherstellung des Blutflusses auf dem Stent zu halten. Wir haben eine Technik entwickelt, bei der ein magnetischer Stent verwendet wird, um magnetisch markierte Endothelzellen, die nach der Implantation abgegeben werden, anzuziehen und zu halten. Um dies zu erreichen, ist ein funktionsfähiges BMS mit ausreichenden magnetischen Eigenschaften erforderlich, um magnetisch markierte Endothelzellen einzufangen und zu halten6.

In diesem Artikel diskutieren wir die Methoden zum Entwerfen, Herstellen und Testen eines Stents aus Edelstahl 2205. Die Stents wurden mittels CAD und FEA konstruiert. Die hergestellten Stents wurden mit einem Neodym-Magneten magnetisiert und das zurückgehaltene Magnetfeld mit einer Magnetowiderstands-Mikrosensorsonde gemessen. Anschließend testeten wir die Stents für den magnetisch markierten Zelleinfang in einer Kulturschale während unserer In-vitro-Experimente. Schließlich wurden die Stents in vivo getestet, indem magnetische und nichtmagnetische Stents bei 4 Schweinen implantiert und die Stent-Arterien histologisch analysiert wurden.

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Protokoll

Alle tierexperimentellen Studien wurden von der Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) an der Mayo Klinik genehmigt.

1. Entwurf und Analyse von einem 2205 Edelstahl-Stent

  1. Entwerfen einer Bare-Metal-Stent unter Verwendung von CAD-
    1. Stellen Sie eine extrudierte Hohlzylinder, indem Sie auf 'extrudierten Chef / base "-Funktion mit der Wanddicke gleich der Stentstrebendicke.
    2. Entwerfen Sie ein Stentmuster auf einer anderen Skizze Ebene, die den Strangpresszylinder. Stellen Sie die Breite der flachen Muster, um den Umfang des extrudierten Hohlzylinder entsprechen.
    3. Übertragen Sie das flache Design-Muster auf den Hohlzylinder mit dem Wrap-Funktion.
    4. Speichern Sie das Teil in ihrem nativen Format sowie in ACIS Format für FEA exportiert werden.
  2. Finite-Elemente-Analyse für die Stent-Modelle
    1. Importieren Sie die Volumengeometrie in ACIS-Format gespeichert in den Teil-Modul des FEA-Software für weitere Analytikist.
    2. Modell 2 analytischen Zylinder koaxial mit dem Stent in dem Teil-Modellierer des FEA-Software. Der äußere Zylinder hat einen Anfangsdurchmesser größer als der Durchmesser des Stents der Kreppvorrichtung zu simulieren, und der innere Zylinder weist einen Anfangsdurchmesser von 1 mm, um einen Ballon zum Aufblasen simulieren.
    3. Doppelklicken Sie auf das Strukturelement der Baugruppe Modeler 'Fälle', um die oben genannten Teile zusammenzubauen in relativen Positionen.
    4. Verwenden Sie die Mesh-Modul des FEA-Software, geben Sie den Elementtyp als 20 Knoten Hexaeder-Element mit reduzierten Integration, geben Sie die Elementgröße und Netz den Stent.
    5. Geben reibungs starren Kontaktpaare zwischen dem Stent und der beiden Zylinder jeweils in den "Interaktionseigenschaften" der Modellbaum.
    6. Weisen Sie elasto-plastische Spannungs-Dehnungs-Verhalten von 2205 aus Edelstahl mit dem Stent-Modell.
    7. Randbedingungen zu definieren, um den Außenzylinder bis 1 mm, die den c simuliert zunächst CrimpRimping des Stents. Entfernen des äußeren Zylinders, um die Entspannung des gequetschten Stents simulieren. Erweitern Sie den inneren Zylinder bis 3 mm auf Expansion zu simulieren und schließlich, entfernen Sie den inneren Zylinder, um Rückstoß des Stents zu simulieren.
    8. Definieren Sie die Simulationsparameter einschließlich der Anzahl der Prozessoren und Größe des Arbeitsspeichers im "Analysis" Modellbaum Posten zugeordnet und führen Sie die Simulation.
    9. Sobald die Simulation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Ergebnisdatei (filename.odb) und Post-Prozess die Ergebnisse an den Hauptdehnungen studieren und iterativ zu verbessern, den Stent-Design, um eine Hauptdehnung von 20%, der kleiner ist als der Ausfallgrenze des Materials zu erreichen .

2. Stent Herstellung und Testing für Press- und Expansion

  1. Stent Herstellungs
    1. Besorgen Sie sich die 2205 Edelstahlrohre von gun Bohren und Präzisionsschleifen Stangenmaterial bei einer Präzisionsbearbeitung Unternehmen wie Aktions Precision Products in Pioneer,OH.
    2. Übertragen Sie die präzisionsgeschliffen Röhren und die Abwicklung Stent-Design auf einen Stent Schneid Unternehmen wie Laserage Technology Corporation in Waukegan, IL zum Laserschneiden und Elektropolieren.
    3. Passivieren der Oberfläche der elektro Stents durch Eintauchen davon in einer starken Säure (50% HCl) 10 min lang, gefolgt von einer Basis (10% NaHCO 3) für weitere 10 min. VORSICHT: Gehen Sie mit Chemikalien geeignete Schutzausrüstung und unter einer Abzugshaube. Schließlich, waschen Sie die Stents mit Ethylalkohol und entionisiertem Wasser. Dieser Vorgang wird als Säurebeizen.
  2. Testen von hergestellten Stent zum Crimpen und Expansion
    1. Crimp den Stent auf eine dreifach gefaltete Ballons mit einem Handpresswerkzeug. Halten Sie den Stent und den Dreifach-Ballon in die Crimp-Werkzeug. Drücken Sie den Griff, um radial zu verformen, um den Stent auf dem Ballon gequetscht werden.
    2. Untersuchen Sie den gecrimpten Stent unter Verwendung eines Mikroskops für eine gleichmäßige Kräuselung und keine Anzeichen einer Störung in der Struktur aufgrundim plastischen Bereich.
    3. Erweitern Sie es an die entworfen Durchmesser von 3 mm durch Unterdrucksetzen des trifold Ballon mit Wasser. Untersuchen Sie die erweiterten Stents für die mikroskopische Brüche und gleichmäßige Expansion.

3. Charakterisierung der Stent für Rück Magnetic Field

HINWEIS: Zylindermagneten von 2 Zoll Durchmesser und 1 Zoll Höhe wurde in dieser Studie verwendet. Die Pole des Magneten sind entlang der Achse ausgerichtet. Die Oberflächenmagnetflussdichte des Magneten ungefähr 1 T.

  1. Magnetisieren die Stents diametral oder axial unter Verwendung einer starken Neodym-Magneten. Halten Sie den Stent in der Nähe des starken Magneten für ca. 1 min für die Magnetisierung.
  2. Halten des Stents an einer der ebenen Flächen mit einem Durchmesser entlang der magnetischen Feldlinien an diametral magnetisiert sein oder halten den Stent neben der zylindrischen Fläche, deren Achse entlang der magnetischen Feldlinien, um sie axial zu magnetisieren. Einbehaltene Magnet field des Stents wurde gefunden, daß für mindestens 24 Stunden stabil sein, sondern müssen über die Stents so bald wie möglich nach der Magnetisierung.
  3. Montieren Sie die stents einzeln auf Glasdorne und hängen Sie dann das Glas Dorne in der Präzisionsspannfutter des magnetischen Sondenbefestigung. Magnetische Mikrosonde präzise ohne Berührung der Oberfläche mit der XYZ-Tische Anordnung der magnetischen Sondenvorrichtung (4) nahe dem Stent werden.
  4. Messung der Basislinie Lesen der magnetischen Mikro weit weg vom Stent und dann den zurückgehalten Magnetfeld an der Stentoberfläche durch Positionierung der Sonde unter Verwendung der XYZ-Tische des magnetischen Sondenbefestigung.

4. Magnetzellaufnahmestudien

  1. Gewinnung von Zellen, die Markierung mit SPION und Färbung mit Fluoreszenzfarbstoff
    1. Leiten Sie die endothelialen Zellen Auswuchs (EOC) aus Schweine peripheren Blut wie in 5,7 beschrieben. Kultur in einem T-75-Kolben until etwa 80% konfluent (5x10 6 bis 8x10 6 Zellen).
    2. Synthetisieren SPIONs als 10 nm Durchmesser Magnetit (Fe 3 O 4) Kern, umgeben von 50 nm dicke Poly (milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Schale nach 8,9 beschrieben.
    3. Inkubieren des abgeleiteten EOC mit SPION bei einer Konzentration von 200 ug / ml Zellkulturmedium für 16 Stunden bei 37 o C.
    4. Saugen Sie das Zellkulturmedium sanft. Sanft die Zellen werden durch Zugabe von 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in den Kolben, schaukeln, und Absaugen des PBS.
    5. Färben die Zellen, die mit Fluoreszenzfarbstoff (CM-Dil) zur Visualisierung während der Experimente. Dies wird nach den Angaben des Herstellers durch Zugabe des Farbstoffs zu 10 ml Zellkulturmedium in einer Konzentration von 5 & mgr; l / ml und Inkubation mit den Zellen für 30 min bei 37 ° C durchgeführt.
    6. Waschen der Zellen mit PBS wie in Schritt 4.1.4 und Inkubation mit 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C aufheben die Zellen aus dem Kolben.
    7. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen, oben mit PBS gewaschen und bei 500 xg für 5 Minuten, um ein Zellpellet zu bilden.
    8. Re-suspendieren des Zellpellets in PBS bei einer Konzentration von 1-2x10 & sup6; Zellen / ml und gründlich durch Pipettieren in die und aus der konischen Röhrchen mehrere Male.
  2. In-vitro-Zellstudien
    1. Design und zu verarbeiten (zum Beispiel 3D-Drucken) eine einfache Befestigung des Stents direkt über der Oberfläche eines Deckglases zu halten.
    2. Entmagnetisieren eines Stents unter Verwendung einer elektromagnetischen Degausser oder magnetisieren einen Stent diametral oder axial unter Verwendung einer starken Neodym-Magneten.
    3. Pipettieren Sie die SPION-markierten EOC in PBS in die Schüssel mit den axial magnetisiert oder diametral magnetisierte oder nicht-magnetisierten Kontrollstents suspendiert. Bild die Stents mit EOC in PBS unmittelbar für die Fluoreszenz suspendiert mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop.
5. In-vivo-Tierstudien

  1. Stentimplantation
    1. Zeichnen peripheres Blut von 4 gesunden Yorkshire Schweine - einem Gewicht von etwa 50 kg - 3 Wochen vor der Implantation bzw. Stent und Kultur EOC nach 5,7 beschrieben.
    2. Verwalten Anti-Thrombozyten-Medikament, ab 3 Tage vor der Operation (Aspirin 325 mg und 75 mg Clopidogrel täglich).
    3. Auf der Stentimplantation Tag, betäuben die Schweine mit intramuskulären Telazol, Xylazin und Atropin (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg), wie in den geltenden institutionellen Tierpflege und Leitlinien für die Verwendung angegeben.
    4. Intubieren und legen Sie das Schwein auf Einatmen von 1-2,5% Isofluran-Narkose.
    5. Rasieren Sie die ventralen Halsbereich des Schweins und führen das Verfahren im allgemeinen sterilen Bedingungen.
    6. Implantat 1 magnetisiert und 1 nichtmagnetisierten Stents in der rechten Koronararterie (RCA) unter Verwendung von Standardherzkathetertechnik.
      1. Katheterisierung von Tieren sollte durch eine ausgebildete interventioneller Kardiologe durchgeführt werden. Besuchen Sie das rechte Halsschlagader mit einem 9 Französisch Scheide.
      2. Kanülieren das Ziel der Herzkranzgefäße und injizieren jodhaltigen Kontrastfarbstoff zur Durchleuchtungsbilder zu erhalten.
      3. Legen Sie eine 0,014 Inch Standard koronaren Führungsdraht in die Arterie. Schieben Sie den Ballon und Stent mit diesen Führungsdraht und den Stent in einer 3-3,5 mm Durchmesser Schiffes.
    7. Verstopfen den Blutfluss innerhalb der RCA proximal der implantierten Stents unter Verwendung eines über dem Draht Ballon und liefern etwa 2x10 6 autologe EOC mit SPION in 4 ml PBS über die Zentralkatheter über eine 2-minütige Zeitspanne ausgesetzt markiert.
    8. Wiederherstellung des Blutflusses zum RCA nach 2 min zusätzlicher Okklusion.
    9. Übertragen Sie das Tier in den Aufwachraum und das Tier genau zu überwachen, bis er wieder zu sich kam.
    10. Weiter zum Anti-Thrombozyten-Medikament zu verabreichen (325 mg Aspirin und Clopidogrel 75 mg) nach der Operation bis zum Opfer.
  2. Stent Explantation und Histologie
    1. Euthanize der Tiere 7 Tage nach der Operation durch erste Betäubung des Tieres wie zuvor erläutert und dann intravenös verabreichen eine tödliche Dosis Natriumpentobarbital (100 mg / kg) nach geltenden institutionellen Animal Care und Verwenden Richtlinien.
    2. Chirurgisch Ernte der Stent arteriellen Segmenten. Fixierung der explantierten Arterien in 10% Formalin-Puffer für ein Minimum von 30 min. Lassen Sie die Proben in Formalin-Puffer für weitere histologische Analyse.
    3. Outsource die feste Probe zu Einrichtungen der Lage ist, die Histologie mit Metall-Stents. Während dieser Verarbeitung werden die Proben in Methylmethacrylat eingebettet werden, im Querschnitt, und mit Mallorys Färbetechnik mit Berliner Blau Färbung für Eisenpartikel histologisch analysiert.

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Ergebnisse

Iterative Stentdesign basierend auf FEA (Abbildung 1) zeigte einen Stent, der Kräuselung und erweitern mit einer Hauptdehnung von 20%, die weniger als 30% der Bruchdehnung ist kann. Press- und Expansionstest (Abbildung 2) zeigte keine Anzeichen von Bruch. Fotos von der verformten Stent zeigte eine gute Übereinstimmung mit FEM berechneten Verformungen und auch Mikroskopie Bilder zeigten keine Frakturen (Abbildung 3). Wie aus dem Bilanzmagnetfeldmessungen (A...

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Diskussion

Wir entwickelten eine magnetische Stent, der als ein Bare-Metal-Stent funktionieren kann und SPION-markierten Endothelzellen zu gewinnen. In früheren Studien, bei denen magnetische Stents haben Forscher vernickelt kommerziellen Stents und Spulen oder Maschen aus magnetischen Materialien bestehen aufgrund der Nichtverfügbarkeit eines ferromagnetischen Stent 5,10-14 verwendet. Andere Gruppen haben auch für die Ausrichtung von Nanopartikeln beladen Endothelzellen 3 verwendet die paramagnetischen Chara...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Tyra Witt, Cheri Mueske, Brant Newman und Dr. Peter J. Psaltis, MBBS, PhD für ihre wertvollen Beiträge. Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung – FNUSA-IKRK (Nr. CZ.1.05/1.100/02.0123), American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N), National Institutes of Health (T32HL007111) und The Grainger Innovation Fund – Grainger Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2205 EdelstahlCarpenter Technology CorporationRundstahlmaterial
AbaqusDassault SystemsSoftware
AtropinVerschreibungspflichtiges Medikament.
ClopidogrelHandelsname: Plavix. Verschreibungspflichtiges Medikament.
CM-DiILife TechnologiesV-22888Molekulare Sonden, Eugene, OR
Endotheliales Wachstumsmedium-2LonzaCC-3162
Handheld-CrimpwerkzeugBlockwise engineeringM1-RMC
Salzsäure (HCl)Sigma AldrichMFCD00011324ACHTUNG: Schutzausrüstung und Griff unter dem Abzug
Isofluran-AnästhesiePiramal Critical Care, Inc. 
EthylalkoholSigma AldrichMFCD00003568
NdFeB Magnet 2" Durchmesser x 1" dickErstaunliche MagneteD1000PAxial magnetisierter Scheibenmagnet mit Polen auf flachen Flächen
Over-The-Wire Trifold BallonJeder kommerziell erhältliche OTW Trifold Ballon
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies10010-023Allgemein bekannt als PBS
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma AldrichMFCD00003528
Natrium-PentobarbitalZoetisHandelsname: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Geregelte Substanz darf nur von einem zugelassenen Tierarzt bestellt
werden SolidWorksDassault systemsSoftware
SpinTJ-020 MikrosensorMicroMagneitcs Sensible SolutionsLange Sonde STJ-020 Mikrosensor
SPIONMayo ClinicIntern synthetisierte Nanopartikel (Ref: Lee, S. J. et al. Nanopartikel aus magnetischen Eisenoxiden, verkapselt mit Poly(D,L-Llatid-co-glycolid) und ihre Anwendungen auf Magnetresonanztomographie-Kontrastmittel. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
TelazolZoetis KontrollierteSubstanz, die nur von einem zugelassenen Tierarzt bestellt werden
darf Trypsin EDTALife Technologies25200-056Gibco, Grand Island, NY
XylazinBayer Animal HealthHandelsname: Rompun. Kontrollierte Sonnenstrahlen dürfen nur von einem zugelassenen Tierarzt bestellt
tragen kann verwendet werden werden

Referenzen

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Schlagwörter

Ferromagnetischer StentSPION Markierungcomputergest tztes DesignFinite Elemente Analysemechanisches Crimpenmagnetische FeldretentionIn vitro StudienIn vivo Implantationhistologische Analyse

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