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Darstellende Permanent Distal cerebri mit Arteria carotis communis Occlusion bei alten Ratten zu studieren kortikale Ischämie mit anhaltenden Behinderungs

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DOI:

10.3791/53106

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23. Februar 2016

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1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll permanent distalen mittleren Hirnarterie bei älteren weiblichen Ratten bei gleichzeitiger Verschluss der Halsschlagadern zu produzieren große kortikale Infarkte und anhaltende Defizite zu erzeugen. Wir zeigen die Bestätigung der Größe der Läsion mit strukturellen MRT bei 24 Stunden und 8 Wochen nach dem Schlaganfall.

Zusammenfassung

Schlaganfall tritt in der Regel bei älteren Menschen mit einer Reihe von Begleiterkrankungen einschließlich Halsschlagader (oder andere arterielle) Arteriosklerose, Bluthochdruck, Übergewicht und Diabetes. Dementsprechend wird, wenn Therapien für Schlaganfall bei Tieren Auswertung ist es wichtig, ein Modell mit hervorragenden Augenscheinvalidität auszuwählen. Der ischämische Schlaganfall ist für 80% aller Schlaganfälle, und die meisten von ihnen kommen in das Gebiet der mittleren Hirnarterie (MCA), häufig Infarkte zu induzieren, die die sensomotorischen Kortex beeinflussen, was zu anhaltenden Querschnittslähmung oder Lähmung auf der Gegenseite des Körpers. Wir zeigen in diesem Video ein Verfahren zur ischämischen Schlaganfall bei älteren Ratten produzieren, die anhaltenden sensomotorischen Behinderung und wesentliche kortikalen Infarkten führt. Genauer gesagt, veranlassen wir permanent distalen mittleren Hirnarterie (MCAO) bei älteren weiblichen Ratten durch Diathermie Pinzette ein kurzes Segment der Arterie zu verschließen. Die Halsschlagader auf der ipsilateralen Seite der Läsion wurde dann permanently verschlossen und die kontralaterale Halsschlagader wurde transient für 60 min okkludiert. Wir messen die Größe Infarkt Struktur T2-gewichteten Magnetresonanztomographie (MRT) bei 24 Stunden und 8 Wochen nach Schlaganfall. In dieser Studie betrug die mittlere Infarktvolumen 4,5% ± 2,0% (Standardabweichung) der ipsilateralen Hemisphäre bei 24 Stunden (zum Gehirn korrigiert Schwellung Gerriet der Gleichung, n = 5). Dieses Modell ist machbar und klinisch relevant, da sie die Induktion einer anhaltenden sensomotorischen Defiziten ermöglicht, die für die Aufklärung der pathophysiologischen Mechanismen und neuartige Behandlungsmethoden von Bedeutung ist.

Einleitung

Der Schlaganfall ist derzeit die dritthäufigste Todesursache weltweit und die häufigste Ursache für Behinderung ein. Der ischämische Schlaganfall, die 80% aller Schlaganfälle umfasst, führt oft zu Infarkten in der Hirnrinde führen zum Verlust der Empfindung (zB Propriozeption), in Motorik und in die Aufmerksamkeit auf der betroffenen Seite 2-4. Die Arteria cerebri media (MCA) ist die größte der Schiffe, die Versorgung aus dem Kreis der Willis zieht und stammt aus der A. carotis interna 5. Der MCA ist die Hirngefäßes am häufigsten bei ischämischem Schlaganfall betroffen, mit Schlaganfälle in diesem Gebiet für 65% aller ischämischen Schlaganfällen Bilanzierung 6,7. Die MCA versorgt beide kortikalen und subkortikalen Regionen und neurologische von MCA Schlaganfall verursachte Abweichungen von der exakten Lage des Verschlusses 7 variieren. Proximalen MCA Einschlüsse beeinflussen die tiefe Gebiet durch die lenticulostriatal Arterien und verursachen umfasst große Infarkte sowohl Cortical und subkortikalen Regionen. Im Gegensatz dazu mehr distale Verschlüsse, die ausschließlich kortikalen Regionen des Blutflusses entziehen tendenziell kleiner kortikale Infarkte zu erzeugen.

In großen Bevölkerungsstudien, reichen menschlichen Schlaganfall Läsionen 5-14% der ipsilateralen Hemisphäre 8,9; maligne Hub macht 10% aller Schlaganfälle und gibt größeren Infarkten Anstieg, eine Hemikraniektomie erfordern Hirndruck zu reduzieren, und Patienten mit kleineren Läsionen sind eher 10 zu überleben. Wir zeigen ein reproduzierbares Modell, die Läsionen, die nehmen einen ähnlichen Anteil der Halbkugel, so viele Menschen Schläge erzeugt.

Schlaganfall ist eine heterogene Erkrankung; 75% der ischämischen Schlaganfälle werden durch entweder lacunar Infarkte (von Behinderung von intrakraniellen kleine Gefäße) induziert; kardioembolischen Schlaganfall; oder große Arterie Atherosklerose, die für 30% aller Schlaganfälle ausmacht. Symptomatische Atherosklerose wird am häufigsten an der Stelle beobachtet, wo der gemeinsame carotid Arterie (CCA) verzweigt sich in die inneren und äußeren Halsschlagadern 11.

Vorklinischen Modellen von Schlaganfall sollte ähnlich wie bei dem menschlichen Zustand wie möglich seine Pathophysiologie zu simulieren und sollte die Risikofaktoren für Schlaganfall integrieren. 92% der ischämischen Schlaganfall tritt bei Menschen im Alter von über 65, und andere Risikofaktoren sind Übergewicht, Bluthochdruck und Arteriosklerose, wie zuvor 12 diskutiert. Um besser diese Risikofaktoren darstellen, empfiehlt es sich, ein Modell zu verwenden, die einige der pathophysiologischen Eigenschaften der natürlichen Zustand kann teilen. In diesem Protokoll haben wir fortgeschrittenen Alters und behindert den Blutfluss durch den Halsschlagadern enthalten.

Das klassische Modell der mittleren Hirnarterie (MCAO) ist die intraluminale Faden Modell der proximalen MCA-Okklusion, die den Blutfluss in den vorderen und mittleren Hirnarterien reduziert. Kurze Verschlusszeiten dieses Modell konzentriert sich die lEsion zum subkortikalen Region, während längere Verschlusszeiten bei großen Läsionen führen kann Bereiche sowohl der kortikalen und subkortikalen Bereichen Rekrutierung, bei älteren Ratten zu einer höheren Sterblichkeit führt. Im Vergleich beinhaltet das Modell von unserer Gruppe eine Kraniotomie und Öffnen der Dura durch Koagulation des Blutes und der Zerstörung eines kleinen Teils des MCA mit bipolarer Kauterisation Zange gefolgt ausführt. Diese Diathermie Modell ist aus der 1981 Papier von Tamura et al angepasst. 23 und die Verwendung der Kraniektomie kann intrakranielle Druck erhöht Grenze, die ein Merkmal der geschlossenen Schädel ist, und führt zu einer höheren Reproduzierbarkeit und eine geringere Sterblichkeit in unserer Praxis Kohorte im Vergleich zu einigen anderen Modellen 13. Um reproduzierbare Infarkte erzeugen und anhaltenden Behinderungs wir verschließen permanent das proximale CCA und verschließen vorübergehend das distale CCA nach Chen et al. 14 Wir verwenden nicht-invasive T2-gewichteten Magnetresonanztomographie (MRT) Das Ausmaß und die Lage von Hirninfarkt, und der Grad der Schwellung des Gehirns in der sensomotorischen Cortex zu bewerten.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von institutionellen Richtlinien genehmigt von Kings College London festgelegt, und wurde in Übereinstimmung mit den britischen Home Office Richtlinien und Tiere (Scientific Procedures) Act von 1986 Leitlinien können variieren zwischen den Institutionen durchgeführt werden; bitte die Einhaltung der Richtlinien des Instituts sicherzustellen, bevor Sie dieses Verfahren durchführen. Um aseptischen Bedingungen aufrecht zu erhalten, wenn das Gerät zu berühren, ein großes Stück Alufolie Autoklaven und diese verwenden, um Wrap-around-Geräte wie am Mikroskop und Anästhesiegerät verarbeitet. Sterile Frischhaltefolie (Plastikfolie) können ebenfalls verwendet werden.

1. Vorbereitung

  1. Machen Ratten mit Gelfluid Packungen (Veterinär Erholung Gel) und Weichfutter für mindestens 48 Stunden vor dem Schlaganfall Chirurgie. Da die Tiere oft Schwierigkeiten beim Essen und Trinken nach dem Verfahren zu finden, um die Tiere zu diesen Einzelteilen vor der Operation vorstellen, zu neophobia minimieren. Haus Alten Ratten mit Holz kauen blocks das Auftreten von bewachsen Zähne zu reduzieren (siehe Abschnitt 6).
  2. Sterilisieren alle chirurgische Instrumente vor chirurgischen Eingriffen durch Autoklavieren (mindestens 121 ° C, 15 PSI für 15 min) beginnt. Desinfizieren alle Arbeitsflächen unter Verwendung von 1% Chlorhexidin in 70% Ethanol und Operationstücher verwenden und für die Dauer des Verfahrens aseptischen Bedingungen aufrechtzuerhalten.
  3. Induzieren Läsionen auf der Hemisphäre kontralateral zur bevorzugten Pfote. Weisen Läsionen entweder die linke oder die rechte Hemisphäre abhängig von je Vorzugsvorderpfote der Ratte, bestimmt durch die präoperative Basislinien im Montoya Treppe Test 15 (siehe Abbildung 4). Der Einfachheit halber, wenn dieses Verfahren in dieser Handschrift beschrieben wird, ist die linke Pfote die bevorzugte Pfote und Operationen werden auf der rechten Hemisphäre durchgeführt. Verwenden Lister mit Kapuze oder Long-Evans-Ratten für diese Verhaltenstests, wie sie schnell lernen.
    Hinweis: Die Treppe Test wurde entwickelt, Änderungen sowohl Fein- und Grobmann m zu messenovements folgende Motorsystemschäden. Die Treppe besteht aus sieben Stufen auf jeder Seite einer zentralen Plattform. Falls Sie ein Gerät für die Treppenhaus Test nicht zur Verfügung steht, ist der Zylinder Test eine geeignete Alternative für die Prüfung Händigkeit, aber beachten Sie, dass es nur auf diesen Test in diesem Modell der Schlaganfall ein vorübergehendes Defizit ist, und wird daher ungeeignet sein langfristigen Erholung zu messen folgende Behandlung.
    1. Platzieren Sie drei Zuckerpellets in der gut jeder Stufe (21 Pellets pro Seite). Platzieren Ratten in der Treppe Gerät für 10 min und Aufzeichnen der Anzahl von Pellets wiedergewonnen und die Anzahl der Pellets auf jeder Seite verschoben.
      Hinweis: Um die Aufgabe nach der Operation aufgenommen werden, Ratten ein Minimum von 75% Pellets an der Grundlinie abrufen muss.

2. Chirurgie

  1. Verwenden weibliche ältere Lister-Kapuzen Ratten auf 16-18 Monate (250 bis 400 g) und induzieren Anästhesie mit 5% Isofluran in 1,5 l / min O 2. Nach Einleitung der Narkose, reduzierendas Niveau von Isofluran und halten es an einer ausreichenden aber minimiert Tiefe für Chirurgie (zB 1,5-2%). Geben Betäubung des Tieres durch eine Gesichtsmaske und ein Spülsystem verwenden die Chirurgen Exposition gegenüber Isofluran zu begrenzen.
    1. Führen Sie alle bis zu, aber nicht einschließlich Kraniotomie auf Schein-Tiere, wie dieses Verfahren Verhaltensdefizite 16 produzieren kann. Betrachten experimentelle Ziele, wenn MCAO Experimente entwerfen und zu entscheiden, ob ein Schein-Gruppe für Kraniotomie zu kontrollieren sollten einbezogen werden.
  2. Verwalten Schmerzlinderung Vor- oder peri- operativ (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Schnitt).
    1. 1 ml bis 19 ml steriler 0,9% iger Kochsalz der Stammlösung zu bilden und 0,6 ml pro 300 g Ratte injizieren. Die Verwendung von Carprieve über Carprofen bevorzugt, weil der ehemalige bei RT stabil ist.
  3. Rasur das Fell auf der ventralen Halsbereich und Zeitbereich auf der rechten Hemisphäre der Haut freizulegen. Desinfizieren Sie die Operationsstellen uEthanol Tupfer singen. Achten Sie darauf, lokale IACUC Richtlinien für die Haarentfernung zu folgen.
    1. Führen Sie diesen Schritt weg von dem Arbeitsbereich der Menge an Fell an der Einschnittstelle zu minimieren.
  4. Legen Sie die Ratte auf eine Pinnwand mit einem sterilen Tuch in der Rückenlage auf einem Heizkissen abgedeckt. Übernehmen Lidocain Creme auf die rasierten Bereiche des Kopfes und des Halses. Legen Sie eine rektale Sonde zu überwachen und das Tier die Temperatur zwischen 36,5 bis 37,5 ° C mit einer homeothermic System aufrechtzuerhalten.
    1. Setzen lacrilube Salbe auf die Augen Austrocknen zu verhindern. Geben Sie der Ratte eine Injektion von Atropin Sulfatlösung (0,05 ml einer 600 ug / ml Lösung, subkutan) Trachealsekrete zu reduzieren.
      Hinweis: Die Forscher berücksichtigen sollten physiologische Variablen wie Blutgase und Druckmessung.
  5. Vor der Operation beginnen, überprüfen Sie die Hinterpfote Prise Rückzug und blinken Reflexe Vollnarkose zu bestätigen.
  6. Unter einer Zerlegung MikroRahmen, machen Sie eine 2 cm zentralen Mittellinienschnitt auf der freigelegten Hals mit einem Skalpell. Bewegen, um die Speicheldrüsen vorsichtig seitlich der Luftröhre auf beiden Seiten.
  7. Schleife nicht resorbierbaren Seidennaht auf der ganzen Haut, die die Halsschlagader auf der einen Seite liegt. die Haut von der Seite mit dem Seidenfaden und halten diese bis auf der Pinnwand mit chirurgischen Band die Halsschlagader zu offenbaren vorsichtig wegziehen. Sorgfältig stumpf die Arterien frei von umgebenden Faszien und der Vagus-Nerven mit feinen Pinzette sezieren.
    1. Achten Sie darauf, die Muskeln oder vagus bei diesem Schritt zu beschädigen, da dies Fütterung beeinträchtigen, Schlucken und Atmen.
  8. Sobald die gemeinsame Arterie Carotis ausgesetzt ist, verwenden Sie nicht resorbierbaren Seidenfaden (5/0), um die Halsschlagader zu isolieren, zuerst die Halsschlagader von den Vagusnerv Trennung durch Umkehr mit feinen Pinzette sezieren und aufpassen, nicht den Kontakt mit den Nerven zu machen. Sobald der Behälter geschleift wurde (aber nicht gebunden) mit der Naht, tnachäffen die Enden des Fadens zusammen mit chirurgischen Band diesen Schritt wird rückgängig gemacht zu verhindern. Entfernen Sie die Nähte, die darüber liegende Haut zurückhalten.
  9. Wiederholen Sie für die andere Seite (Abschnitte 2.7-2.8)
  10. Legen Sie eine sterile Kochsalzlösung getränkten Gaze in die Wunde Gewebe feucht zu halten während der Rest der Operation. Naht locker die Haut und stellen eine zusätzliche Kochsalzlösung getränkten Gaze über den Bereich weiter eine Austrocknung zu verhindern.
  11. Platzieren Ratten in einer seitlichen Position und machen einen Einschnitt in die Haut in der Mitte zwischen dem rechten Augenhöhle und dem äußeren Gehörgang. Ziehen Sie die Haut zu fünf elastische 3 mm Wundhaken mit bis zu der Pinnwand gesteckt und dann stumpf den Schläfenmuskel sezieren den Schädel zu offenbaren.
  12. Legen Sie ein Daumenrad bereinigt schwerkraftgetriebenen Kochsalzlösung über dem offenen Gelände (Durchflussmenge ca. 2 ml / min) und Einrichten eines Gebläses System Knochentrümmer zu entfernen und kleinere Blutungen aus der exponierten Stelle in dieser Phase der Operation zu löschen ( SekteIonen 2,13 bis 2,16).
    1. Setzen Sie die Kochsalzlösung Zapfpistole an der höchsten Stelle des Schädels in der Nähe des Ohres, und die Strahlpumpe Düse an der tiefsten Stelle. Stellen Sie das Rad während Blutungen mehr Kochsalzlösung in das Gebiet zu liefern, um besser die Quelle jeder Zapf für Kauter des Schiffes sichtbar zu machen, die Menge an Zeit reduzieren die Tiere unter Narkose sind.

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Abbildung 1. Chirurgische Einrichtung des permanenten distalen mittleren Hirnarterie Modell. Die Ausstattung des einrichten für die Ratte Craniotomie verwendet wird für die rechte Hemisphäre gezeigt und Einsatz, die Positionierung der Wasserstrahlpumpe und Kochsalzlösung rund um die Kraniektomie Ort. Ebenfalls dargestellt sind die Hauptmerkmale des Gefäßsystems; der mittleren Hirnarterie (rot) und schlechter zerebralen Vene (blau) angezeigt, und der schraffierte Bereich zeigt an, wo die Koagulation der Arterie auftritt.Die Bestätigung der Okklusion durch Schneiden der MCA unterhalb der unteren Hirnvenendurchgeführt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Durchführen einer Kraniotomie auf dem freiliegenden Bereich (etwa 5 mm x 5 mm) mit einem Dentalbohrer mit einem groben 1,6 mm diamantbeschichteten Bohrer Fräse bei ungefähr 8.000 rpm, gewährleistet die Anwendung von kreisförmigen und seitlichen Druck und nicht die Abwärtsdruck während Bohren des belichteten Bereich . Sobald der Knochen dünn genug ist, dass es vollständig transparent aussieht, entfernen Pinzette.
  2. Verwenden Sie eine hausgemachte Dura Haken, hergestellt von einer Spitze des feinen Pinzette Biege etwa 180 °, um einen Lichtbogen bilden, um sorgfältig die Dura zu öffnen, ist vorsichtig die große Oberfläche der Blutgefäße zu vermeiden, da sie empfindlich und leicht zu brechen sind.
    Hinweis: Die freigelegte Bereich des Gehirns wird die Arteria cerebri media (MCA) zeigen; das gewünschte SegmentMaßnahmen etwa 2 mm in der Länge (siehe Abbildung 1, Einschub).
  3. Gerinnen die MCA, von wo aus die untere Hirnvenen kreuzt, Gabelung bis zum Punkt der Arterie und dann entlang der Schwanz Zweige der MCA ein Paar Diathermie Pinzette bis 17 vollständig verschlossenen. Verwenden abgewinkelten Juwelier Diathermie Zange mit 0,25 mm Spitzen.
    1. Wenn die Arterie verschließt, ändern die Kochsalzlösung als notwendig fließen, diesen Bereich zu kühlen, von der Gerinnungs Zange verhindert zu dem Blutgefäß haften. Wenn verschlossen, wird das Blutgefäß schwarz und kein Zeichen von Blutfluss vorhanden sein sollten; Blutfluss kann in teilweise verschlossenen Gefäße gesehen werden.
    2. Schneiden Sie den MCA an dieser Stelle vollständigen Verschluss zu bestätigen. Mit mikrovaskulären Schere, schnitt unter denen der untere Hirnvenen die MCA kreuzt.
    3. Decken Sie die betroffene Stelle mit einer Kochsalzlösung getränkten Gaze-Pad, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  4. Schalten Sie die Ratte wieder in eine Rückenlage position und am Hals die lose gebunden Naht wieder öffnen die Halsschlagadern wieder aussetzen. Ligieren der Halsschlagader auf der gleichen Seite wie der okkludierten MCA (rechts) permanent durch einen Knoten in dem Seidenfaden binden um die Halsschlagader, während die linke Halsschlagarterie vorübergehend verschlossen ist 60 mit 125 g Druck einen 13 mm Edelstahlarterienklammer Minute Locker den Schnitt in den Hals während dieser Zeit vernähen und mit einer sterilen Kochsalzlösung getränkten Gaze auf eine Austrocknung zu verhindern platzieren.
  1. Beachten Sie, dass die rechte Seite des Tieres auf der Chirurg linken Seite, die Rückenlage gegeben sein wird.
  2. Für Schein Tiere, öffnen Sie das ventrale Teil des Halses und temporalen Regionen und die Muskeln trennen die Arteria carotis communis zu lokalisieren, aber verschließen nicht. Haben Schein Tiere unterziehen Verfahren bis zu, aber nicht einschließlich Kraniotomie, wie dieses Verfahren Verhaltensdefizite 16 produzieren kann. Zur Aufrechterhaltung der Blendung anderer tEAM Mitglieder (beispielsweise bei späteren Verhaltenstests), führen Einschnitte und Nähen.

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Abbildung 2. Tandem Halsschlag Okklusion folgenden mittleren Hirnarterie. Die rechte Arteria carotis communis (CCA) wird durch Binden eines Seidenfaden (5/0) um das Blutgefäß (auf der linken Seite des Bildes) dauerhaft verschlossen. Die linke CCA (auf der rechten Seite) wird für 1 Stunde unter Verwendung eines mikrovaskulären Klemme okkludiert. Diese Operationen wurden kümmert nicht durchgeführt, Kontakt mit dem Vagusnerv auf jeder Seite (weiß) zu machen. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Nähen Sie den Schnitt in der Schläfenregion während der 1 h linke A. carotis Okklusion.
  2. Geben Ratten 20 ml Kochsalzlösung subkutan (5 ml an zwei Stellen auf jeder Flanke) Flüssigkeitszufuhr zu halten (siehe6.2).
  3. Wenn 60 Minuten vergangen ist, entfernen Sie den Clip. Übernehmen Kochsalzlösung topisch auf die umgebenden Muskeln, und schließen Sie den Schnitt in den Hals subkutane kontinuierliche Nähte von resorbierbaren Fäden mit (4/0).

3. Postoperative Pflege

  1. Legen Sie die Ratte in einem 31 ° C Inkubator aus der Narkose zu erholen für bis zu 4 Std.
    Hinweis: Die Forscher bevorzugen andere Temperaturen und Zeiten zu verwenden entsprechend den örtlichen Gepflogenheiten.
  2. Wiederholen carprieve (0,25 mg / kg), zur Schmerzlinderung bei 24 Stunden. Da alle Tiere die gleiche Dosis von Carprieve erhalten, ist dieser Faktor für systematisch gesteuert. Alle neuroprotektive Wirkung von Carprieve ist wahrscheinlich vernachlässigbar.
  3. Geben Saline-Injektionen täglich Austrocknung zu verhindern für mindestens die ersten drei Tage. Unter der Annahme, dass eine Ratte 65 ml Flüssigkeit pro kg Körpergewicht (je 24 Stunden) erforderlich ist, sicherzustellen, dass jeder 300 g Ratte ~ 22 ml Flüssigkeit pro Tag erhält.

4. Contigung von Infarkt

  1. Zur Messung verwenden die Infarktvolumen strukturelle MRT.
    Hinweis: Ein alternatives Verfahren histologische Färbung, wie Tetrazoliumchlorid (TTC) zu verwenden könnte, die 18 bis strukturellen MRI Daten zuvor korreliert worden ist. Dies kann jedoch nur am Endpunkt der Studie verwendet werden, und nicht in Längsrichtung.
    1. Vierundzwanzig Stunden nach der Induktion von MCAO, betäuben Ratten mit Isofluran (5% für die Induktion, 1-1,5% für Wartung) in 0,9 L / min Luft und Medical 1 l / min O 2, zur Befestigung eines Quadraturbirdcage-Spule Magnetresonanz (43 mm Durchmesser) und in einem 7-Tesla-horizontale Bohrung Scanner.
    2. Erhalten T2 gewichtete Scans ein Fast-Spin-Echo-Sequenz mit: Echozeit (TE) 60 ms, Wiederholungszeit (TR) 4,000 ms Sichtfeld (FOV) 40 x 40 mm, Erfassungsmatrix 128 x 128, erwerben 40 x 0,5 mm dicke Scheiben in ca. 8 min. Anschließend konvertieren 40 Scheiben in 20 x 1 mm dicke Scheiben durch die resampl miting-Funktion in der medizinischen Bildgebung Software.
  2. Erhalten Läsion Mengen in einem medizinischen Bilddarstellungspaket durch die Querschnittsfläche der Infarkt in 20 Volumina zu messen. Beziehen Sie das Gesamtvolumen durch die Summe dieser Flächen durch die Dicke multipliziert (1 mm). Berechnen Sie die Gruppe bedeuten, Volumen und Standardabweichung. Für Prozentsatz Läsion Volumenberechnungen, erwerben auch die Volumina der ipsilesional und kontraläsionalen Hemisphären.
  3. Zur Korrektur des Gehirns aufgrund von Ödemen Schwellung, stellen diese Werte Gerriets 'Formeln 18 verwenden. Nur sind Scheiben, die Rinde und enthalten keine das Kleinhirn oder Riechkolben nach einer Standard-Ratten Atlas 19 nicht zu einer Überkorrektur enthalten, wie diese negative Läsion Volumen erzeugen kann.
    1. Erwerben T2-gewichteten Bildern wieder 8 Wochen nach Schlaganfall Chirurgie.

5. Probengrößenberechnungen für Zukunftsstudien Beurteilung Neuroprotektion und Verhaltensbesserung

  1. Führen Sie Stichprobengröße Berechnungen der Mindeststichprobengröße zu schätzen, die in Zukunft hypothetische neuroprotektive Experimente erforderlich wäre, mit zwei Gruppen (Kontrolle vs. Behandlung) Wirkungen der Behandlung mit drei verschiedenen Größen (25% Reduktion 50% Reduktion 75% Reduktion) zu identifizieren, indem die a-priori-Algorithmen in Power-Analyse-Software 20 implementiert.
    Hinweis: Leser zu aktivieren ähnliche Berechnungen mit ihren eigenen Daten zu tun, gibt es Screenshots von frei verfügbaren Power-Analyse-Software (siehe Repräsentative Ergebnisse). Verwenden Sie die folgenden Parameter: akzeptabel falsch positiv Rate (dh Typ-I-Fehler Schwelle; α) ≤0.05 und Macht (das entspricht 1-β) ≥0.80 (dh mehr als 80% Leistung). Weiter unten finden Sie Erklärungen und einer Diskussion 21.

6. Ältere Tierschutz nach Schlaganfall Chirurgie

  1. Zur Verfügung stellen zusätzliche Weichfutter einnd Rehydrierung Gel-Packs, dass die Ratten zu gewöhnt wurden vor der Operation, zusätzlich zu den Wasserflaschen mit erweiterten Tipps für einfacher zu erreichen. Darüber hinaus haben eine resorbierbare Erholung Pad in den Käfigen statt lose Bettzeug für die ersten 24 Stunden, und sorgen für zusätzliche Verschachtelung Bettzeug (dh Hackschnitzel vermeiden). Verwenden pürierte Nahrung nicht (zB Babynahrung), wie Ratten, die mit Dysphagie ersticken kann.
  2. Wiegen Tiere täglich für 7 Tage Wiederherstellung zu überwachen. Der Gewichtsverlust ist eine primäre Indikation von Austrocknung und Stress. Der Gewichtsverlust in den ersten Tagen nach der Operation spiegelt hauptsächlich Austrocknung (eher als Verlust an Körpergewicht aufgrund der reduzierten Fütterung).
  3. Wo eine alternde Ratte Gewichtsverlust in keinem Zusammenhang mit der Operation zeigt, ersetzen verlorenes Körpergewicht mit einem Äquivalentgewicht von Flüssigkeiten und die oberen und unteren Zähne inspizieren. Wo Zähne überwuchert sind, betäuben die Ratte mit Isofluran (wie in Abschnitt 2.1), und in Rückenlage
    1. Legen Sie eine 1 ml Spritzenzylinders hinter dem teeth die Weichteile zu schützen. Schneiden Sie eine Handkreissäge (zB, ca. 3 cm Durchmesser) bei hoher Drehzahl, sondern mit langsamen, festen Handbewegungen (zB 3 sec Schnitte). Lassen Sie die Zähne des Ratte zwischen den Schnitten abkühlen. Sicherzustellen, dass der Kreissäge auf dem Dorn montiert ist, so dass die Säge die Zähne in der Drehrichtung gegenüber. Es lohnt sich einzeln verpackt, sterilisiert Dreh Sägen bereit für solche Fälle zu halten.
      Hinweis: Übermäßiges Wachstum sogar bei älteren Ratten auftreten können, wenn auf eine harte Pellet Diät gehalten. Es wird empfohlen, regelmäßig die Zähne bei älteren Ratten überprüft werden.
  4. Wo ein älterer Ratten Gewichtsverlust und Piloerektion in keinem Zusammenhang mit der Operation zeigt, Behandlungsmöglichkeiten mit einem Tierarzt zu besprechen. Betrachten wir menschlich, das Tier zu töten. MRI solcher Tiere können einen Hypophysentumor (häufig bei älteren weiblichen Ratten) zeigen, die nicht operativ und tödlich.

Ergebnisse

Permanente MCAO wurde durch Ausführen Kraniotomie, gefolgt von Koagulation und Zerstörung der Arteria cerebri media durch Diathermie mit Permanent Okklusion der Arteria carotis communis ipsilesional und 60 min Okklusion der Arteria carotis communis kontraläsionalen kombiniert induziert. Eine schematische Darstellung der Einrichtung der Ausrüstung und der MCA verschlossen ist in Abbildung 1, und der Halsschlagadern in 2 (oben) gezeigt.

Stroke Ergebnis wurde auf 40 x 0,5 mm Scheiben durch Messung der Infarktvolumen 24 Stunden und 8 Wochen nach einem Schlaganfall untersucht (von rostralen Ende der Riechkolben zu rostralen Ende des Rückenmarks), um die Region of Interest-Toolkit in einem medizinischen Bildanzeige-Paket. Eine repräsentative T2 gewichtet strukturelle MRT-Untersuchung ist für das gleiche Tier nach 24 Stunden und 8 Wochen (3A) gezeigt. Das Infarktvolumen wurde von den Bereichen des Rattenhirns zeigt eine hyperintensen Signal identifiziert; als T2 Gewichted Bilder zeigen Wasser oder Plasma als helle weiße Fläche. Es ist bekannt, dass es eine Erhöhung in Ödemen und Gehirn nach Schlaganfall Schwellung, und dies kann von einer T2-gewichteten Scan gemessen werden, die histologische Messung der Infarktvolumen 18 korreliert ist. Doch nach Schlaganfall vorhanden frühen Ödem (zB bei 24 Stunden) zu einer Überbewertung des endgültigen Läsionsvolumen (beispielsweise bei 8 Wochen) führen und damit auch wir gegenwärtig mittlere Infarktvolumen angepasst Gerriet der Formeln. 3B zeigt Durchschnittsdaten von das rohe (unbereinigt) Läsionsvolumen bei 24 Stunden als 62,8 mm 3 (± 25,4 mm 3 SD, obere Kurve); diese nimmt 9,8% der betroffenen Hemisphäre (± 4,2% SD, mittlere Grafik). Wenn für Gehirn korrigiert Schwellung Gerriets 'Formeln dieser Wert reduziert sich auf 4,5% (± 2,0% SD, untere Grafik) verwenden.

Stroke Schwere wurde 15 mit dem Montoya Treppe Test gemessen. Kurz gesagt, einnimals wurden vortrainiert auf Zuckerpellets für 4 Wochen vor MCAO Schlaganfall Chirurgie und getestet für 8 Wochen nach Schlaganfall (Abbildung 4) abrufen eine anhaltende Defizit zu bestätigen. Die Ratten wurden in der Treppe Gerät für 10 min und die Anzahl der Pellets abgerufen wurde aufgezeichnet (von 21 Pellets) und dargestellt als Prozentsatz (Gruppenmittelwerte ± Standardfehler) gesetzt. Eine Regressionsanalyse wurde durchgeführt, um die Linie zu den Daten zu passen.

Abbildung 5 zeigt die Fallzahlberechnung Infarktvolumen Daten (für mögliche Auswirkungen der Kandidat Therapien), analysiert einen Algorithmus in Power-Analyse-Software für ein T-Test unter Verwendung von "Differenz zwischen zwei voneinander unabhängige Einrichtungen (zwei Gruppen)" und mit der (nicht korrigiert ) Mittelwert und Standardabweichung von 3B. Die Angaben in Abbildung 5 und Tabelle 1 zeigen, dass 12 Ratten würden pro Gruppe benötigt werden, um eine Therapie zu erkennen, die inf reduziertARCT Volumen um 50% bei 24 Stunden, während 6 ein "XY-Diagramm" der Macht eine unterschiedliche Anzahl von Tieren erreicht werden. Tabelle 1 Probe Größenberechnungen für alle Zeitpunkte zusammenfasst.

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Abbildung 3. T2-gewichteten MRT-Struktur wird nach Schlaganfall Schwellung, die Größe des Infarkts und Gehirn zu messen. (A) Ein T2-gewichteten MR-Bild des gleichen Rattengehirn 24 Stunden und 8 Wochen nach der Induktion eines Schlaganfalls. Die weiße Fläche stellt die Läsion, enthält aber auch einige vasogenen Ödem, die von 8 Wochen auflöst. (B) Infarktvolumen wurden mit einem medizinischen Bilddarstellung Paket Region of Interest Toolkit gemessen und in einem Diagramm darstellen, den Mittelwert ± SD für die drei Zeitpunkten verwendet aufgetragen (n = 6). Raw Läsionsvolumen (nicht für Gehirn korrigiert aufgrund einer Schwellung edEMA), Prozentsatz Läsion betroffen Halbkugel (unkorrigierte für Schwellung) und Prozent Läsion der Hemisphäre für Gehirn korrigiert Schwellung Gerriets 'Formeln werden hier gezeigt. SD wurde anstatt SEM verwendet, um Stichprobengröße Berechnungen (siehe Abbildung 5) durchführen. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Die Treppe Test zeigt Beeinträchtigungen im Erfassen und Abrufen von Pellets. In diesem Hubmodell es gab sehr wenig spontane Heilung. Schlaganfall bei älteren Ratten beeinträchtigt anhaltend Geschicklichkeit und erreichte durch wöchentliche Tests unter Verwendung des "Treppentest" von Pellet gezeigt. Kleines Bild: Ein Bild von einer Ratte den Verhaltenstest durchführen. Die Grafik zeigt den Mittelwert (± Standard Fehler) Anzahl (von 21 abgerufen Pellets, ausgedrückt durch die betroffene Pfote pro Woche in Prozent). n = 5. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Probengröße Berechnungen Gruppennummern von Ratten zu bestimmen, erforderlich, um eine gewünschte therapeutische Wirkung zu erkennen. Dieser Screenshot, aufgenommen von Power-Analyse-Software, zeigt, dass 12 Ratten pro Gruppe erforderlich sind, um eine Therapie zu erkennen, die um 50% Infarktvolumen reduziert bei 24 Stunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Netz erreicht verschiedenen Gesamtzahl der Tiere verwendet wird. Ein "XY-Plot für einen Bereich von Werten" von Power-Analyse-Software die Leistung zeigt, die verschiedene für Experimente erhalten werden würde (gesamt) Zahl älterer Ratten, da die Parameter verwenden in Abbildung 5 dargestellt. in Tabelle 1 sind alle unsere Ergebnisse. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zeit nach Schlaganfall: Anzahl der Ratten pro Gruppe erforderlich, um eine Verringerung der Läsion Volumen zu erfassen:
75% 50% 25%
24 Stunden 6 12 42
8 Wochen 4 5 17

Tabelle 1. Die Berechnung der Stichprobenumfang pro Gruppe für hypothetische zukünftige Experimente. Berechnete Leistungsanalyse-Software (siehe Abbildungen 5 und 6). Tabelle zeigt die Anzahl der Ratten pro Gruppe für eine Zwei-Gruppen-Experiment benötigt, um ein 25%, 50% und 75% ige Reduktion der Läsion Volumen an jedem der Zeitpunkte in dieser Studie festzustellen.

Diskussion

MCAO bei Nagern ist eine Technik, die oft verwendet, um menschliche Schlaganfall zu modellieren. Dieses Modell hat ein paar Details im Protokoll zu vermerken. Erstens ist es wichtig, den Tierkörpertemperatur während des Experiments zu halten, da dies die Größe des Infarkts und die Anzahl der Todesfälle in einer Studie beeinflusst. Es kann möglich sein, Isofluran während der Übergangs Verschluss der rechten CCA und halten Ratten in einem erwärmten, ruhigen Umgebung einzustellen Überlebensrate zu erhöhen, durch die Einwirkung von Isofluran reduziert. Forscher sollten, ob eine kürzere Anästhesie Zeit überwiegt die Belastung von zusätzlichen Induktion betrachten. Das Gefäßsystem (zB MCA Verzweigung) der Ratten variiert innerhalb und zwischen Kohorten von Tieren 22. Es ist wichtig, dies zu berücksichtigen, wenn eine neue Studie beginnen. Verschiedene CCA Verschlusszeiten können (zB 30, 45, 60 und 90 min) ausgewertet werden. In dieser Studie eine Okklusion von 60 min verwendet. In anderen Untersuchungen haben wir gefunden, dass 45min Verschlüsse verursachen einen ähnlich großen kortikalen Infarkt aber mit Anhaltspunkten dafür, verbesserte Überlebensraten. Dementsprechend haben die Chirurgen mit einer kurzen Verschlusszeit starten (zB 30 min), um zu sehen, ob eine ausreichende Läsion Volumen (und / oder erforderlichen Verhaltensdefizite) erhalten werden und nur dann Okklusionszeiten gegebenenfalls zu erhöhen. Verhaltensdefizite bei erwachsenen Ratten nicht nachhaltig im Vergleich zu älteren Ratten mit identischen Okklusion Zeiten.

MRI kann verwendet werden, zu beurteilen, ob (nach einer bestimmten Verschlusszeit) Läsion Volumina für die Studienziele geeignet sind. Eine kleine Läsion würde überspannen weniger als zehn 0,5 mm koronalen Scheiben (von 40). Eine mittelgroße Läsion würde zwischen zehn und zwanzig koronalen Scheiben überspannen. Eine große Läsion würde zwischen zwanzig und dreißig koronalen Scheiben überspannen. Eine sehr große Läsion würde mehr als dreißig der vierzig Scheiben überspannen. Nach unserer Erfahrung Ratten mit sehr großen Läsionen (mehr als dreißig Scheiben) und / oder den Nachweis einer Herniation across der Mittellinie haben in der Regel schlechte Prognose: kürzere Verschlusszeiten angesehen werden könnten. Die MRT ist auch nützlich, um die Infarkt Lage Beurteilung: einige sind mehr kaudal gelegen und einige sind mehr rostral gelegen.

Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie den Vagusnerv aus beiden Halsschlagadern zu trennen. Rasselgeräusche (Raspeln) kann nach einem Schlaganfall Operation auftreten und dies kann zu Nervenschäden bei einigen Tieren zurückzuführen sein könnte, obwohl die Ursache noch unklar ist: in unserer Erfahrung Prognose ist sehr schlecht für diese Tiere und es wird in der Regel empfohlen, sie auf humane Weise zu töten.

Die Dauer Diathermie MCAO-Modell ergibt reproduzierbare kortikale Infarkte und akzeptabel postoperative Überlebensraten bei älteren Ratten. Die Technik hat jedoch erfordern invasive Chirurgie unter einem Stereomikroskop. Es ist wichtig, aseptischen Bedingungen aufrecht zu erhalten, wenn die Tiere gut von der Operation zu erholen sind. Es muss darauf geachtet werden, nicht den MCA zu beschädigen, während auszusetzen und die Arterie Koagulation,und Schäden an der kortikalen Oberfläche sollte sonst der belichtete Bereich der Hirnrinde minimiert werden kann Teil der Infarktbereich bilden. Es wird empfohlen, so viel Erfahrung wie möglich zu erhalten, das Verfahren zu etablieren und konsistente Infarkte und bestimmen Okklusion Zeiten zu erreichen, bevor eine Studie zu testen Kandidaten Therapien durchgeführt wird, zum Beispiel. Experimentatoren sollten alle Behandlungen innerhalb Operation Sitzungen ( "Block Randomisierung") nach Möglichkeit zufällig. Es ist erwähnenswert, dass dieses Modell nicht MCA mit sich bringt Reperfusion (es sei denn, transiente MCA Ligation statt Diathermie verwendet wird). Die Sterblichkeit kann mit diesen großen kortikalen Infarkten bei älteren Ratten hoch sein, aber es sollte möglich sein, die Sterblichkeit zu verringern, indem kürzere Verschlusszeiten durch und durch Bestrahlung mit Vollnarkose, wo möglich zu minimieren (zB während Okklusion). Die Verwendung von 70% N 2 O und 30% O 2 als Träger kann geringere Isofluran ermöglichen, verwendet werden: Mit dieser reduzierten Exposition gegenüber isofluRane kann zu höheren Überlebensraten führen.

Ein weiterer Punkt ist, dass Atherosklerose ein schrittweiser Prozess ist, während sie in diesem Protokoll wir es mit einer akuten CCA Okklusion simulieren. Allerdings simulieren die wesentliche Verringerung der Durchblutung und anhaltende Defizite Tandemverschlüsse, die in vielen Schlaganfall-Patienten auftreten. Permanent distalen MCAO ohne Tandem CCA Okklusion bei Ratten nicht Striche zu induzieren reproduzierbar 14: darüber hinaus ohne Tandem CCA Okklusion, wir haben festgestellt, erhebliche Spontanheilung kommt, dass langfristige Verhaltens Auswertung von Schlaganfall-Therapien über 8 Wochen ausschließt. Im Gegensatz dazu zeigen wir, dass distalen MCAO mit Tandem-CCA Okklusion langfristige Defizite bei älteren Ratten induziert.

Im Ergebnis ist dieses Verfahren in Ratten verursacht Striche, die in Größe und Position auf die in den menschlichen Zustand gesehen ähnlich sind, mit einer anhaltenden Behinderung, die man verwenden kann das Testen von neuen Behandlungen und Aufklärung der re zu ermöglichenPaar Mechanismen nach einem ischämischen Schlaganfall.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten Prof. I Mhairi Macrae und Dr. Debbie Dewar, Universität Glasgow, danken, die freundlicherweise CW und DD für die Schulung in diesem Verfahren eingeladen haben. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM finanziert. Diese Arbeit wurde auch durch einen "Serendipity Grant" des Dunhill Medical Trust an LM unterstützt [Fördernummer: SA21/0512].

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CarprofenNorbrookVm No; 02000/4229geben 0,25 mg/kg
AtropinsulfatAmTechRXATRINJ-100
AlkoholtupferUHS20021
Lidocain Creme (Emla)AstraZeneca0012901Tragen Sie einen erbsengroßen Tropfen auf den rasierten Hals und die Schläfenregion auf
Homömisches DeckensystemHarvard Instruments507222F
PinzetteFine Science Tools11019-12
IsofluranAbbottB506
SeidennähteHarvard Apparat723288
KautersystemEschmann
0,25 mm Juwelier KauterzangeEschmann8330349
feine Dumont PinzetteFine Science Tools11251-10
Daumengetriebenes Tropfsystem
Vacusafe AspiratorsystemINTEGRA BIOSCIENCES158320
1,6 mm grob diamantbeschichtet StahlfräserK801 104 016
Handgeführter DentalbohrerNSK NSKVMAXVRE (Handstück NSKEX6B)
Vannas FederschereFeinmechanikwerkzeuge15000-03
Mikrovaskuläre SchereWorld Precision Instruments501790
4-0 Vicryl-NähteEthicon
Gefäßclip und Applikator
OperationsmikroskopZeiss
Compact Anästhesiesystem Isofluran K/F Single GasVetTech Solutions
Kohlenstoffstahl Skalpellklingen Nr. 10Swann-Morton201
25 g NadelnTerumoNN-2525R
Spritzen (1 ml und 5 ml)TerumoSS+01T1 / SS*05SE1
Kochsalzlösung (Natriumchlorid 0,9%)Fresenius KabiPl 08828/0178
WattestäbchenJohnson and Johnson5000207582502vor Gebrauch Gaze sterilisieren
vor Gebrauch sterilisieren
Medical Imaging Package (Jim)XinapseKostenlose Software
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8)UCLFreie Software
Analysis Software (G*Power)Universitä t Dü sseldorfFreie Software
für Kochsalzlösung Power

Referenzen

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