Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Protokoll für microRNA (miRNA)-Expressionsanalysen in archivierten klinischen Geweben mit Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs (PCa) unter Verwendung von quantitativer Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH).
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Methodenartikel
miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs (PCa) klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Therapie gestellt. In den letzten Jahren microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose entstanden. Jedoch ist die Entwicklung von miRNAs so wirksam Biomarker für Prostatakrebs in hohem Maße von ihrer genauen Nachweis klinisch Geweben. miRNA-Analysen bei Prostatakrebs klinischen Proben ist häufig eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen vereinfachten Workflow beschreiben, für die miRNA-Analysen in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben mit einer Kombination aus quantitative Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH). In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und eingefroren Prostata tissuES und Expressionsanalysen durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur ISH Analysen formiRNA Erkennung in Prostatagewebe mit gesperrten Nukleinsäure (LNA) - basierten Sonden. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) angewendet werden.
Einleitung
Krebs der Prostata ist eine häufig diagnostiziert männlicher Bösartigkeit, die eine der führenden Ursachen von Krebs bedingte Sterblichkeit unter den Menschen ist. In US schätzungsweise 220.800 neue Fälle und 27.540 Todesfälle im Jahr 2015 1 gemeldet werden.
Prostatakrebs ist eine heterogene Erkrankung mit sehr variablen Krankheits Kurs- Tumoren können indolenten oder sehr aggressiv sein. Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Methoden / Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Behandlung 2 gestellt. Stromscreeni....
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Protokoll
Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs Proben wurden aus dem SFVAMC erhalten. Proben wurden von Prostatakrebs-Patienten, die radikale Prostatektomie bei SFVAMC unterzog. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten, und die Studie wurde von der UCSF Ausschuss für Menschenforschung genehmigt. Alternativ wurden Prostatakrebs Gewebe-Mikroarrays aus kommerziellen Quellen beschafft und verwendet für die miRNA-Analysen von ISH. Klinisch-pathologischen und Follow-up-Informationen für analysiert Prostatakrebs-Patienten gesammelt.
1. Gewebeproben
- Geschnitte....
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Ergebnisse
Expression Profiling von miR-203 in LCM primären Prostatakrebs klinischen Proben durch RT-PCR-Analysen (Abbildung 1)
RT-PCR-Analysen von relativen miR-203-Expression in LCM primären Prostatakrebsgewebe und die angepaßten angrenzenden normalen Regionen erfolgt wie in Saini et al. 15 RNU48 beschrieben wurde als eine Kontrolle verwendet wurde. Die folgende Tabelle fasst die relative miR-203 Expression in Prostatakrebstumorgewebe relativ zu benachbarten norma.......
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Diskussion
In diesem Artikel beschreiben wir einen vereinfachten Workflow für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Gewebe. Bei Prostatakrebs, schlagen mehrere Studien eine wichtige Rolle von microRNAs im Prostatakrebs Initiation, Progression und Metastasierung. Allerdings sind widersprüchliche Ergebnisse oft auf einen bestimmten miRNA 22 seit der miRNA-Extraktion erhalten und analysiert Methoden weit auseinander. Im Hinblick auf die Schwellen Nachweise für d.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine finanziellen Angaben.
Danksagungen
Wir danken Herrn Dr. Roger Erickson für seine Unterstützung und Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts.
Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute an der National Institutes of Health
(Förderkennzeichen RO1CA177984; RO1CA138642), VA-Programm Projekt Prostatakrebs (BX001604).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mikrotom | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix für LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternativ kann das Arcutus Xt System von Life Technolgies verwendet werden. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transkriptionskit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR Mastermix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 DIG-markierte | |
| LNA-Sonde für U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP-Substrat | Roche | 11442074001 | |
| Pre-Hybridisierungslösung | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridisierungslösung | Biochain | K2191050-2 | |
| Blockierungslösung | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper | Biochain | K2191050-7 | |
| Wässrige Eindeckmedien | Vector Laboratorien | H-5501 | |
| Trizol (Guanidin-Isothiocyanat-Phenol-Reagenz) | Life Technologies | 15596-018Harris | |
| Hämatoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
Referenzen
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
