Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels und der Homöostase. Subtile Veränderungen im mitochondrialen Stoffwechsel, die die Physiologie des Organismus beeinflussen, könnten in Metabolomik-Studien des gesamten Organismus schwer zu erkennen sein. Hier beschreiben wir eine Isolationsmethode, die den Nachweis subtiler metabolischer Verschiebungen bei Drosophila melanogaster verbessert.

Zusammenfassung

Da Mitochondrien eine Rolle im Aminosäurestoffwechsel, im Kohlenhydratstoffwechsel und in der Fettsäureoxidation spielen, beeinträchtigen Defekte in der mitochondrialen Funktion oft das Leben derjenigen, die an diesen komplexen Krankheiten leiden. Die Erkennung von mitochondrialen metabolischen Veränderungen ist entscheidend für das Verständnis mitochondrialer Erkrankungen und mitochondrialer Reaktionen auf pharmakologische Wirkstoffe. Obwohl der mitochondriale Stoffwechsel den Kern der Stoffwechselregulation bildet, kann der Nachweis subtiler Veränderungen im mitochondrialen Stoffwechsel durch die Überrepräsentation anderer zytosolischer Metaboliten behindert werden, die durch Extraktionen aus dem gesamten Organismus oder ganzem Gewebe gewonnen wurden.

Hier beschreiben wir eine Isolationsmethode, die ausgeprägte mitochondriale metabolische Veränderungen in Drosophila feststellte, die zwischen Ganzfliegen- und mitochondrial angereicherten Präparaten unterschieden wurden. Um die Sensitivität dieser Methode zu veranschaulichen, verwendeten wir eine Gruppe von Drosophila, die genetisch unterschiedliche mitochondriale DNAs (mtDNA) beherbergen, und setzten sie dem Medikament Rapamycin aus. Mit dieser Methode konnten wir zeigen, dass Rapamycin den mitochondrialen Metabolismus in Abhängigkeit vom mitochondrialen Genotyp verändert. Diese Veränderungen sind jedoch in Metabolomik-Studien viel deutlicher, wenn Metaboliten aus mitochondrial angereicherten Fraktionen extrahiert wurden. Im Gegensatz dazu wurden in ganzen Gewebeextrakten Stoffwechselveränderungen, die durch den Wirkstoff Rapamycin vermittelt wurden, nur unabhängig von mtDNAs nachgewiesen.

Einleitung

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, angereicherten mitochondriale Fraktionen, die genug mitochondrialen Metaboliten für Metabolomics-Studien mit Drosophila melanogaster Ausbeute zu entwickeln. Nach unserer Erfahrung Metabolomics-Analyse unter Verwendung von Vollzellextraktionsverfahren sind nicht imstande, subtile mitochondrialen Stoffwechselveränderungen in Drosophila zu erkennen. , Mitochondriale Fraktionierung vor der Metabolomics-Analyse erhöht jedoch die Empfindlichkeit auf der mitochondrialen Metaboliten Verschiebungen zu identifizieren.

Mitochondrien sind Organellen zur Bereitstellung 90% der Energie, die Zellen brauchen für die normale Funktion ¹ verantwortlich. In den letzten Jahren hat man erkannt, dass Mitochondrien spielen in zellulären und organismischen Funktion eine viel dynamischere Rolle als nur die Herstellung Adenosintriphosphat (ATP) und sind nun als Knotenpunkte für die Regulierung der metabolischen Homöostase ^2,3 angesetzt. Mitochondrien sind das Ergebnis eine endosymbiontische Verfahren, bei dem distinct mikrobiellen Linien verschmolzen ~ Vor 1500000000 Jahre ^4. Als Mitochondrien in wahre Organellen entwickelt wurden Gene aus der Endosymbionten in der entstehenden Kerngenom integriert. Bei Tieren heute sind ca. 1500 mitochondriale Proteine ​​kerncodierten während 37 Gene in der mtDNA, von denen 13 kodieren mitochondriale Proteine, die Untereinheiten der Enzymkomplexe der oxidativen Phosphorylierung ⁵ bleibt. Die Koordinierung zwischen den Mitochondrien und Kernfächer benötigt wird, um die ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien zu halten.

Mit den hier beschriebenen Methoden konnten wir mitochondriale Stoffwechselveränderungen in Drosophila, die von Manipulation der Abstimmung zwischen mitochondrialer und nuklearer Genome führen zu erkennen. Wir verwendeten einen Stamm von Drosophila, in der mtDNA von ihrer Schwesterarten D. simulans wurde an einem einzigen D. platziert melanogaster Kern Hintergrund ^6. Diese 'gestört' mitonuclearGenotyp wurde auf die "native", oder co-entwickelt mitonuclear Genotyp D. Vergleich melanogaster, die dasselbe Kerngenom mit seiner nativen D. melanogaster mtDNA. Die D. melanogaster und D. simulans mtDNAs unterscheiden sich um ~ 100 Aminosäuren und> 500 auch Substitutionen, die mitonuclear Kommunikations ^7,8 beeinflussen. Wir erzeugten gesamten Fliegenextrakten und mitochondriale angereicherte Extrakte Metabolit Verschiebungen als Reaktion auf pharmakologische Stress zu studieren. Hier zeigen wir, dass bei der Verwendung der mitochondrialen angereicherten Fraktionen wir erkennen ausgeprägte Veränderungen in der mitochondrialen Metaboliten zwischen dem nativen, co-entwickelt Genotyp tragenden D. melanogaster mtDNAs und die aufgebrochenen Genotyp tragen D. simulans mtDNA. Im Gegensatz dazu sind die Stoffwechselveränderungen zwischen diesen beiden Genotypen subtile Verwendung normaler Verfahren, die gesamte fly Extrakt zu verwenden. Daher, sofern diese Methode einen Weg, um zu verstehen, wie mtDNAs vermitteln mitochondrialen VeränderungenReaktion auf verschiedene Medikamente.

Protokoll

1. Reagenzien und Lösungen

1. Vorbereitung der Fliege Essen und Medien
   1. Wärme fly Inhaltsstoffe 11% Zucker, 2% autolysierte Hefe, 5,2% Maismehl, Agar 0,79% w / v in Wasser in einer Heizplatte bei 90 ° C eingestellt. Rühren regelmäßig, bis eine homogene leicht dichte Mischung erhalten wird. Bereiten Sie ein Endvolumen von 550 ml Fliege Nahrung für insgesamt 100 Fläschchen mit 5 ml Essen Fliegen in jedem.
   2. Von der Wärmequelle zu entfernen, gelegentlich umrühren, bis das Essen kühlt auf 80 ° C abgekühlt und 0,2% tegosept-Methyl-4-hydroxybenzoat in 95% Ethanol gelöst.
   3. Teilen Sie die Lebensmittel in zwei gleiche Volumina. Hinzuzufügen 1,1 ml 50 mM Rapamycin in Ethanol zu einem Volumen gelöst und 1,1 ml Ethanol zu dem Teil des Films. Rühren Sie die Rapamycin und die Ethanollösungen in das Lebensmittel. Seien Sie sicher, dass die Temperatur fällt auf 50 ° C, bevor Drogen.
2. Isolierungspuffer
   1. Bereiten Sie 500 ml Isolationspuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 10 mM 3- (N </ em> morpholino) propansulfonsäure (MOPS) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)] in Wasser.
   2. Den pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid. Der anfängliche pH-Wert sauer sein.
   3. Verwenden Sterilfilter Vorratsflaschen mit 0,22 um Porengröße, um Lösung zu sterilisieren, und speichern Sie sie bei 4 ° C.
3. Wash Buffer
   1. Vorbereitung 500 ml Waschpuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM Tris HCl und 5 mM KH _{2 PO 4]} in Wasser.
   2. Den pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid. Der anfängliche pH-Wert sauer sein.
   3. Verwenden Sterilfilter Vorratsflaschen mit 0,22 um Porengröße, um Lösung zu sterilisieren, und speichern Sie sie bei 4 ° C.

2. Durchführung der Aufzucht der Drosophila-Stämmen

1. Um Larvendichte während der Entwicklung zu steuern, legen Sie 25 Paare von Eltern zu einer Kulturflasche und es ihnen ermöglichen, um Eier für 48 Stunden lag.
2. Eltern entfernen nach 48 h auf Eierdichte zu regulieren.
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 unter Verwendung des Schwellen F1-Nachkommen, also zwei Generationen von dieser Dichtesteuerung erreicht wird.
4. Zu den Erwachsenen zu sammeln, zu betäuben die Fliegen unter Verwendung von Kohlendioxid _(CO 2) und separatem nach Geschlecht.
   1. Verwenden Sie eine einzige Stufenregler geliefert reinen _CO 2 von einem hohen Druck Tank bei einem kontinuierlichen Fluss von 5 psi. Um statische Elektrizität zu vermeiden, Kunststoffschlauch, um _das CO 2 in einen 500 ml Saugflasche mit Wasser zu katalysieren.
   2. Verwenden Sie einen Gummistopfen mit einem Loch, um den Kolben zu versiegeln. Verwenden Sie Kunststoffschlauch, um die seitliche Öffnung des Kolbens zu einer _CO 2-Pad zu verbinden.
   3. Legen Sie die Fliegen in der Unterlage für nicht mehr als 10-15 Minuten. Lassen Sie sich von der Anästhesie während 24 Stunden zu erholen, bevor Sie sie in experimentellen Bedingungen.
5. Um genügend Metaboliten für mitochondriale angereicherten Fraktionen zu erzeugen, verwenden Sie 300 Fliegen je Probe. Hier verwenden Weibchen, aber gender kann in anderen Experimenten abweichen. Übertragen Sie 150 Fliegen auf einen hausgemachten 1 L Demographie Käfig. Ermöglichen den Zugang zu 5 ml Fliege Essen in einem Fläschchen.
6. Übertragen Sie die verbleibenden 150 Fliegen auf einen anderen 1 L Käfig. Käfige übervölkern nicht mit mehr als 150 Fliegen.
7. Verwenden Sie sechs Parallelproben pro Versuchsbedingung. Seit gesamte tierische Extrakte liefern weitere Stoffwechselprodukte, zu erzeugen 1 Probe von Voll Tier isoliert, übertragen 50 weibliche fliegt in einem Käfig. Wie für die mitochondriale Isolate, verwenden sechs Parallelproben pro Versuchsbedingung.
8. Ort Käfigen bei 25 ° C mit dem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
9. Für Frischnahrungs alle 2 oder 3 Tage in einem Fläschchen mit 5 ml von Lebensmitteln, um die Lebensmittelqualität aufrecht zu erhalten.
10. Pflegen Fliegen auf Nahrung für 10 Tage. Dieser Schritt wird für die Rapamycin-Behandlung ⁷ notwendig. Andere Behandlungen oder Bedingungen unterscheiden.

3. Isolierung der mitochondrialen Fraktionen

1. Dump fliegt von einem Käfig (150 Linie) in eineGlas-Dounce-Homogenisator mit Teflon mit 1 ml gekühltem Isolationspuffer gefüllt.
2. Homogenisieren, indem Sie den Stößel nach oben und unten für 15 Schlägen. Halten Sie den Mörtel auf Eis, um Mitochondrien intakt zu halten.
3. Übertragungs Homogenisat in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei 4 ° C.
4. Nehmen den Überstand und zentrifugieren bei 6.000 × g für 10 min bei 4 ° C für Mitochondrien zu bereichern.
5. Da der Überstand enthält die cytosolische Fraktion, den Überstand verwerfen oder verwenden sie für alternative Experimente. Das Pellet in 300 ul Waschpuffer.
6. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,5 für den zweiten Käfig. Kombinieren Sie die resuspendierten Pellets beider Käfige in einer Tieftemperatur-Mikrozentrifugenröhrchen.
7. Zentrifuge bei 6000 × g für 10 min bei 4 ° C.
8. Überstand verwerfen und Flash-einfrieren das Pellet in flüssigem Stickstoff.
9. Bewahren Sie die mitochondriale angereicherten Fraktionen bei -80 ° C oder niedriger Temperatur.
   1. Alternativ können für ganze Tiervorgereitung, legen Sie die Erwachsenen in einer Tieftemperatur-Mikrozentrifugenröhrchen. Flash-einfrieren Die Durchstechflasche im flüssigen Stickstoff und speichern Erwachsenen bei -80 ° C oder niedriger Temperatur.

Ergebnisse

Verwendung des Protokolls oben erläutert, metabolomic Analyse führten wir auf die mitochondriale angereicherten Fraktionen und ganzen Tierextrakten, um die Wirkung des Medikaments auf Rapamycin abweichenden mtDNAs ⁷ testen. Wir lieferten 200 uM von Rapamycin durch Lösen des Arzneistoffs in der Flug Nahrung. Fliegen wurden Rapamycin für 10 Tage ausgesetzt. Stoffwechselprodukte aus Vollfliegenextrakten und von mitochondrialen Extrakte wurden mit Hilfe der Gaschromatographie...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: 1) die Aufzucht genug Fliegen in reichlich Platz. Es ist sehr wichtig, um die Demographie Käfigen mit mehr als 150 Fliegen je nicht übervölkern; 2) Veränderung der Lebensmittel der Käfige häufig Nahrungskonkurrenz und Ernährungs Stress zu vermeiden; und 3) die Beibehaltung aller Proben bei 4 ° C, um die Integrität während der Isolierung der mitochondrialen Fraktion zu gewährleisten. Es wird auch empfohlen, den Isolationspuffer, der Waschpuffer und das Glas-Dounce-Homoge...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 % Tegosept-Methyl-4-hydroxybenzoat	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 Pads zur Betäubung von Fliegen	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 L Käfig	Web Restaurant Store	999RD32
1 L Käfigdeckel	Web Restaurant Store	999LRD
ein Glas-Teflon-Homogenisator	Fisher Scientific	NC9661231
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S8045
Rapamycin	LC Laboratorien	R-5000
Anti-Porin	MitoSciences	MSA03
Anti-Alpha-Tubulin	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 Pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
Filterflasche	enasco	SB08184M
Gummistopfen	enasco	S08512M

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