Methodenartikel

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

DOI:

10.3791/53154

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22. Dezember 2015

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1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Zusammenfassung

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Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind wichtige molekulare Ereignisse in der Biologie. Es bleibt jedoch eine Herausforderung, PPIs mit ausreichender Auflösung und Empfindlichkeit in Zellen sichtbar zu machen, da die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie auf ~250 nm beugungsbegrenzt ist. Durch die Kombination der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) können PPIs in Zellen mit Einzelmolekülempfindlichkeit und räumlicher Auflösung im Nanometerbereich sichtbar gemacht werden. BiFC ist eine häufig verwendete Technik zur Visualisierung von PPIs mit Fluoreszenzkontrast, bei der ein fluoreszierendes Protein in zwei nicht fluoreszierende Fragmente aufgespalten wird. PALM ist eine neue hochauflösende Mikroskopietechnik zur Abbildung biologischer Proben im Nanometer- und Einzelmolekülbereich, bei der phototransformierbare Fluoreszenzsonden wie photoaktivierbare fluoreszierende Proteine (PA-FPs) verwendet werden. BiFC-PALM wurde durch die Spaltung von PAmCherry1, einem PA-FP, das mit PALM kompatibel ist, aufgrund seiner monomeren Natur, seiner guten Einzelmolekülhelligkeit, seines hohen Kontrastverhältnisses und seiner Nützlichkeit für Stöchiometrie-Messungen demonstriert. Wenn PAmCherry1 zwischen den Aminosäuren 159 und 160 aufgeteilt wird, kann es zu einer BiFC-Sonde verarbeitet werden, die bei 37 °C effizient rekonstituiert wird, eine hohe Spezifität für PPIs und eine geringe unspezifische Rekonstitution aufweist. Die Ras-Raf-Wechselwirkung wird als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie BiFC-PALM hilft, Wechselwirkungen auf der Nanometerskala und mit Einzelmolekülauflösung zu untersuchen. Ihre Diffusion kann auch in lebenden Zellen mit Hilfe von Single Molecule Tracking (smt-) PALM verfolgt werden. In diesem Protokoll werden Faktoren diskutiert, die bei der Entwicklung der Fusionsproteine für BiFC-PALM zu berücksichtigen sind, die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme und die Datenanalyseschritte erläutert und einige beispielhafte Ergebnisse vorgestellt. BiFC-PALM bietet eine hohe räumliche Auflösung, Spezifität und Sensitivität und ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von PPIs in intakten biologischen Proben.

Einleitung

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Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind grundlegende Biologie 1 und dicht über Raum-Zeit-Mechanismen über viele Zeit- und Längenskalen geregelt. Untersuchungen an Zellsignal auf der Zellmembran beispielsweise mit dynamischen nanoskaliger Orts Kompartimente spezifischen PPI und zelluläre Prozesse 2 zu erleichtern enthüllt. Daher ist die Fähigkeit, die PPI in biologischen Systemen mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung, hohe Spezifität und eine hohe Empfindlichkeit Sonde Schlüssel zu einem mechanistischen Verständnis der Biologie.

Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist einer der wenigen ....

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Protokoll

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1. Klonierung

  1. Bestimmen Sie die Konfigurationen zu klonen, und wählen Sie einen Linker. Tag-Proteine ​​mit den Fragmenten auf der N- oder C-Terminus, wie unten beschrieben, so dass sie ihre eigentliche Lokalisation zu stören. Verwenden Sie einen flexiblen Linker, wie beispielsweise (GGGGS) x2.
  2. Genetisch markieren die Proteine ​​von Interesse für die PAmCherry1 Fragmente. Als eine Option, verwenden Sie die in der Materialliste, die die Fragmente RN (PAmCherry1 Reste 1-159) und RC (Met zzgl PAmCherry1 Reste 160-236) mit flankierenden MCS-Sequenzen aufgeführt Klonierungsplasmide.
    1. Linearisieren die Plasmide, die die Fragmente RN und RC mit i....

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Ergebnisse

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Das gezeigte BIFC-PALM Beispiel ist KRAS-mutierten G12D Interaktion mit den Ras-Bindungsdomäne (RBD) von Craf (Abbildung 1A). Wie diskutiert, wurden die RN oder RC-Fragmente nicht an den C-Terminus von Ras markiert, weil es die Membranlokalisierung und daher die biologische Aktivität von Ras unterbrechen. Dies reduziert die möglichen Kombinationen von acht auf vier (1B). Jede dieser vier Kombinationen wurde in U2OS-Zellen unter Verwendung von lentiviralen Infektion eingeführt. Die Zelle.......

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Diskussion

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BiFC hat eine allgemein verwendete Technik zur Erfassung und Visualisierung PPIs in Zellen, während PALM ist ein neues einzelnes Molekül Auflösungs Mikroskopietechnik, die nanoskalige Abbildungs ​​intakter biologischer Proben ermöglicht. Die Kombination von BIFC mit PALM erreicht selektiven Abbildung von PPI in einer Zelle mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekülempfindlichkeit. BIFC-PALM erweitert den Nutzen der beiden Techniken, und wie in dieser Arbeit gezeigt, ist äußerst viel versprechend bei der Aufdeckung de.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Steven Chu und Dr. Joe W. Gray für hilfreiche Diskussionen, Henry Marr für seine anfängliche Arbeit am BiFC-PALM-Projekt und Alexis Shoemaker für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch Startkapital für X.N. von OHSU unterstützt. Die Forschung im Nan-Labor wurde auch von NIH 5U54CA143836-05, der Damon Runyon Cancer Research Foundation, dem M. J. Murdock Charitable Trust und der Firma FEI unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MikroskoprahmenNikonTi-U
60X Ölimmersions-TIRF-Objektiv mit 1,49 NANikonCFI Apo TIRF 60x H
EMCCD-KameraAndoriXon Ultra 897
561 nm LaserOpto EngineMGL-FN-561
405 nm LaserCoherentCUBE-405 50mW
561 nm dichroitischer SpiegelSemrock  Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm FilterSemrockFF01-525/45-25
405/561 nm KerbfilterSemrockNF01-405/488/568-25
Temperatur und CO2 kontrollierter TischTokai HitINUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCSAddgene60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCSAddgene60546
pcDNA3.2-DESTLife Technologies12489-019
pLenti-DESTAddgene
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseThermo ScientificF-531
In-Fusion HD KlonierungClontech639649
LR ClonaseLife Technologies11791
Vira Power Lentivirus VerpackungLife TechnologiesK497500
X-tremeGENE TransfektionsreagenzRoche13873800
Lab-Tek II Kammer-DeckglasThermo Scientific155409#1,5 Glasbodenschalen
U2OS-ZellenATCCHTB-96
293T/17 ZellenATCCCRL-11268
DMEM mit PhenolrotLife Technologies11995
DMEM ohne PhenolrotLife Technologies21063
Fötales RinderserumLife Technologies10082
Leibovit's L-15, ohne PhenolrotLife Technologies21083-027
Reduziertes SerummediumLife Technologies31985
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies14040
SpritzeBD Biosciences309604
SpritzenfilterMilliporeSLHV033RB
Lentiviraler KonzentratorClontech631231
Retroviraler KonzentratorClontech631455
10 cm Kultur SchaleBD Biosciences353003
6-Well-KulturplatteBD Biosciences353046
PolybreneSigma107689
PuromycinLife TechnologiesA11138
G-418Calbiochem345812Neomycin
DoxycylinFisherBP2653
Tris-BaseFisherBP152
EDTASigmaEDS
NatriumhydroxidSigmaS5881
ParaformaldehydSigma158127
GlutaraldehydSigmaG6257
PIPESSigmaP6757
HEPESSigmaH4034
EGTASigma3777
MagnesiumsulfatSigmaM2643
KaliumhydroxidSigma221473
NatriumchloridFisherBP358
MagnesiumchloridFisherM33
100 nm GoldpartikelBBI SolutionsEM. GC100
Wasser in molekularer QualitätLife Technologies10977
Dpn1New England BiolabsR0176
PCR-AufreinigungskitQiagen28104
Miniprep-KitQiagen27104
Midiprep-KitMacherey-Nagel740410
0,6 ml MikrozentrifugenröhrchenFisher05-408-120
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenFisher05-408-137
15 ml RöhrchenFisher05-539-12
5 ml Polypropylen-RundbodenröhrchenBD Biosciences352063
14 ml Polypropylen-RundbodenröhrchenBD Biosciences352059
50 ml RöhrchenBD Biosciences352070
PCR-RöhrchenGeneMateC-3328-1
SOC MediumLife Technologies15544
LB BouillonBD Biosciences244610
KanamycinsulfatFisherBP906
Kompetente ZellenLife TechnologiesC4040
MatlabMathworks
http://www.addgene.org/Eric_Campeau/

Referenzen

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  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.

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Schlagwörter

Protein Protein InteraktionenEinzelmolek l TrackingSuperresolution Mikroskopienanometergenaue r umliche Aufl sungLive Cell Imagingfluoreszierende Proteinfragmentephototransformierbare SondenRas Raf Interaktion

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