Introduction
蛋白质-蛋白质相互作用（质子泵抑制剂）是基本的生物学1和经由跨许多时间和长度尺度时空机制紧密调节。研究细胞在细胞膜上的信号，例如，已揭示动态，纳米级的空间隔室，以促进特定质子泵抑制剂和细胞过程2。因此，探讨生物系统的生产者价格指数有足够的空间和时间分辨率，高特异性和高灵敏度的能力，关键是要实现生物的机械理解。
双分子荧光互补（附设）是用于可视化的生产者价格指数在细胞与亚细胞分辨率和活细胞相容性3存在的少数手段之一- 5。该技术是相对简单的，并且涉及一个荧光蛋白为两个非荧光片段的分裂;当遗传标记，以两个相互作用的蛋白质和使得接近，所述片段可重组，以形成一个完整的荧光蛋白，产生荧光信号。如果设计得当，附设探头不应该自发重组在没有生产者价格指数。这样，在一个附设测定荧光信号将仅出现在质子泵抑制剂的存在下，使质子泵抑制剂以高特异性的直接可视化。使用荧光作为读出的附加好处是高灵敏度，亚细胞的分辨率，并具有高通量和高含量筛选测定法，等等的兼容性。对于这些好处，已经开发了许多基于不同母体的荧光蛋白质附设探针。正如在基于常规的光学显微镜所有其它检测技术，但是，附设的空间分辨率由光的衍射限于〜250纳米。这使得它的挑战，研究生产者价格指数的调控在纳米尺度，对此，由脂质筏6先前提到并举例第二拉斯纳米团簇7，是一个重要的尺度来理解许多细胞过程，如信号。
附设已结合光敏定位显微镜（PALM）8,9克服这个限制的空间分辨率的成像生产者价格指数10。 PALM是绕过通过随机激活和单荧光分子subdiffractive本地化荧光成像衍射极限的近超分辨率显微镜技术。在每个激活周期，荧光分子发出几百到几千光子并产生了一个单分子图像在检测器上。当图像衍射极限（〜在宽度250纳米），其质心可以以更高的精确度来确定，通常在10-50纳米根据所检测的光子数的顺序。通过激活和定位于样品中的每个荧光分子，高分辨率图像可以被重建。 PerformeD于活细胞，单分子跟踪（SMT-）PALM进一步允许采集的数千蛋白扩散轨迹从单电池 11。重要的是，PALM使用专门的荧光探针，如光活化荧光蛋白（PA-FPS）来实现随机启动。由于两个附设和Palm使用荧光蛋白，他们通过分割PAmCherry1，常用的PA-FP对于Palm，变成氨基酸159和160之间的两个片段合并。
基于分裂PAmCherry1的附设系统显示来自两个片段自发重建低背景信号。当遗传标记，以一对相互作用的蛋白质，这两个片段（RN =残基1-159; RC =蛋氨酸+残基160-236）再生有效，即使在37℃和无孵育在较低温度下，以形成完整的PAmCherry1蛋白，其是不为其他附设对12如父mCherry 13的情况。 Furthermo重，再溶解后PAmCherry1蛋白保留了母体PAmCherry1的光物理性质，诸如高对比度，中等光子产率，和快速光活化，等等，这对于精确的单分子的定位和高分辨率的PALM成像是至关重要的。
在这个协议中，利用附设掌的成像U2OS细胞的Ras-Raf的交互，采用分体式PAmCherry1（ 图1A）中描述。第一步是设计构建用于表达PAmCherry1片段（ 即 ，RN和RC）和感兴趣的蛋白质之间的融合蛋白。从理论上讲，对于每对候选蛋白（A和B）的，有八个对融合蛋白进行测试：RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B;和A-RC / B-RN。这个过程通常可以通过考虑候选蛋白的结构或生物化学特性被简化。在的Ras的情况下，该蛋白质是翻译后修饰的C-末端CAAX盒（C =半胱氨酸; A =脂族; X =任何），在这之后AAX基序被裂解掉。因此，RN或RC只能融合到的Ras的N-末端;这降低了融合蛋白对四个（图1B）的数目。对于Raf的，所述的Ras结合结构域（RBD残基51-131）的使用，并且能够进行标记两端。生成这四个融合配置：RN-KRAS / RC-RAF RBD; RN-KRAS / RAF RBD-RC; RC-KRAS / RN-RAF RBD;和RC-KRAS / RAF RBD-RN。
此外，片段和所关心的蛋白之间的连接体将需要被考虑。约10个氨基酸柔性接头常常被用来作为它提供了足够的自由互补发生。一个这样的接头是（GGGGS）×2，虽然有许多人已成功地应用，包括从一个多克隆位点（MCS）14生成的随机序列。所述接头的长度可能需要被优化，取决于不感兴趣的蛋白质和当相互作用及其取向的大小克。
所述PAmCherry1片段被包含在一小克隆骨干具有侧翼的MCS（参见材料清单）。目的基因可以通过限制性位点或具有结扎无关的方法插入。之后克隆和序列验证，表达盒转移到使用重组酶反应中，克隆过程具有高保真和高效率的表达载体。
接着，将得到的表达构建体转染到靶细胞系，或者，如果一个稳定的细胞系是理想的，包装成慢病毒为感染靶细胞系。瞬时转染允许附设配置快速验证，但是潜在的问题必须注意。使用的化学品经常染强调细胞，导致高自发荧光;而采用全内反射荧光（TIRF）microsco的吡啶可以通过限制所述照明体积，TIRF理想当质子泵抑制剂发生在细胞膜上缓解这个背景信号。此外，瞬时转染往往导致高水平的蛋白表达的，远超过那些内源蛋白质，这可能会导致在检测所述质子泵抑制剂工件。因此，建议的稳定细胞株后的适当附设配置已通过初步测试被确定来建立。稳定细胞株也有通过多西环素诱导15为可调表达的潜力。
感染后，将细胞进行选择用的抗生素，通常嘌呤霉素和新霉素，每个构建体。对于样品制备，图像采集和数据分析的后续步骤将在详细的协议进行说明。
采用这种方法，纳米簇中的的Ras-Raf的RBD附设-PALM图像形成例行观察（图2A </ STRONG>）。一致，对的Ras-Raf的RBD SMT-PALM轨迹显示在扩散状态（图2B-D）的一个非均匀分布。这些结果表明，在多个状态存在于细胞膜上的Ras-Raf的络合物，据推测为单体和簇，具有潜在的生物学意义。这项工作表明在质子泵抑制剂在细胞与纳米空间分辨率和单分子灵敏度，这将是很难获得与常规附设，荧光共定位，或荧光共振能量转移（FRET）的选择性成像附设-PALM的功率。
当设计附设实验和解释的结果，要记住的附设过程是不可逆在大多数情况下，包括分裂PAmCherry1是重要的。一旦两个片段结合并形成一个完整的PAmCherry1蛋白，这两个片段之间的联系，因此，PPI成为永久性的。这限制了使用附设和附设-PAL的M表示监视质子泵抑制剂的动力学（即，结合动力学，而不是蛋白质复合物一旦被形成在扩散动力学），有时甚至有可能导致到PPI络合物的错误定位。
一个附加的需要考虑的因素在设计附设-PALM实验是延迟在发色团成熟所固有的荧光蛋白质。一旦两种蛋白质相互作用和在FP片段聚集在一起，它们通常重折叠的秒（60秒的一半时间为EYFP 3）的数量级。然而，随后的发色团成熟和荧光信号开发分钟的量级。虽然荧光可在拆分 金星，快速折叠YFP变种重建后10分钟内检测，半时间成熟，一般往往是约60分钟16。分裂PAmCherry1观察到有类似的速率。因此，附设及附设掌是监视实时PPI动力学目前糟糕的选择;其他的我thods，如FRET和最近开发的二聚化相关的荧光蛋白17，可能更适合用于此目的。
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Protocol
1.克隆
- 确定配置克隆，并选择一个连接。标记蛋白与上N-或C-末端的片段，如下所述，使他们不破坏其正确定位。使用一个柔性接头，例如（GGGGS）×2。
- 感兴趣的蛋白质的基因标记至PAmCherry1片段。作为一个选项，使用含有片段RN（PAmCherry1残留1-159）和RC（MET加PAmCherry1残留160-236）与MCS侧翼序列的材料清单中列出的克隆质粒。
- 含线性化的片段RN和RC与反向PCR（或限制性酶切）在插入点的质粒。引物为反向PCR 列于表1，下面是在作者的实验室中使用的示例PCR方案（参见材料清单中这个协议所用的确切材料）。
- 混合PCR反应一起，升至50微升最终体积的水：一个薄壁编PCR管中，添加水，25微升2×主混合物，每0.5微升正向和反向引物（20μM的稀释的库存，0.2μM终浓度），以及1ng的模板。使用以下循环条件：98℃，30秒，98℃30个循环为7秒和68℃2分钟，并在72℃最后延伸10分钟。
- PCR在插入到含有RN和RC片段线性质粒目的基因。执行的PCR如步骤1.2.1在68℃下的延伸时间。使用的引物与包含柔性接头序列突出端，如GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT为（GGGGS）×2，和15个碱基对的同源性的线性RN和用于重组的端部的RC质粒。
注意：底漆突出端针对感兴趣的蛋白质，如果使用表1引物来线性化质粒骨架示于表2。 - 消化PCR与Dpn1反应，消除PCR模板。加入0.5微升的Dpn1（20U /微升）直接向50μl的PCR反应。在37℃下1小时，并热灭活在80℃下进行20分钟。如果背景模板仍然存在在后面的步骤，增加酶量或者延长消化时间。
- 如制造商所述通过旋转柱纯化所述PCR产物。
- 执行连接无关的反应，以含有RN或RC片段与感兴趣的基因的线性化质粒结合。测量的纯化的PCR产物的浓度：结合为50ng线性化质粒和50ng与1微升的酶预混物的目的基因的和使总体积至5微升去离子水。孵育在50℃下进行15分钟，置于冰上，并加入20微升TE缓冲液中。
- 转化重组质粒到感受细菌18。
- 选择2-4 +（如需要）O / N培养菌落。添加5毫升的LB肉汤和5μl卡那霉素（50毫克/毫升的库存）的成一个14毫升聚丙烯圆底管中，并用无菌接种环添加选定细菌菌落。在37°CO / N在225转速下晃动。
- 冻结1 ml的O / N培养物用于甘油保存19和如制造商所述小量的剩余部分。
- 执行顺序确定好克隆。如果使用中的材料清单的克隆质粒，用M13正向和反向引物（在单独的反应）作为必要获得融合构建的完整序列。 -使用对齐工具，如来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）的BLAST预期序列进行比较http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi。
- 通过重组酶反应转移序列验证构建体来表达质粒。
- 加入75毫微克的目标质粒排名第8212;如的pCDNA用于瞬时转染或pLenti为慢病毒包装20 -和50ng重组克隆质粒以1微升的酶预混物，并调出总体积为5微升去离子水。孵育在25℃下1小时，然后加入5μl的TE缓冲液中。
注意：对于慢病毒包装和稳定细胞系的产生，使用不同的目标质粒为每个构建体，例如，一种嘌呤电阻和其它新霉素。这允许双重选择转导细胞。还考虑启动子的每个，如组成型巨细胞病毒（CMV）启动子的高表达水平，或巨细胞病毒与TETO操作者可调谐强力霉素调节的表达。 - 变换5微升到感受细菌和小量制备质粒如步骤1.2.6至1.2.8，但是使用适当的抗生素（通常氨苄青霉素）。
- 加入75毫微克的目标质粒排名第8212;如的pCDNA用于瞬时转染或pLenti为慢病毒包装20 -和50ng重组克隆质粒以1微升的酶预混物，并调出总体积为5微升去离子水。孵育在25℃下1小时，然后加入5μl的TE缓冲液中。
- 含线性化的片段RN和RC与反向PCR（或限制性酶切）在插入点的质粒。引物为反向PCR 列于表1，下面是在作者的实验室中使用的示例PCR方案（参见材料清单中这个协议所用的确切材料）。
- 确定最佳附设的配置。
- 共转染表达质粒导入U2OS细胞（或所选择的细胞）。
- 添加350微升无酚红和抗生素的DMEM补充有10％FBS的成8阱＃1.5玻璃底室载玻片的每个孔中。每孔平板约7.5×10 4个细胞，使细胞约有70％-90％汇合的第二天。
- 后镀，共转染表达质粒，在每个不同的配置使用优选试剂以及与作为由生产所描述的天。
- 对于每个孔，加入125纳克各个表达质粒的入50微升无血清减少媒体在一个0.6毫升管和移液管上下混合。加入1微升转染试剂的向下管的中心，并直接到媒体。轻轻搅动混合，让反应坐了30分钟。
- 减少约一半的介质在腔室载玻片的每个孔中。添加转染混合物滴加到孔中并摇克ently混合。孵育细胞，在37℃和5％CO 2的24-48小时。转染后的第二天更换介质。
- 在荧光显微镜在协议2图像细胞的步骤2.1.4开始。
注：样品可以被成像在标准荧光显微镜，如果表达水平高，并且相机是用于PAmCherry1的相对低的光子输出足够敏感。冲调PAmCherry1分子可与紫外线过滤器组（405 nm）到成像与绿色激发（561 nm）的过滤器设置之前被激活。
- 共转染表达质粒导入U2OS细胞（或所选择的细胞）。
- 在适用的情况中，创建一个阴性对照，例如，引入点突变到感兴趣的蛋白质，扰乱的相互作用中的一个。执行一个定点诱变21上的蛋白质的克隆质粒待突变和所选择的配置。
- 由包装构建成病毒产生的稳定细胞系粒子，并感染U2OS细胞（或所选择的细胞系）。考虑这样的表达，可以先诱导成像，如果附设的长期不可逆转是一个问题，或者如果可调的表达需要一种可诱导（四环素）表达系统15。
注意：与病毒的工作被分类为生物安全水平2.虽然最近代病毒包装系统，大大降低生产复制能力的病毒的可能性，一些风险仍然存在。参考文献可以发现http://www.cdc.gov/biosafety/publications/。- 使用lenti-或逆转录病毒的目的载体20重复步骤1.2.10。增加O / N培养至100毫升的中提和质粒更高的纯度。
- 第1天：平板约2×10 6 293T / 17细胞分化成10cm皿的每个构建体被包装。
- 第2天：使用TRA准备转染反应选择，并作为由制造商所述nsfection试剂。
- 制备包装的质粒与最终浓度为250毫微克/微升的包装质粒1和2的预混合物，和100ng /μL用于包装质粒3在无菌水中。加10微升包装质粒预混物和2.5到1ml无血清减少媒体微克的目标质粒的在5ml的聚丙烯圆底管和移液管上下混合。添加20微升转染试剂的向下管的中心，并直接到媒体。
- 轻轻搅动以混合并在室温下孵育30分钟。从细胞中除去大约一半的媒体和以滴加方式添加转染混合物。轻轻摇晃混合和在37℃和5％的CO 2。孵育加入10ml每板介质与松弛温度和CO 2平衡的帽的管。
- 在第3天：轻轻改变介质与预孵育的媒体和return为细胞培养箱。孵育媒体又管松动的上限。
注：合胞体，或大的多核细胞的形成，可能是一个迹象，表明包装进展顺利。但是，细胞是在脆弱状态，可以容易地分离。当改变媒体，倾斜移液器，以便它是水平的，并添加媒体滴加入板的一个边缘。 - 第4天：通过用注射器取出介质，并通过0.45μm孔径过滤器过滤到干净的50ml管中收获病毒。轻轻与预孵育的媒体更换介质。
- 第5天：再次收获如先前步骤1.5.3.3进行，并结合共同滤液进入同样的50毫升管。添加6 ml的病毒浓缩每管并混合。储存在4℃下进行至少24小时，直至病毒沉淀。
注意：根据所述细胞的健康，病毒可以收获的第三时间。 - 离心在1500×g离心浓缩病毒15分钟，在4℃。吸出上清液和悬浮颗粒在250微升媒体。病毒可立即用于感染或在-80℃下长达一年存储于50μl等分试样。
- 板约3×10 5的U2OS（或目标）细胞每孔到6孔平板（2 ml的DMEM中以每孔10％FBS）进行感染，所以细胞约有50％汇合在感染的时间。
- 次日，除去约一半的介质，以便约1ml的遗体。 Coinfect用50μl浓缩病毒的每种构建体。加入1μl聚凝胺（8毫克/毫升）至各孔中。在37℃和5％的CO 2。更改媒体第二天，孵育多一天抗生素的选择了。
注意：病毒的添加可根据感染的所需速率而变化。病毒可以通过实时定量RT-PCR滴定。 - 添加抗生素以选择感染细胞。不同的孔与未感染的细胞还没有看到VIRU被要求作为金丝雀来测试选择的效力。孵育2-7天，或直至选择完成。
注：有效浓度最初应滴定，但它们通常1.0微克/毫升嘌呤霉素为1.0毫克/毫升为新霉素。 - 展开细胞转变成一个更大的10cm皿并继续执行协议2。
- 制备包装的质粒与最终浓度为250毫微克/微升的包装质粒1和2的预混合物，和100ng /μL用于包装质粒3在无菌水中。加10微升包装质粒预混物和2.5到1ml无血清减少媒体微克的目标质粒的在5ml的聚丙烯圆底管和移液管上下混合。添加20微升转染试剂的向下管的中心，并直接到媒体。
2.影像定格
- 准备用于成像的样品
- 加入250微升1 M氢氧化钠至少1小时的清洁以及8＃1.5玻璃底玻片，用PBS彻底清洗。
注：未处理的腔室玻片通常会导致高背景信号。此外，细胞可能残留NaOH和未能彻底清洁玻璃表面（多达10倍的清洗）可能使细胞粘附难以敏感。如果有必要，孵化用PBS O / N洗涤后的清洗室幻灯片。对于敏感的细胞系，在更高的密度电镀（例如，在50％-60％的初始汇合）可能有帮助。 - 板约每孔350微升的无酚红的DMEM的U2OS稳定表达的细胞有10％FBS的5.5×10 4个，使得细胞是健康的，成像时不超过汇合。
- 进行该实验必要的处理，例如添加四环素诱导蛋白质表达。
- 立即成像前固定细胞。
- 此前固定，准备新鲜的多聚甲醛（PFA）解决方案 - 3.7％PFA在1X PHEM 0.1％戊二醛（GA）。对于10毫升PFA的解决方案，称0.37克PFA和转移到1.5 ml离心管。加入1毫升蒸馏水和30微升的1M NaOH和旋涡。热火在70°C和涡每1-2分钟，直到PFA完全溶解。
- 转印溶解PFA到15ml锥形管中，加入3.8 ml的蒸馏水，加入5ml 2×PHEM缓冲液，20微升25％的戊二醛，并且涡旋混合。股票，2个PHEM缓冲区120毫摩尔PIPES，50mM的HEPES，20mM的EGTA和16毫硫酸镁 ，使用pH调节至7.0用10M KOH。此固定液可以储存在4℃下数天。
注意：PFA和GA都是危险的。准备在通风橱中的解决方案，并同时处理化学物品时，佩戴合适的防护设备。避免吸入或皮肤直接接触。 - 除去生长培养基。用500微升PBS快速洗涤，并添加PFA固定剂250微升每孔。孵育细胞20分钟，室温。
- 从样品中取出的煤灰固定液，并添加350微升PBS或影像缓冲液（100毫米的Tris 30 mM氯化钠和20毫米氯化镁2，pH值8.5），每口井的。
- 涡街100纳米金颗粒分手总量和成像过程中跟踪阶段漂移添加每孔35微升（10×最终稀释）。
- 加入250微升1 M氢氧化钠至少1小时的清洁以及8＃1.5玻璃底玻片，用PBS彻底清洗。
- 获取图像
- 打开显微镜。动力上，405和561 nm激光，但保持百叶窗（内部或外部）收在这一点上。打开EMCCD相机并让它冷却下来。确保561纳米过滤器是到位。
- 打开采集软件和设置曝光时间为100毫秒，EMCCD增益为300（范围1 - 1000）。
- 加入浸油的客观并固定到样品的显微镜载物台上。
- 无论使用哪种亮场或在561 nm激光（〜1千瓦/厘米2），使样品成为关注的焦点。
- 成像Ras和其他膜蛋白，使用60X复消色差TIRF目标与1.49的数值孔径，并把显微镜到TIRF配置。调整激发激光，以便它是偏心击球TIRF物镜的后孔时;这将导致激光器在到达样品偏转。保持调整激光直到临界角到达并且激光被反射回来。搜索的小区到图像与几个金颗粒中图。设置的感兴趣区域包围的细胞（或细胞内的区域）和金颗粒。
注意：TIRF减小穿透深度激发激光的和降低了失焦背景信号。此外，漂移校正很可能是更准确的，当更多的黄金颗粒是图。 - 如果有的话，接合自动对焦系统，以校正在z方向取样漂移。否则，整个采集手动调节对焦如果图像不清晰的。
- 开始采集与405nm的激光和关闭（〜1千瓦/ cm 2）的情况下，在充分的活化已经发生了561 nm激光（典型地，如果表达水平高）。否则，在必要时，直到有几十每帧分子或使单分子的转动405nm的激光对以最低工厂功率设置（0.02毫瓦或0.01 瓦 /平方厘米）和逐渐增加（0.1毫瓦的时间）完全分开。
- 由于数据采集的继续，毕业ually增加405纳米的激光功率，以保持点密度基本保持不变。
注意：在较低的405nm激发功率，一些PAmCherry1已经可以被激活。作为这些分子光漂白，其余光活化PAmCherry1分子群体减少，要求较高的光子通量维持分子在每一帧发射荧光的密度相同。 - 继续图像采集，直到高405nm的功率（2.5 - 10瓦/厘米2）不激活多个激活事件。
注意：总采集时间取决于互补的表达水平和效率。
- 处理图像
注意：有用于图像处理的许多开源软件选项。例子有雷暴（https://code.google.com/p/thunder-storm/）和QuickPALM（https://code.google.com/P / quickpalm /）。典型的数据处理程序这里将简要使用定制Matlab的包称为wfiread用于处理PALM数据为例说明。然而，未来的版本可能不完全遵循这里描述。对于与其他软件的图像处理，请参阅用户单证。- 下载图像处理软件（补充编码文件）或最新版本http://www.ohsu.edu/nan。打开Matlab和加载wfiread软件（这是已经摆在了默认路径）。
- 查看原始图像序列，并确定感兴趣的区域。选择堆栈的面积通过左击和拖动一个框所需的区域进行处理。如果采集（约256×256像素）期间没有减少感兴趣的区域中，选择一个较小的区域，以减少计算时间。要取消选择一个区域并处理整个帧，右击任意位置第Ë形象。
- 输入帧的范围进行处理。
- 选择金颗粒（一说是孤立的，均匀的形状）左键单击图像上并拖动一个小盒子周围。在粒子跟踪，请点击跟踪按钮。的曲线图将出现，显示整个图像的堆叠选定金颗粒的位置，描绘漂移的程度。
- 重复此过程，跟踪尽可能多的金颗粒可能和确定那些一起跟踪（颗粒将进行颜色编码）。理想的是，总的漂移是一个象素的顺序上至多。
- 单独选择金颗粒一起跟踪一次，然后点击下粒子跟踪添加标记按钮。甲绿十字会出现表示它已被添加作为标记物，将被用于校正漂移。
- 通过稍微改变的值调整西格玛范围，平滑范围和阈值是必要的。点击查找粒子按钮来测试设置。将被处理的颗粒将被盒装和那些不将被排除在外。该PAmCherry1分子，颗粒比较圆而明亮，应选择。
- 首先，点击制作坐标文件按钮处理图像并保存文件。
注：该计划将通过所定义的框架范围内的每一帧，发现所有的荧光斑点，并执行高斯拟合找到质心坐标。一个.cor文件将产生存储处理的单分子图像的所有坐标等拟合参数。
- 后处理图像并呈现手掌图像
注：其他软件可能会直接呈现的图像坐标提取后。- 在Matlab中，推出的“掌”包并加载刚刚创建的.cor文件。
- 在使用的坐标绘制的手掌图像，从“localizati的各个坐标（每个排序事件'）。根据设置和荧光团的最佳排序值可以变化。
- 对于PAmCherry1，请使用以下值：合并框架 - 8;结合距离（海里） - 100;最小RMS - 4;最小拟合优度 - 0.25;和马克斯。偏心 - 1.4。请参阅这些参数的附加说明的讨论部分。
- 点击排序按钮生成一组新的坐标准备用于再现高清晰度的图像。
- 输入为最终图像的适当的再现值，如原始像素尺寸（nm），期望的特征尺寸（nm）在渲染图像，并且像素尺寸为渲染图像。
注：原始像素大小必须为每个设置确定。呈现的特征尺寸可任意设定，但通常设定为比所述平均定位精度略高。为PAmCherry1，平均定位精度是大约18毫微米，所以为20的特征尺寸 - 30纳米是appropria德。值得注意的是，定位精度，计算通过取同一分子的本地化的标准偏差跨越多个帧22而不是通过将衍射极限与光子检测数的平方根。作为用于渲染图像的像素大小，10纳米是一个很好的起点;设得太低此值会导致对无放大的看法过于庞大的图像文件。 - 点击渲染按钮，生成手掌图像。使用图中的窗口的工具栏上的+/-放大镜图标进行放大和缩小。
- 可选：要么使用里普利为其k测试或其他机制，如模拟辅助DBSCAN（SAD）23重建PALM图像进行聚类分析。注：在自定义的手掌包裹，既里普利的K和SAD分析已经建成;用于从其它软件生成的坐标，同样的分析可与附加的自定义脚本执行。
3.单分子跟踪活细胞 - 治疗的组织培养表面和如在协议2中所述。由于温度和/或CO 2的控制阶段，可能需要一定的培养皿，确保确保该玻璃罩具有适当的厚度（0.17毫米）的显微镜设置板上的细胞。
- 转染细胞如果做了瞬时表达，并执行所需的实验，如四环素诱导表达任何处理，并根据需要进行孵育。这也与在方案2所述。
- 放置在培养皿上一阶段的孵化器。让培养皿定居在舞台上几分钟，直到温度和CO 2浓度安装培养皿或移动到新的感兴趣的区域之后稳定每一次。块激光器在此步骤。如果二氧化碳控制不可，更改为CO 2独立的媒体成像前右，如Leibov伊曲康唑的L-15。
注意：酚红的培养基被推荐用于按压背景荧光。
- 获取图像，在协议二，然而，设置适当的曝光时间（一般为25-50毫秒PAmCherry1）。
注意：分子密度必须比为固定细胞更低，以使轨迹可以在不相互重叠的被记录。指定的几十分子是典型的一个256x256像素采集在约160纳米的像素大小。在561 nm激光功率密度设定为0.8千瓦/厘米2，以保持，同时降低光毒性细胞和增加平均轨迹长度的良好信噪比。 - 处理图像。
- 在协议2，或与其他包装说明中提取单个分子与wfiread包的坐标。
- 根据发现的不同算法重建使用不同的单粒子跟踪（SPT）封装的单粒子轨迹其他地区24。注：另外，这一步可以利用家建matlab程序包（在以后的版本可能可以在完成http://www.ohsu.edu/nan。
- 可选：改造后，使用SPT包24来计算的轨迹位移和扩散常数。此外，可使用变分贝叶斯单粒子跟踪（vbSPT）25，以确定目标蛋白的扩散状态。 ：vbSPT matlab程序包和文档可以在其官方Sourceforge的网站上找到http://vbspt.sourceforge.net/。
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Representative Results
所示的附设-PALM例子是KRAS G12D突变体与RAS相互作用结合CRAF的结构域（RBD）（图1A）。如所讨论的，在RN或RC片段并未标记到的Ras的C-末端，因为它会破坏膜定位的Ras，因此生物活性。这减少了可能的组合，从8至4（图1B）。这四个组合被引入到使用慢病毒感染U2OS细胞。将细胞固定在协议中详述的，并使用PALM设置附设信号进行了评价。细胞与阳性附设信号通过在荧光的突然增加来识别时的405nm的激光被接通;在561 nm激光是在整个成像实验。在荧光这种突然变化是由于附设-重构PAmCherry1的基于照明的光活化的405nm的激光。使用这种方法在样品中多个区域进行了评价和附设信号强度进行了计算前平均增加像素强度和高功率脉冲从405nm的激光后。
正如图1C，出了四种可能的结构中，两种配置（即RN-的Ras / RC-Raf的RBD和RN-的Ras / Raf的RBD-RC）具有较强的附设信号。另一种配置（RC-RAS / RAF RBD-RN）的微弱信号，和一个没有信号。对于所有后续的实验中，在RN-的Ras / Raf的RBD-RC配置（右上图 1C）中的使用。作为阴性对照，点突变（R89L）中的Raf的的Ras结合结构域引入并使用相同的配置的附设效率进行了测试。这种突变被称为破坏的Raf结合的Ras;一致，突变大大降低了附设信号（图1D）。
因为通过附设产生PAmCherry1分子显示出类似的光活化性为原始PAmCherry1 10，这允许附设的样品使用相同的实验设置与母PAmCherry1 PALM成像。细胞与感染RN-Ras和Raf的RBD-RC后强附设信号的一例的PALM图像示于图2A中。
放大时（图2A底左和插图，与盒装放大的区域），从个人分子及其纳米级的空间分布可以清楚地看到。值得注意的是，在这些PALM图像中的每个点代表一个推定的Ras-Raf的RBD络合物具有标记一个PAmCherry1分子。为了比较，右侧图2B的 ，模拟的视图相同的字段，其中该集群成为遮去的低分辨率图像。中的Ras-RAF RBD集群的观察结果与以前的意见，位于Ras和Raf的集群行为是一致的。
随着活细胞表达附设重组PAmCherry1，SMT-PALM是PERFORmed指获得个体的Ras-Raf的RBD络合物扩散轨迹，类似于先前描述的10。根据与561 nm和405 nm激光连续照明，个人PAmCherry1分子随机切换，并进入黑暗的状态（这部分是由于漂白）前的最后几帧。在这一段时间内，所述分子显示出至少两个不同的扩散行为：一个动状态（图2B，分子1）和移动状态（图2B，分子2）。这两种类型的轨迹是清晰地呈现在（X，Y）在图2C中，其中多个分子的轨迹被记录示出曲线图。扩散状态的相同不均匀分布可以从连续帧之间的分子位移的直方图来推断。通常情况下，10,000 - 100000扩散轨迹可以从每个细胞被收购;这众多允许的T更严格的统计分析他扩散状态，例如与vbSPT算法25。
图1.附设-PALM实验设计的Ras-Raf的相互作用。（A）中的Ras是一种膜结合蛋白，其募集Raf的活性时。当非荧光分割PAmCherry1片段附着到Ras和Raf的，相互作用带来的片段一起和互补发生时，产生了功能性的荧光蛋白。 （ 乙 ）由于加标签的Ras在其C-末端会破坏它的膜定位，配置测试的Ras-Raf的附设-PALM数量从8减少到四个。 U2OS细胞表达了全内反射荧光显微镜拍摄的测试配置（C）图像。为了衡量每个配置的附设效率，细胞被赋予了405纳米的光，而同样的高剂量被激发与561纳米的光。 （d）将 R89L突变为英国皇家空军RBD大大降低了RN-KRAS G12D / CRAF RBD-RC配置的附设信号（右上C，N = 5-8）。误差棒是在SEM（D）。在（C）的比例尺为10μm。 RN = PAmCherry1 N末端 片段，RC = PAmCherry1 C端片段，和RBD =的Ras结合结构域。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.附设掌U2OS细胞表达RN-KRAS G12D / CRAF RBD-RC配置。（A）一个完整的手掌图像如上图所示。较低的面板被放大视图上的图像盒装区域所示。插图更高在各自的放大视图盒装地区的放大倍率。右侧的下面板（标TIRF）都在其左图像的表示，好像采取与衍射限制显微镜。 （B）中从一个活细胞SMT-PALM实验描绘缓慢（1）和快速（2）运动的Ras-Raf的复合物的连续帧。 （C）的输出从一个SMT-PALM实验示出的小区的小范围内的的Ras-Raf的络合物扩散轨迹。 （ 四）每RAS-Raf的复合框架位移从SMT-PALM实验的直方图。在（A）中比例尺为5μm顶部，500纳米底部，50纳米的插图， 和 （C），1微米。 RN = PAmCherry1 N末端 片段，RC = PAmCherry1 C端片段，和RBD =的Ras结合结构域。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 引物序列（5'至3'） | |
| 克隆的质粒，用于插入在N末端的反向 | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN N端前进 | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC N端前进 | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| 克隆的质粒，用于插入在C末端向前 | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN从C端反向 | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC从C端反向 | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
表1 引物用于线性化含有PAmCherry1片段克隆质粒。含有RN和RC的克隆质粒可线性化，反向PCR在插入在N-或片段的C-末端的点。序列列5'到3R17 ;.
| 突出端对于感兴趣基因的引物（5'至3'） | |
| N端插入RN或RC向前 | GAGCTCGGTACCATG |
| N-末端插入RN反向 | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N端插入RC反 | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C端插入RN前锋 | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C端插入RC向前 | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C端插入RN或RC反 | GCGCCCACCCTTTTA |
表符合表1的引物2出挑感兴趣引物基因，产生的15个碱基对的同源性为结扎独立反应从底漆出挑。此外，突出端包含序列为（GGGGS）×2柔性接头。柔性接头序列可在表1中，而不是加入到引物。序列列5'到3'。
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Discussion
附设一直是常用的技术，用于检测和细胞可视化质子泵抑制剂，而PALM是最近单分子超分辨率显微镜技术，使完整的生物样品的纳米级成像。附设与Palm的结合纳米的空间分辨率和单分子敏感性细胞内获得的生产者价格指数的选择性成像。附设掌扩展这两种技术的效用，而这表现在这项工作中，显示了在揭示其天然细胞环境的生产者价格指数的分子细节巨大潜力。尤其是，纳米级分辨率允许特定质子泵抑制剂的空间和时间调节在分子尺度上，这已在生物医学研究是一项挑战的详细的调查。然而，如前面提到的，附设-PALM由互补和慢发色团成熟的不可逆转的限制。
分裂PAmCherry1用于证明的原则和u效用附设掌的。 PAmCherry1已被广泛用于在PALM实验以其优良的光物理特性。使用PAmCherry1作为附设探针的一个额外的好处是低背景和高特异性和效率的蛋白质重构在37℃下耦合到质子泵抑制剂时。由于这些原因，分割PAmCherry1附设探针有望成为适用于涉及质子泵抑制剂高分辨率成像许多不同的生物学研究的宝贵资源。除了PAmCherry1，一个photoconvertible荧光蛋白，mEos3.2，也被拆分附设掌26。由于其发射光谱重叠，mEos3.2和PAmCherry1不能一起使用，但绿霸fps的最近报道27日，开放的可能性，生产者价格指数的双色纳米级的超高分辨率成像。
如在传统的附设在执行附设-PALM的关键步骤是该融合构建体的设计和克隆。事实上八个不同的表达构建具有要克隆和八个附设对具有在每次尝试实施附设和附设-PALM可以是一个繁琐的，如果不禁止，流程进行测试。然而，如图中的Ras-Raf的例子中，在感兴趣的蛋白质经常的生化和结构特性的先验知识可被用于指导融合构建的优化设计，待测试附设对的数目减少。尽管如此，目前还没有一个通用的准则，以确保附设（因此附设-PALM）的实验会工作;其中很大一部分仍然是一门艺术。
而附设和附设-PALM通常用于研究两种蛋白质之间杂二聚体的形成，但也可行的研究是否可使用这些方法，在这种情况下，两个候选蛋白将是相同的同型二聚体的形成。然而，如这样，两种蛋白具有相同的片段可交互，但是不会导致附设信号。尽管每个结构作为的竞争性抑制剂的其他，这种相互作用是可逆的，而导致成功的互补的相互作用会积累由于不可逆性。在一般情况下，有可能是在信号的降低，如果有每个构建体的表达水平之间的急剧差异。因此，这两个构建体的表达水平可能需要比较荧光强度（例如，野生型和突变型的同型二聚体样品之间）的内源表达水平时被确定。这也许是为什么附设实验通常与瞬时转染和结构的表达进行。
最后但并非最不重要的，所有附设实验必须有适当的控制来证实。如果附设信号存在 时，有机会，该信号是非特异性（即片段重构自身和PPI的不是因为）。一个阴性对照是突变之一或已知两种蛋白扰乱相互作用，这将导致一个显著损失附设信号。如果这样的点突变是未知的，其它方法也可以使用，例如引入一个竞争性结合伴侣的蛋白之一，看看是否有在信号的伴随减少。
越是困难的情况排查缺乏附设信号，或假阴性的。在这样的情况下，它是重要的，包括在克隆过程中的阳性对照，如在转染GFP的控制。 Western印迹可以运行以检查构建体的表达。如果这些因素都是正常的，可能需要改变，例如接头长度和/或序列，或不同的附设的配置，应考虑其他因素。
至于对PALM部，许多参数必须在处理图像时被考虑。步骤2.4.2.1描述用于排序的坐标，并生成最终的PALM图像参数。第一两个参数，结合框架和结合距离，正如我们前面所述23定义如果两个本地化的事件都在100纳米，并出现小于8帧（100毫秒/帧）或〜0.8秒的间隔。如果是这样，那么它们将被认为从同一分子出现，其坐标将通过平均进行组合。暗状态与寿命超过0.8秒，PAmCherry1似乎是罕见的大得多;作为荧光团从一个长寿命暗状态恢复的情况下，是从一个不同的分子在近端距离发射荧光的区分两个定位事件被认为是产生于同一分子，只有当他们出现在一定数目的帧和物理距离。根据经验，一个“组合框”设置为8-12帧（0.8-1.2秒）似乎是我们的实验条件下最优的。最小RMS定义嵌合幅度和残留噪声后的标准偏差之间的最小比率嵌合。这些值记录在期间坐标提取.cor文件。
综上所述，附设-PALM结合附设和PALM的优点，使质子泵抑制剂在比以前已经取得了更多的细节调查。与考虑以上，并与适当的对照实验的因素中，附设-PALM应该是在广泛的生物设置研究质子泵抑制剂的有用工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
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