Methodenartikel

Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

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DOI:

10.3791/53163

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15. September 2015

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1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Zellwandstruktur und die chemischen Eigenschaften von Pflanzen werden bewertet, um ideale Rohstoffe für Biokraftstoffe und Biomaterialien zu identifizieren. Standardmethoden haben Einschränkungen, wenn sie auf große Datensätze angewendet werden. Diese Methoden der Hochdurchsatz-Vorbehandlung, der Enzymverzuckerung und der Pyrolyse-Molekularstrahl-Massenspektrometrie vergleichen eine große Anzahl von Biomasseproben mit geringerem Zeit- und Kostenaufwand.

Zusammenfassung

Die Umwandlung von lignozellulosehaltiger Biomasse in Kraftstoffe, Chemikalien und andere Rohstoffe wurde als ein möglicher Weg zur Reduzierung der Nutzung nicht-erneuerbarer Energiequellen untersucht. Um zu identifizieren, welche Pflanzen aus einem vielfältigen Pool die gewünschten chemischen Eigenschaften für nachgelagerte Anwendungen aufweisen, müssen Attribute wie der Cellulose- und Ligningehalt oder die Freisetzung von monomerem Zucker nach einer enzymatischen Verzuckerung verglichen werden. Die experimentellen und Datenanalyseprotokolle der Standardanalysemethoden können zeitaufwändig sein, wodurch die Anzahl der Proben, die gemessen werden können, begrenzt wird. Hochdurchsatzmethoden (HTP) beheben die Mängel der Standardmethoden und ermöglichen ein schnelles Screening verfügbarer Proben, um diejenigen mit den gewünschten Merkmalen zu isolieren. Diese Studie veranschaulicht die HTP-Zuckerfreisetzungs- und Pyrolyse-Molekularstrahl-Massenspektrometrie-Pipelines, die am National Renewable Energy Lab eingesetzt werden. Diese Pipelines haben die effiziente Bewertung von Tausenden von Anlagen ermöglicht und gleichzeitig die Versuchszeit und -kosten durch Einsparungen bei Arbeitsaufwand und Verbrauchsmaterialien reduziert.

Einleitung

Da die weltweite Versorgung mit nicht-erneuerbaren Energieträger und die dazugehörigen Produkte sinkt, haben Wissenschaftler herausgefordert, ähnlichen Kraftstoffen und Chemikalien aus pflanzlichen Quellen 1 zu erstellen. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit ist zu bestimmen, welche Arten von Pflanzen können für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien 2,3 sein. Üblicherweise werden diese Einsatzstoffe für Lignin, Cellulose und Hemicellulose bewertet; sowie ihre Anfälligkeit für deconstruction (recalcitrance), durch thermische, mechanische und / oder chemische Vorbehandlung mit oder ohne anschließender Enzym Verzuckerung. Detailliertere Analysen werden verwendet, um die spezifische Zusammensetzung der Lignin und Hemicellulose-Fraktionen sowie eine optimale Enzymaktivitäten benötigt bestimmen. Transgene Modifikationen von Pflanzen, die nicht eigen Sie besitzen ideale Merkmale für biochemische oder thermochemische Umwandlung, um die gewünschten Rohstoffe haben die Forscher mit einer stark erweiterten Quelle Topf bereitgestelltzielle Ausgangsmaterialien 4. Die Standard-Analyseverfahren zum Quantifizieren der chemischen Eigenschaften einer Pflanze, während sehr nützlich für kleine Probenmengen, nicht geeignet sind für das schnelle Screening von Hunderten oder Tausenden von Proben 5-7. Die hierin beschriebenen HTP Methoden wurden entwickelt, um schnell und effizient auszuwerten zahlreiche Biomasse Varianten für Veränderungen in der Zellwand recalcitrance thermochemische und / oder enzymatischen Abbau.

Es ist wichtig zu verstehen, dass die hier beschriebenen HTP-Screening-Assays wurden nicht entwickelt, um Wandlungs- oder Ertrag zu maximieren. Das Ziel ist der relative Unterschied in der intrinsischen recalcitrance verwandter Biomasseproben zu bestimmen. Als Folge sind viele der Analyseschritte von den "typischen" Umwandlung von Biomasse-Assays, wo das Ziel ist es, maximale Conversion-Rate oder das Ausmaß zu erhalten, abweichen. Beispielsweise werden geringer Vorbehandlung severities und kürzere Enzymhydrolyse verwendet zu maximieren abweichenschiede zwischen den Proben. In den meisten Fällen relativ hohe Enzymbeladungen verwendet werden, um Unterschiede, die durch experimentelle Variation der Enzymaktivität, die die Ergebnisse erheblich verfälschen könnte reduzieren.

Schnelle Techniken zur Bestimmung der Zusammensetzung von Pflanzenzellwänden und den monomeren Zuckern freigesetzte folgenden enzymatischen Verzuckerung gehören Robotik, besonders angefertigt, thermochemisch kompatible 96-Well-Platten, und Modifikationen der Standard-Labormethoden 8-11 und Instrumental-Protokolle, wie Schwingungsspektroskopie (IR- (IR), im nahen Infrarotbereich (NIR) oder Raman) und magnetische Kernresonanz (NMR) 12-17. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Isolierung von Ausgangsmaterialien mit hoher Cellulose oder niedrigen Ligningehalt, oder diejenigen erwartet, die höchsten Glucose, Xylose, Ethanol Ausbeute usw. Diese Methoden wurden heruntergerechnet Analysen, die kleinere Mengen an Biomasse und Verbrauchsmaterialien verwenden aktiviert, was zu einer Senkung der Versuchs Kosten 18 . Ein weiteres Merkmal dieser methodische Ansatz ist, dass verschiedene Versuchsbedingungen schnell zu sein, und in einigen Fällen gleichzeitig ausgewertet. Beispielsweise kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorbehandlungsstrategien oder Enzymcocktails getestet werden, so dass die optimalen experimentellen Parameter schnell identifiziert und verwendet werden. Beliebte Einsatzmaterialien, wie beispielsweise Maisstroh 9, Pappel 8,10, Bagasse 8 und Switch 8 wurden erfolgreich unter Verwendung dieser HTP Verfahren bewertet.

Gesamt Lignin und Lignin Monomerzusammensetzung werden auch üblicherweise quantifiziert Biomasse Züge. Verringerungen der Ligningehalt haben gezeigt, dass die enzymatische Verdaubarkeit von Polysacchariden 19,20 erhöhen. Die Rolle, die das Lignin monomeren Verhältnis (oft als Syringyl / Guaiacyl (S / G) gemeldet) spielt in der Dekonstruktion der Pflanzenzellwand wird noch untersucht. Einige Berichte haben gezeigt, dass eine Verringerung des S / GQuote führte zu einer erhöhten Glucoseausbeuten nach der Hydrolyse 21, während andere Studien enthüllen den gegenläufigen Trend 19,22. Hochdurchsatz-Methoden zur Bewertung Lignin und seine Monomere sind Schwingungsspektroskopie (IR, NIR und Raman-23-26), die mit der multivariaten Analyse und Pyrolyse Molekularstrahl-Massenspektrometrie (pyMBMS) 27,28.

Bei der Entwicklung von HTP Verfahren zum Screenen von Biomasse müssen mehrere integrale Überlegungen im Auge gehalten werden. Ein wichtiger Aspekt ist die Komplexität des Verfahrens. Was ist die erforderliche Qualifikationsniveau für die Technik? Chemometrische Analysen zum Beispiel erfordern bestimmte Fähigkeiten für den Aufbau, Bewertung und Aufrechterhaltung der Vorhersagemodelle. Die Standardmethoden weisen unerwünschte Vor- oder Datenanalyseschritte oder beschäftigen toxischen Reagenzien. Entwicklung der Modelle ist ein laufender Prozess, wo neue Daten über die Zeit, um die Robustheit des Modells zu erhöhen in das Modell ein. Ein weiterer ConsIDmenarbeit ist die Kosteneinsparungen und verringerte experimentellen Analysezeiten der vorgeschlagenen Hochdurchsatzverfahren. Wenn die Methode ist sehr schnell, aber sehr teuer ist, kann es keine praktikable Methode für viele Labors, um anzunehmen. Die in dieser Handschrift dargestellten Verfahren sind Varianten von standardisierten Techniken modifiziert, um die Durchsatzfähigkeiten zu verstärken. Diese Protokolle quantitativ die Biomasse Merkmale von Interesse zu messen, ohne die Notwendigkeit der Entwicklung von Vorhersagemodellen. Dies ist ein Schlüsselattribut dieser Techniken, da Vorhersagemethoden, während sie eine starke Korrelationen mit den Standardanalysen verwendet, um die Modelle zu entwickeln, sind nicht so genau wie eigentlich Messung der Menge von Interesse für die Proben. Während die Verwendung von im wesentlichen nach unten Versionen von Standard-Labormaßstab Analysemethoden skaliert Verfahren werden Genauigkeit und Präzision für die Geschwindigkeit und Durchsatz gehandelt. Meist ist dieses Ergebnis aufgrund höherer Fehlern in kleinen Volumen Pipettieren und Wiegen; sowie erhöhte sreichliche Heterogenität als Stichprobengröße wird verringert. Während große Sample-Sets können gesiebt und verglichen werden, müssen große Sorgfalt, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen Kampagnen und den Labormaßstab Ergebnisse ausgeübt werden.

Die zeitaufwendigsten Schritte erfordern die physikalische Manipulation der Biomasse. Schleifen Proben kann mehrere Minuten pro Probe, einschließlich Reinigung der Mühle zwischen den Proben zu nehmen. Manuelles Laden, Entladen und Reinigungstrichter und Befüllen und Entleeren Teebeutel und Probenbeutel ist auch sehr arbeitsintensiv. Während jeder Schritt kann eine Minute oder länger dauern kann dabei Tausende von Proben viele Stunden oder sogar Tage dauern. Die Roboter können eine typische Reaktorplatte mit Biomasse in etwa 3 bis 4 Stunden oder 6 bis 8 Platten Tag -1 Roboter laden -1. Diese Situation hängt von der Genauigkeit Parameter sowie der Art und der Menge an Biomasse zu prüfenden verwendet. Füllen Reaktorplatten mit Wasser, verdünnter Säure oder Enzym wird schnell mit einem Liquid-Handling-Roboters durchgeführt. PNachbehandlung von einem Plattenstapel (1 bis 20 Reaktorplatten) dauert zwischen 1 und 3 Stunden, wenn Montage, abkühlen und Demontage enthalten. Enzymhydrolyse dauert 3 Tage und die Zuckeranalyse benötigt etwa 1 Stunde Vorbereitungszeit plus 10 min pro Reaktorplatte, um den Test abzuschließen und lesen Sie die Ergebnisse. Ein Wochenplan gesetzt Vorbehandlung und Analyse Tage nimmt eine vernünftige Arbeitszeiten, ungerade Stunden und am Wochenende Anstrengungen für die menschliche Komponente des Assays zu minimieren und ermöglicht die Verarbeitung ~ 800 bis 1000 Proben pro Woche auf kontinuierlicher Basis. Der maximale Durchsatz von mehreren Faktoren abhängig, vor allem, wie viel Hardware (Roboter, Reaktoren Platten, etc.) und wie viel "Software" (dh Personal) stehen zur Verfügung, um die manuelle Arbeit zu tun. Die praktische obere Grenze ist 2500 bis 3000 Proben / Woche; erfordert jedoch, dass Ausgangs 7 Tage in der Woche Betrieb und mehrere Praktikanten und Techniker. Im Vergleich dazu würden 3.000 Proben mittels HPLC etwa 125 Tagen sam erforderlichB. Analyse plus die zusätzliche Arbeit der Hand mit einem Gewicht von Proben in Reaktoren und Filterproben vor der Analyse.

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Protokoll

1. Hochdurchsatz-Bestimmung von Glucose und Xylose Renditen nach enzymatischer Verzuckerung 9,29

  1. Probenvorbereitung (Schleifen, De-starching, Gewinnung, Vorbehandlung)
    1. Schleifen mindestens 300 mg jeder Biomasse Probe unter Verwendung einer Wiley-Mühle, so daß die Teilchen durch ein 20 mesh passieren (850 um) Bildschirm. Transfer zum antistatischen zip-Top-Taschen (typischerweise Strichcode) und Plattenprobeninformationen zum Barcode-Datenbank.
    2. In etwa 250 mg oder mehr des Grund Biomasse aus antistatischen Beutel mit einem nummerierten (mit Bleistift, verwenden Sie keine Tinte oder Marker) Teebeutel vorsichtig rollen die Teebeutel, dass auf jeden Fall die Enden über die Biomasse zu falten, um zu verhindern, Verlust während de-starching und Extraktion.
    3. Wickeln Sie den Teebeutel geschlossen mit verzinnten Kupferdraht. Nehmen Sie den Teebeutel Nummer für jede Probe mit Strichcode.
    4. Vorbereitung de-Stärkeenzymlösung aus kommerziellen Enzyme (typischerweise 0,25% (v / v) Glucoamylase (~ 1.600 AGU / l) und1,5% (v / v) alpha-Amylase (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0)). Bereiten Sie 16 ml pro g des Groß Biomasse oder 500 ml pro 120 Teebeutel-Proben. Anmerkung: Die Beladungen entfernen kann Stärke aus irdische Biomasse sollte empirisch durch Testen der Stärke nach der Verdauung mit einer Reihe von Enzymbeladungen und Verhältnisse bestimmt werden.
    5. In einem Kunststoffbehälter, fügen Sie 16 ml de-Stärkeenzymlösung pro 1 g des Großirdischen Biomasse. Für eine Charge de-Appretur Protokoll hinzufügen 120 Teebeutel auf 500 ml der Puffer-Enzymlösung.
    6. Inkubieren in einem Schüttler bei 55 ° C für 24 (± 4) Stunden, bei 120 UpM auf mögliche Stärke zu entfernen.
    7. Nach der de-Stärke Inkubation spülen Sie und genießen die Biomasse in mehreren Litern entionisiertem Wasser für 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male, um Puffersalze, die Stöße (Bildung von Gasblasen in der Lösung, die in einer plötzlichen und heftigen Anstieg des Niveaus der Lösung führen kann, was zu heißen flüssigen Ethanol, um Kaskaden verursachen können, zu entfernenaus dem Reaktionsgefäß) während der Extraktion.
    8. Nach der Vollständigkeit Spülen der de-gestärkten Biomasse, legen Sie die Teebeutel in die Soxhlet-Säule für die Extraktion. Kein Kausche ist für diesen Schritt erforderlich.
    9. Einrichten der Soxhlet Reflux, mit 95% Ethanol und extrahieren Sie die Proben für 24 Stunden.
    10. Entfernen Sie die Teebeutel aus der Soxhlet-Reaktor und verteilt in einer einzigen Schicht auf einem flachen Fach.
    11. Man lässt die Proben über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug trocknen.
    12. Rollen Sie die Teebeutel und gibt die getrocknete Biomasse zur Original barcodierte antistatischen Beuteln.
      Hinweis: Die Anti-Statik-Taschen sind effizienter bei der Reduzierung statischer Elektrizität in der Biomasse, die Verbesserung der Fahreigenschaften. Wenn andere Speicheroptionen verwendet werden, können zusätzliche Biomasse aufgrund der Biomassefesthalten an der Seite des Vorratsbehälters erforderlich sein.
    13. Übertragen mindestens 50 mg der getrockneten Biomasse mit einem Barcode versehene Trichter (unter Verwendung von mehr Material ist besser für eine genaue Abgabe). Skann Barcodes von den antistatischen Beuteln und dem Aufnahmetrichter, um genaue Probenverfolgung zu gewährleisten.
    14. Last Trichtern auf Feststoffe mit einem Gewicht von Roboter, aufmerksam auf die Reihenfolge der Proben in den Racks. Laden Sie genug Reaktorplatten, alle Proben enthalten und wählen Sie das Ausgabeprotokoll auf der Basis der Anzahl der Platten verwendet.
    15. Roboter wiegen 5 mg der getrockneten Proben (± 0,3 mg) in säurebeständigen Edelstahl-Platten mit 96 Vertiefungen. Abwiegen 3 Wiederholungen jeder Probe auf der Platte verteilt auf jede lokalisierte Variationen zu minimieren.
    16. Fügen 8 Steuer Biomasse Proben eines gut charakterisierten Biomasse Standard-Material, um die Assayleistung zu verfolgen. Für mehrere Platten, wird die Verwendung von mehreren Standard Biomasse Trichtern Teilchengröße Drift durch Sieben in den Trichtern über wiederholte Abgabezyklen zu minimieren.
      Anmerkung: In jeder Platte, sollte 24 Proben mit 3 Wiederholungen, 4 Rohlinge bestehend aus deionisiertem Wasser und Enzym und 8 contro seinls, mit der zuvor gekennzeichnet Standard Biomasse. Die 3 Ecke Vertiefungen von jeder der 4 Ecken der Platte sind für die Zuckerstandards vorbehalten.
    17. Überprüfen blank und Zucker Standard Brunnen für fehlerhafte Biomassepartikel und falls vorhanden entfernen.
    18. Fügen Sie 250 ul entionisiertem Wasser in jedes Loch, und verschließen Sie die Platten mit Silikon-selbstklebenden Polytetrafluorethylen (PTFE) Band.
    19. Unter Verwendung eines 1/8 "Lötkolbenspitze, durchbohren die PTFE-Band an jedem Dampfanschluss (117 gesamt) für jede Platte. Verwenden Sie eine leere Platte auf versiegelten Reaktorplatte als Führung gestapelt und zu beschränken, PTFE-Filmbewegung.
    20. Klemmen Sie die Platten fest mit 0,031 "dicken glasfaserverstärktem PTFE-Dichtungen (mit Löchern für Dampföffnungen vorgestanzt) zwischen den Platten und leere Teller auf Ober- und Unterseite des Stapels. Vorbehandlung der Proben mit einem Dampfreaktor auf 180 ° C für 17,5 min, oder eine andere Temperatur / Zeit-Kombinationen, basierend auf gewünschten Härte eingestellt.
    21. Kühlen Reaktorplatten bis 50 °; C durch Hochwasser mit VE-Wasser.
  2. Enzymatischen Verzuckerung
    1. Vorbereitung einer enzymatischen Verzuckerung Lösung, bestehend aus 8% (v / v) Enzym-Lösung in 1,0 M Natriumcitrat, pH 5.0. Bereiten Sie 5 ml pro Reaktorplatte. Hinweis: Die Verdünnung erforderlich sollte basierend auf Aktivität und Proteingehalt der spezifischen Aktienenzymlösung bestimmt werden.
    2. Wenn die Platten sind cool, zentrifugieren sie in einem Schwingbecher-Rotor bei 1.500 × g für 20 min. Entfernen Siegelfolie. Hinweis: Diese Platten sind schwer und die Zentrifuge Spezifikationen sollten auf Verträglichkeit überprüft werden.
    3. In 40 ul der 8% Enzymstammlösung in jede Vertiefung (70 mg Enzym pro g Biomasse).
    4. Verschließen Sie mit neuen PTFE-Band. Zeigen versiegelt Platte in Magnetplattenklemme.
    5. Vorsichtig mischen die Proben durch Inversion (mindestens 15-fach), und Inkubieren bei 50 ° C für 70 Std.
    6. Wenn die Verzuckerung zu dem Schluss gekommen, mischen durch Umdrehen und zentrifugieren Sie die Platten bei 1.500 xg für 20 min.
  3. Zucker Assay
    1. Einen Satz von 6 Glucose und Xylose kombinierten Kalibrierungsstandards in 0,014 M Citrat-Puffer (pH 5,0) von 0 bis 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 und 0,75 mg / ml empfohlen) und 0 bis 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 und 0,6 mg / ml empfohlen) für Glucose und Xylose sind.
    2. Bereiten Sie die Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) und Xylose-Dehydrogenase (XDH) Reagenzien gemäß den Anweisungen im Kit.
    3. Mit einer Pipette zu entfernen 200 ul Flüssigkeit aus den 4 Ecken Brunnen und Rand Brunnen neben der Ecke Kavitäten (12 insgesamt Wells) der Reaktorplatte.
    4. Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul entionisiertem Wasser in jede Vertiefung einer 96-Well Polystyrol Flachboden-Verdünnungsplatte. Kein Wasser auf die 12 Zucker Standard und Ecke Brunnen nicht hinzufügen (entfernen Sie diese Tipps, wenn unter Verwendung eines 96-Kanal-Kopf).
    5. Verwendung eines Pipette jeweils 180 ul GOPOD in jede Vertiefung der Glucose-Assay plaß.
    6. Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul XDH Reagenz in jede Vertiefung der Xylose Assayplatte.
    7. Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots Hydrolysat aus dem 96-Loch-Reaktorplatte auf der Verdünnungsplatte. Pipette aus dem oberen Teil der Vertiefungen zur Biomasse-Feststoffe und Restflüssigkeit in der Ecke Vertiefungen zu vermeiden. Mischen durch Verreiben für mindestens 10 Zyklen.
    8. Mit Hilfe einer Pipette 110 ul von Zucker-Standards, in zweifacher Ausfertigung an die Ecke Vertiefungen der Verdünnungsplatte.
    9. Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots von der Verdünnungsplatte auf die Glucose und Xylose Assayplatten. Mischen Sie durch Verreiben.
    10. Inkubieren Glucose und Xylose Assay-Platten bei Raumtemperatur für 30 min. Keine Oberflächenblasen vorsichtig brechen vor dem Lesen. Ein kurz über die Oberfläche der Platte vergangen Heißluftpistole funktioniert gut.
    11. Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 510 nm und zeichnen Sie die Absorption gegen einen Reagenzienleer.Diese Messung überwacht die Bildung von Chinonimin, die proportional zur Glucosekonzentration ist. Die Glucosekonzentration wird aus der Eichkurve basierend auf den Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet.
    12. Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 340 nm und zeichnen Sie die Absorption. Diese Messung überwacht die Reduktion von NAD + zu NADH, die proportional zur Xylose-Konzentration. Die Xylose-Konzentration von der Kalibrierungskurve auf Grundlage der Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet.

2. Hochdurchsatz-Bestimmung von Gesamt Lignin und Lignin Monomere Inhalt Mit pyMBMS 28

  1. Probenvorbereitung
    1. Schleifen und extrahieren Sie die Biomasse unter Verwendung der in den Schritten 1.1.1 und 1.1.6-1.1.8 beschriebenen Methoden. Dazu gehören Mahlen und Extrahieren eines Satzes von Standards als experimentelle Kontrollen zu verwenden.
      Hinweis: Die pyMBMS measurements nicht Teilchengröße abhängig, so dass, wenn nur mit dem pyMBMS Protokoll sollte Biomasse Herstellung durchgeführt, um damit die Probe in den Probenhalter 4 mm passen,
    2. Mit einem kleinen Spatel Abgabe etwa 4 mg (3 bis 5 mg bevorzugt) der aufbereiteten Biomasse in eine 80 & mgr; Edelstahl-Tasse für den Autosampler entwickelt.
    3. Stellen Sie sicher, dass mindestens 10% der Proben, die analysiert werden Kontrollstandards, wie sie aus dem Nationalen Institut für Standards und Technologie zur Verfügung (Bagasse-8491; Pappel-8492; Pinien 8493 oder Weizenstroh-8494). Der Standard kann auch jede Spezies analog zu den zu analysierenden Proben, die bereits mit Standardmethoden charakterisiert haben.
    4. Die Proben in den Autosampler Becher mit einer Pinzette, um Verzerrungen zu vermeiden zufällig laden wegen möglicher Spektrometer Drift über die Zeit. Hinweis: Ein typisches Randomisierung der Proben würde die Messung aller Proben ein, gefolgt von einer Re-Randomisierung umfassender Reihenfolge der Proben, eine Zweitmessung. Randomisierung Programme sind online verfügbar.
    5. Mit einem Standard-Loch manuell Glasfilterscheiben zu produzieren von A / D-Glasfaser-Platten, ohne Bindemittel. Halten Sie die runde Glasfaserfilter mit einer Pinzette, zentrieren sie über den Probenbecher, und drücken Sie in die Probe mit einem 3,5 mm Innensechskantschlüssel, um das Material in jeder Tasse während des Experiments zu beschränken.
  2. Instrumental-Protokoll
    1. Kalibrieren des Massenspektrometers mit einem bekannten Standard, der Peakintensitäten über den gesamten Bereich von Verbindungen, die für die experimentellen Proben bestehen kann, hat. Für typische Biomasseproben verwenden Perfluortributylamin (PFTBA).
    2. Gesetzt den Heliumträgergasflussrate von 0,9 L / min mit einem Gasdurchflussmesser.
    3. Die Auto- sampler Ofen auf eine Pyrolysetemperatur von 500 ° C und die Grenzflächentemperatur auf 350 ° C unter Verwendung der Autosampler Software. Hinweis: Ein 1/8 "aus Edelstahl erwärmtÜbertragungsleitung in Wärmeband, das die Auto-Sampler zum Massenspektrometer verbindet wickelt wird unter Verwendung einer Wärmeregler bei 250 ° C geregelt.
    4. Beginnen Sie die Datenerfassung auf dem Massenspektrometer und warten Sie mindestens 60 Sekunden, um ausreichend Daten für die Hintergrundspektren Sammlung zu erhalten.
    5. Starten Sie den automatischen Autosampler-Methode mit den Spezifikationen von 2.2.2. Hinweis: Der Autosampler fällt jede Probe einzeln in den Autosampler Ofen. Die gesamte Datenerfassungszeit beträgt etwa 1,5 min; jedoch Pyrolyse eines typischen 4-mg-Probe nach 30 Sekunden abgeschlossen.
    6. Nehmen Gesamtionengehalt (TIC) von jeder Probe mit Massenspektrometer-Software mit 0,5 sec Abtastrate. Nehmen Intensitäten zwischen m / z 30 bis 450.
      Hinweis: Typische Biomasse Verbindungen verwenden weiche Ionisierung bei 17 eV. Das Instrument kann größeren Abständen von m / z 1 bis 1000 aufzunehmen; jedoch wird Abtastrate von Computerrechenleistung begrenzt werden.
    7. Entfernen Hintergrund aus den Spektren mit der maFeature Jahres zu verbessern in der Software. Anmerkung: Eine 60 abzutastenden Teil der Grundlinie zu Beginn der Datenerfassung verwendet, um eine durchschnittliche Hintergrundwert zu berechnen. Diese durchschnittliche Hintergrundspektren aus dem experimentellen Probenspektren automatisch im Massenspektrometer-Software entfernt.
    8. Importieren Sie die einzelnen Spalte Textdatei, die durch den Massenspektrometer-Software, die die spektralen Daten für jede Probe in ein Datenbankprogramm und vereinen alle Proben in einer Datenbank. In geltendem Metadaten in die Tabellenkalkulation. Importieren Sie die formatierte Daten (Tabellenkalkulationsdatei / CSV) in eine Statistik-Software-Paket und bedeuten Normalisierung der Spektren für die Variation in den pyrolysierten Probe Massen zu berücksichtigen.
    9. Verwenden Sie eine Statistik-Software-Paket, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Hilfe der spektralen Daten zur Gruppierung der replizierten Standardproben in den Messungen verwendet analysieren zuführen sowie zu beurteilen, welche Spitzen integral für die Einstufung chemischer sindVerbindungen in den Ladungsplot 28.
      Anmerkung: PCA-Gruppen der Proben auf der Basis der Ähnlichkeit ihrer Spektren, und ermöglicht eine Überprüfung der Normen auf experimentelle Fehler aufgrund von Instrumentendrift während des Laufs zu messen.
    10. Um das Lignin Syringyl (S) / Guaiacyl (G-Verhältnis) zu berechnen, summieren die Bereiche der S Peaks (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 und 210) und dividiert durch die Summe von g Peaks bei 124, 137, 138, 150, 164 und 178.
    11. Um die Gesamt Ligningehalt zu berechnen, summiere die Lignin Peaks mit m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 und 210.
    12. Berechnen eines Korrekturfaktors für die Skalierung des pyMBMS Messung einer Standardmethode zur Schätzung der Gesamt Lignin, wie Klason Lignin. Teilen Sie die Klason Lignin Wert der einzelnen Standard durch die Gesamt Ligningehalt für die Standardprobe mit pyMBMS gemessen.
    13. Wenden Sie diesen Korrekturfaktor für alle Gleich Arten im Datensatz. Wiederholen für jede Art von Biomasse analysiert. NAnmerkung: Der Korrekturfaktor kann wesentlich von der S / G der Biomasse analysiert variieren.

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Ergebnisse

Der kombinierte Effekt der thermochemischen Vorbehandlung und anschließende Enzym Verzuckerung wird als Funktion der Masse der Glucose und Xylose am Ende des Tests gemessen und errechnet. Die Ergebnisse sind in der Einheit Milligramm von Glucose und Xylose pro Gramm Biomasse frei gemeldet. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Daten aus Labormaßstab Assays, die üblicherweise als prozentuale theoretische Ausbeute, bezogen auf die Zusammensetzungs-Analyse des Ausgangsmaterials gemeldet wird, gemeldet. Da es noch nicht pr...

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Diskussion

Die wichtigsten Schritte der Probenvorbereitung für den Erhalt von genauen und reproduzierbaren Daten bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Versuche sind wie folgt:

Zucker Release Assay:

Im Allgemeinen werden die Proben in Lose von wenigen Dutzend bis zu mehreren Tausend zu einem Zeitpunkt hergestellt. Jedem Hauptschritt wird typischerweise für alle Proben vor, um Schwankungen in der Zubereitung zwischen Proben zu minimieren Vorwärtsbewegung durchgefüh...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken der Praktikantin Evelyn Von Neida, die herausragende Einblicke in die Vorbereitung von Biomasseproben für die beiden in diesem Manuskript besprochenen Hochdurchsatz-Pipelines gegeben hat. Die Entwicklung dieser Arbeit und des Manuskripts wurde vom BioEnergy Science Center unterstützt. Das BioEnergy Science Center ist ein Bioenergie-Forschungszentrum des US-Energieministeriums, das vom Office of Biological and Environmental Research im DOE Office of Science unterstützt wird. Das National Renewable Energy Laboratory (NREL) ist ein nationales Labor des US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, das von der Alliance for Sustainable Energy, LLC für das DOE betrieben wird. Diese Arbeiten wurden vom U.S. Department of Energy im Rahmen des Vertrags Nr. DE-AC36-08-GO28308 mit dem National Renewable Energy Laboratory.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biomek FX Automated WorkstationBeckman CoulterBiomek FXAutomated Liquid Handler
WileyThomas Scientific3375E15 (Model 4) oder 3383L20 (Mini-Mill)
antistatische BeutelMinigrip*MGST4P025032,5x3", mehrere Lieferanten verfügbar
verzinnter KupferdrahtMcMaster-Carr8871K840,016" Durchmesser, Teebeutel mit gebogenem Draht
HerbcoPress n' Brew Teebeutel3,5x5 Zoll
Gluco-AmylaseNovozymeSpirizyme Fuel 
Alpha-AmylaseNovozymeLiquozyme SC DS
Natriumacetat-Trihydratjeder chemische LieferantReagenzqualität
Essigsäurejeder chemische LieferantReagenz Qualität
190 (95%) Ethanoljeder chemische LieferantReagenzienqualität
TrichterFreeslate
96- gut C-276 Hastelloy PlattenAspen Machining (Lafayette, Colorado)N/A (Sonderanfertigung)
1/8" LötkolbenspitzeSears
Silikonkleber mit Teflonband 3M51803" breit (36-Yard-Rollen)
EnzymlösungNovozymeCellic CTec2
Zitronensäuremonohydratjeder Chemikalienlieferant
Trinatriumcitrat-Dihydratjeder Chemikalienlieferant
Einweg-, Polystyrol-96-Well-PlattenGreiner Bio-One655101oder gleichwertig; mehrere Lieferanten verfügbar
Glukoseoxidase/Peroxidase MegazymeK-GlucMegazyme D-Glucose Assay Kit
Xylose DehydrogenaseMegazymeK-XyloseMegazyme D-Xylose Assay Kit
Glukose StandardlösungMegazymeK-GlucMegazyme D-Glucose Assay Kit
Xylose StandardlösungMegazymeK-XyloseMegazyme D-Xylose Assay Kit
Probenbecher aus EdelstahlFrontier LaboratoriesPY1-EC80F
GlasfaserplattenPall662278x10" Platten; Kreise gestanzt mit Standardlocher
Zuckerrohr Bagasse Ganze BiomasseRohstoff NIST8491
Eastern Cottonwood (Pappel) Ganze BiomasseRohstoff NIST8492
Monterey Pine Ganze Biomasse RohstoffNIST8493
Weizen Stroh Ganze Biomasse RohstoffNIST8494
Mill

Referenzen

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