Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Zusammenfassung

Reverse Genetik, ein Ansatz zur vollständigen Rettung infektiöser Viren aus einer klonierten cDNA, hat das Gebiet der positivsträngigen RNA-Viren revolutioniert, deren Genome die gleiche Polarität wie zelluläre mRNA haben. Das cDNA-basierte reverse Genetiksystem ist eine bahnbrechende Methode, die eine direkte Manipulation der viralen genomischen RNA ermöglicht und dadurch rekombinante Viren für molekulare und genetische Studien sowohl viraler RNA-Elemente als auch von Genprodukten bei der viralen Replikation und Pathogenese erzeugt. Es bietet auch eine wertvolle Plattform, die die Entwicklung von genetisch definierten Impfstoffen und viralen Vektoren für die Verabreichung fremder Gene ermöglicht. Bei vielen positivsträngigen RNA-Viren wie dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) sind die klonierten cDNAs jedoch instabil, was ein großes Hindernis für den Aufbau und die Vermehrung der funktionellen cDNA darstellt. In diesem Artikel werden die strategischen Überlegungen zur Schaffung und Amplifikation einer genetisch stabilen infektiösen JEV-cDNA in voller Länge als bakterielles künstliches Chromosom (BAC) unter Verwendung der folgenden allgemeinen experimentellen Verfahren beschrieben: Isolierung viraler RNA, cDNA-Synthese, cDNA-Subklonierung und -Modifikation, Assemblierung einer cDNA in voller Länge, cDNA-Linearisierung, in vitro RNA-Synthese und Virusrückgewinnung. Dieses Protokoll stellt eine allgemeine Methode bereit, die anwendbar ist für die Klonierung von cDNA in voller Länge für eine Reihe von positivsträngigen RNA-Viren, insbesondere solche mit einem Genom von >10 kb Länge, in einen BAC-Vektor, von dem infektiöse RNAs in vitro mit einer Bakteriophagen-RNA-Polymerase transkribiert werden können.

Einleitung

Für RNA virologists, die in der rekombinanten DNA-Technologie in den späten 1970er Jahren wurde es möglich, die virale RNA-Genome in cDNA-Klonen, die dann als Plasmide in Bakterien, die für die genetische Manipulation von RNA-Viren vermehrt werden konnten konvertieren. ^{1 Die erste} RNA-Virus zu sein, molekular kloniert wurde Bakteriophage Qß, ein Positiv-Strang-RNA-Virus, das Escherichia coli infiziert. Ein Plasmid, das eine vollständige cDNA Kopie des Qß-Genom-RNA führte zu Infektions Qß-Phagen, wenn sie in E. eingeführt coli. ² Kurz danach wurde diese Technik auf Poliovirus angewendet wird, ein Positiv-Strang-RNA-Virus, von Menschen und Tieren. Ein Plasmid, das für ein Volllängen-cDNA des Poliovirus-Genom-RNA infektiös, wenn es in Säugerzellen transfiziert und in der Lage, infektiöse Virionen ^{3 In diesem} "DNA-aufgelegt" Ansatzes sollte die klonierten cDNAs intrazellulär transkribiert, um virale RNA-Replikation zu initiieren.Es ist jedoch unklar, wie die Transkription initiiert wird, und wie die Transkripte werden auf die richtige Virussequenz verarbeitet. Dieses Anliegen wurde für die Entwicklung eines alternativen "RNA-ins Leben gerufen" orientierten Ansatz, wobei eine vollständige cDNA-Kopie der viralen RNA-Genom unter einem Promotor, der von einem E. erkannt geklont coli oder Phagen-RNA-Polymerase zur Herstellung von synthetischen RNAs in vitro mit definierten 5'- und 3'-Enden, die, wenn sie in Wirtszellen eingeführt das vollständige virale Replikationszyklus durchlaufen. ^4,5 Der erste Erfolg mit diesem Ansatz wurde für Brommosaikvirus gemeldet ^, 6,7 eine positive Strang RNA-Virus von Pflanzen. Seitdem hat sich der RNA-ins Leben gerufen Ansatz für eine breite Palette von Positivstrang-RNA-Viren, einschließlich Caliciviren, Alphaviren, Flaviviren, Arteriviren und Coronaviren entwickelt. ^1,4,5,8

Sowohl in der DNA- und RNA-aufgelegt reversen Genetik Systemen die Konstruktion eines volll cDNA-Klon ist der Schlüssel zum Erzeugen von infektiösen DNA oder RNA von Positivstrang-RNA-Viren, aber es wird eine beträchtliche technische Herausforderung dar, wenn die Größe des viralen Genoms zunimmt. ^9-17 Insbesondere ein großer RNA Genom von ~ 10 -32 kb präsentiert drei Haupthindernisse für das Klonen von voller Länge funktionellen cDNA. ¹⁸ Die erste Schwierigkeit ist die Synthese eines treuen cDNA zu kopieren, da die Wiedergabetreue der RT-PCR ist umgekehrt proportional zur Länge der viralen RNA. Die zweite Hürde ist die Anwesenheit von potentiell toxischen Sequenzen, da lange RNA-Moleküle sind eher unerwartete Sequenzen, die zur Herstellung des cDNA-Fragments in die Plasmide instabil in E. enthalten coli. Der dritte und kritische Punkt ist die Verfügbarkeit eines geeigneten Vektors, da es schwierig ist, einen Klonierungsvektor, der eine virale cDNA-Insert von> 10 kb aufnehmen kann, zu finden. In den vergangenen drei Jahrzehnten haben diese Barrieren durch einige Fortschritte in der Enzymologie, Methodik, eine überwundend Vektorologie. ^1,4,5,8 Davon ist die vielversprechendsten und innovativsten Entwicklungs das Klonen von großen positiven Strang RNA-Viren, wie infektiöse bakterielle künstliche Chromosomen (BACs). Der BAC-Vektor ein low-copy Klonierungsplasmid (1-2 Kopien / Zelle) auf der Grundlage der E. coli F-Plasmid, mit einem Durchschnitt DNA Insertgröße von ~ 120-350 kb ^19-21 Ein DNA-Fragment wird in den BAC-Vektor in einer ähnlichen Weise wie die Klonierung in allgemeinen Klonierungsvektoren eingeführt. die resultierenden BAC-Klone sind über viele Generationen in E. stabil coli. ^22,23 Bisher wurde die BAC-Technologie wurde verwendet, um infektiöse cDNA-Klone für> 10 Mitglieder von drei Positivstrang RNA Virusfamilien, also Flaviviridae, ^{24-29 Arteriviridae,} 30 und Coronaviridae erstellen. ^{9,16,17 , 31,32}

Verwendung Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) als Beispiel, berichtet die vorliegende Arbeit die detaillierten Verfahren, die sein können,verwendet, um eine genetisch stabil voller Länge infektiös BAC für eine Vielzahl von Positiv-Strang-RNA-Viren zu konstruieren. JEV ist eine zoonotische Flavivirus ^33, die in der Natur zwischen Vögeln, Schweinen und anderen Wirbeltierwirten durch Mückenvektoren übertragen wird. ^34,35 Beim Menschen kann JEV-Infektion die schwere oft tödliche neurologische Erkrankung Japanische Enzephalitis verursachen (JE), ^{36, die} in auftritt Asien und Teilen des Westpazifik, ^37,38 mit einem geschätzten jährlichen Inzidenz von ~ 50,000-175,000 klinische Fälle. ^39,40 Das Genom der JEV ist ein ~ 11-kb, einzelsträngig, positive Sense-RNA-Molekül und besteht aus einen einzelnen offenen Leserahmen (ORF), die durch zwei nicht-kodierenden Regionen (NCR) am 5 'und 3' flankiert endet. ^41,42 Der ORF codiert ein Polyprotein, das von Host und virale Proteasen gespalten wird, um 10 einzelne Proteine ​​zu erzeugen, bezeichnet als C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5 in N- zu C-terminalen Richtung. ^34,43,44 Auch eine EXtended Form von NS1 (NS1 ') von ribosomalem -1-Leserastersprung an den Codons 8-9 von NS2A ausgedrückt. ^45,46 Von diesen 11 Proteine, sind die drei Strukturproteine ​​(C, prM und E) für die Bildung von Infektions Virionen, ^47,48 und die verbleibenden acht strukturelle Proteine ​​(NS1 bis NS5 und NS1) sind von entscheidender Bedeutung für die virale RNA-Replikation, ^49-51 Partikelzusammenlagerung, ^52-56 und angeborenen Immunität Flucht. ^57-59 Sowohl die 5 'und 3 'NCRs enthalten konservierte Primärsequenzen und Form RNA sekundäre / ​​tertiäre Strukturen, ^60-62, die wichtig für die Modulation Virus-RNA-Replikation sind. ^63,64

Dieses Protokoll beschreibt die Werkzeuge, Verfahren und Strategien zur Erzeugung eines Volllängen-infektiösen BAC von JEV SA ₁₄ -14-2. ²⁸ diese Funktions BAC-Klon enthält eine vollständige cDNA-Kopie des JEV genomische RNA, ^{65, die} durch einen Promotor umfasst ist für die SP6-RNA-Polymerase stromaufwärtsdes viralen 5'-Ende und eine einzigartige Xba I-Restriktionsstelle stromabwärts von der viralen 3'-Ende für eine in vitro run-off-Transkription. Dieser BAC-Technologie anwendbar ist, um eine voll funktionsfähige Konstruktion cDNA molekularen Klon für eine Reihe von Positivstrang-RNA-Viren.

Protokoll

ANMERKUNG: Abbildung 1 stellt eine Strategie für die Konstruktion eines in voller Länge infektiös JEV cDNA als BAC ²⁸ Tabelle 1 gibt eine Liste der in diesem Protokoll verwendeten ^{Oligonukleotide. 28.}

1. Extrahieren viraler RNA aus JEV Partikel in Zellkulturüberständen

1. Beginnen Sie mit der Zellkulturmedium, das JEV-SA ₁₄ -14-2, eine Live-JE-Impfstoff-Virus, biologischen Sicherheitsstufe 2 Sicherheitsbehälter erfordert.
   Hinweis: Der Virustiter ungefähr 1-3 × 10 ⁶ plaquebildenden Einheiten / ml.
2. Nehmen Sie die Biosicherheitstraining für alle mikrobiologischen Standardverfahren, Sicherheitsausrüstung, und Laboreinrichtungen erforderlich, vor jeder Arbeit mit JEV SA ₁₄ -14-2.
3. Reinige viraler RNA aus einem Aliquot der virushaltigen Zellkulturmedium unter Verwendung einer einphasigen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat ⁶⁶ (Figur 1A).
   1. Anzeiged 600 ul der monophasischen Reagens zu 200 ul des Kulturüberstands in einem 1,7 ml Mikroröhrchen. Homogenisieren der Mischung durch Quittungs das Rohr kräftig für 30 sec und Inkubation für 5 min bei RT.
   2. Fügen Sie 160 ul Chloroform zu der homogenisierten Probe. Gründlich mischen durch Händeschütteln das Rohr kräftig für 15 Sekunden und lassen es für 2-3 min bei RT.
   3. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 13400 × g für 15 min bei 4 ° C, was zu einer Trennung der beiden flüssigen Phasen, dh eine untere organische Phase und in eine obere wäßrige Phase führt. Wird die obere wäßrige Phase (weniger als 200 & mgr; l), enthaltend die RNA zu einem neuen Mikroröhrchen.
   4. Ausfällung der RNA durch Zugabe von 1 ul von 5 ug / ul Glykogen 400 ul 100% iges Isopropanol und einer Inkubation für 10 min bei RT.
   5. Zentrifuge das Gemisch bei 13.400 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol durch Puls Vortexen drei vor fünfZeiten und Zentrifugieren bei 13.400 × g für 5 min bei 4 ° C.
   6. Der Luft trocknen den RNA-Pellet für 10 min und lösen es in 40 ul dH ₂ O. Bewahren Sie die extrahierte RNA bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Synthesize einen Satz von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4), die die gesamte virale Genom-RNA durch reverse Transkription (RT) -PCR

1. Führen eine 20 & mgr; l RT-Reaktion mit einem 10 ul-Aliquot der gereinigten viralen RNA als Matrize und einer modifizierten Form des murinen Moloney-Leukämie-Virus-Reverse-Transkriptase. ⁶⁷
   1. Ein 13 ul-Gemisch, enthaltend 10 & mgr; l der gereinigten RNA, 1 & mgr; l 10 mM dNTP-Mix, 1 & mgr; 4 pmol / ul Primer und 1 & mgr; l _dH 2 O eingestellt Verwenden Sie die Fragment-spezifischen Primer für jeden RT-Reaktion: 1RT für F1, 2RT für F2, 3RT für F3 und 4RT für F4.
   2. Inkubieren der Mischung bei 65 ° C für 5 min auf Eis für 1 min, und dann schnell Spin, um den conte sammelnnts an der Unterseite des Rohres.
   3. Hinzufügen von 4 ul 5 · RT-Puffer, 1 & mgr; l 0,1 M DTT, 1 & mgr; l 40 U / & mgr; l RNase-Inhibitor und 1 ul 200 U / ul reverse Transkriptase. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren drei bis fünf Mal.
   4. Ließ die Reaktion ablaufen bei 50 ° C für 1 h, dann Hitze-Inaktivierung die Probe bei 70 ° C für 15 min. Bewahren Sie die synthetisiert Erststrang-cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung.
2. Führen eine 100 & mgr; l PCR-Reaktion mit einem 5 ul Aliquot der hitzeinaktiviertem RT-Reaktion als Template und einem High-Fidelity-DNA-Polymerase, thermostabilen ⁶⁸ (1B).
   1. Einrichten einer 100 ul PCR-Reaktion auf Eis mit 5 ul des RT-Reaktion wurden 20 ul 5 · PCR-Puffer, 4 ul 10 mM dNTP-Mischung, 5 ul 10 uM Vorwärtsprimer 5 ul 10 uM reverse-Primer, 1 & mgr; l 2 U / & mgr; l DNA-Polymerase und 60 & mgr; l dH ₂ O. Verwenden Sie die fragmentspezifischen Primerpaar für jede PCR reaction: 1F + 1R für F1 (2573 bp), 2F + 2R für F2 (4171 bp), 3F + 3R für F3 (3922 bp), und 4F + 4R für F4 (1798 bp).
   2. Vorsichtig mischen durch Finger-Spiegeln das Rohr drei bis fünf Mal und kurz zentrifugieren, um den Inhalt am Boden zu sammeln.
   3. Beginnen Thermocycling mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 30 Sekunden bei 98 ° C, gefolgt von 25-30 Zyklen mit dem folgenden PCR-Profil: 10 s bei 98 ° C, 30 sec bei 60 ° C und 1-2 min (30 s / kb) bei 72 ° C. Speicherung der PCR-Produkte bei 4 ° C bis zur Analyse.
3. Ausführen eines 2-5 & mgr; l Aliquot von jeder PCR-Reaktion auf einem 0,8% Agarosegel, das 0,5 ug / ml Ethidiumbromid (EtBr) (Abbildung 2).
   ACHTUNG: EtBr ist ein starkes Mutagen und erfordert Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen und äußerst vorsichtig, um während seiner Verwendung, Lagerung und Entsorgung beachten.

3. Subklon jeder der vier cDNA-Fragmente (F1 bis F4) in einen BAC Vector zum pBAC / F1 bis pBAC / F4 b erstelleny Molecular Cloning Techniques

1. Verdauen die Vektor und Insert-DNA mit zwei geeigneten Restriktionsendonukleasen, wie folgt:
   1. Durchführen einer sequentiellen Verdau pBAC / PRRSV / FL ^(Vektor), 30 eine Ableitung des pBeloBAC11 Plasmid (7507 bp, GenBank Zugangsnummer U51113) mit Pme I und Not I in einem Gesamtvolumen von 60 ul (enthaltend ~ 500 ng DNA 10 U Enzym 1x Verdauungspuffer und 1 · BSA) bei 37 ° C für 12-15 h, der den 15426-bp-Vektorfragment ergibt.
   2. Durchführen einer sequentiellen Verdau von jeder der vier cDNA-Amplikons (Einsatz) mit Sma I und Not I in einem Gesamtvolumen von 60 ul (enthaltend ~ 1 & mgr; g DNA, 20 U Enzym, 1 × Verdauungspuffer und 1 · BSA) bei 25 ° C (Sma I) oder 37 ° C (Not I) für 12-15 h, das die folgenden Insertfragmente der gewünschten Grße ergibt: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), und F4 (1784 bp).
2. Reinigen diegewünschten Vektor und Insert-DNA-Fragmente durch Gel-Extraktion.
   1. Trennen Sie die doppelt verdauten Produkte auf einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, das 0,5 ug / ml EtBr. Ausschneiden eines Bandes des gewünschten DNA-Fragments mit einer minimalen Menge von Agarose (üblicherweise ~ 200 ul) unter langwelligem UV-Licht.
   2. Ein gleiches Volumen von TEM-Puffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA und 10 mM _MgCl 2) einer Agarose in einem 1,7 ml Mikroröhrchen der ausgeschnitten. Inkubieren der Probe bei 72 ° C für 10-15 min, mit Vortexen alle 2-3 min, bis die Agarose vollständig geschmolzen.
   3. Hinzufügen eines gleichen Volumens vorgewärmten Puffer-gesättigtem Phenol, kräftig vortexen für 1 min, und die Zentrifuge bei 13.400 xg für 10 min bei RT.
      Hinweis: Das Gemisch trennt sich in eine untere organische Phase und eine obere wässrige Phase. Wird die obere wässrige Phase, die die DNA in ein neues Mikroröhrchen.
   4. Ein gleiches Volumen an Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1), 1 min vortexen und zentrifugieren bei 13,400 xg für 10 min bei RT. Wird die obere wässrige Phase in ein neues Mikroröhrchen.
   5. Mit 0,5 ul 10 ug / ul Hefe-tRNA, 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina 100% Ethanol. Halten Sie die Mischung auf Eis für 20 min.
   6. Zentrifugieren der Mischung bei 13.400 × g für 10 min bei RT. Entfernen des Überstandes und Waschen des DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol durch Puls Vortexen drei bis fünf mal und Zentrifugieren bei 13.400 × g für 10 min.
   7. Luft trocknen den DNA-Pellet 10 Minuten zu und löse es in 20 ul TE-Puffer (10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA [pH 7,6]).
3. Ligieren den gewünschten Vektor und Insert-DNA-Fragmente unter Verwendung von T4 DNA-Ligase.
   1. Ein 20 ul Ligationsreaktionslösung, enthaltend 50-100 ng der Vektor-DNA, ein ~ 3-fachen molaren Überschuss der Insert-DNA, 400 U T4-DNA-Ligase und 1 × Ligationspuffer eingestellt. Inkubieren der Ligationsreaktion bei 16 ° C für 12-15 Std.
      Hinweis: Fügen Sie eine negative control Reaktion, dh, vector nur ohne Einsatz, parallel.
   2. Führen Sie vier separate Ligationen, die jeweils den Beitritt zur 15426-bp Pme-NotI-Fragment von pBAC / PRRSV / FL mit dem 2559-bp (F1), 4157-bp (für F2), 3908-bp (für F3), oder 1784-bp (F4) SmaI-NotI-Fragment von einem der vier cDNA-Amplikons, um Subklone pBAC / F1 um pBAC / F4 zu erzeugen.
4. Transformieren der ligierten DNA in E. coli DH10B durch das CaCl ₂ -Hitze Schockverfahren.
   1. Nehmen Sie 100 & mgr; l Aliquots der CaCl ₂ -behandelten kompetente DH10B-Zellen ⁶⁹ bei -80 ° C gelagert und tauen sie auf Eis.
      Hinweis: Verwenden Sie 100 ul der Zellen pro Transformation.
   2. Fügen Sie eine 10 ul-Aliquot der DNA-Ligationsreaktion zu 100 ul der aufgetauten Zellen in einem 1,7 ml Mikroröhrchen, vorsichtig mischen, indem Sie den Schlauch und halten auf dem Eis für 30 min.
   3. Hitzeschock die DNA-Zellmischung für 45 Sekunden in einem 42 ° C water Bad, auf Eis für 2 min, und fügen Sie 900 ul LB-Brühe auf RT vorgewärmt.
   4. Die Hitzeschock-Zellen bei 35 ° C für 1 Stunde, mit 225-250 rpm schütteln.
   5. Verteilt 50 bis 200 ul Aliquots der kultivierten Zellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 10 ug / ml Chloramphenicol (CML). Halten Sie die Platten bei RT rechten Seite nach oben, bis sie trocken sind.
   6. Drehen Sie die Platten auf den Kopf und Inkubation bei 35 ° C für 15 Stunden.
5. Rückgewinnung des klonierten BAC-DNA aus den Wirtszellen durch eine spaltenbasierten Reinigungsverfahren (Abbildung 1C).
   1. Pick sechs bis acht Bakterienkolonien aus den LB-Agarplatten und Cml inokulieren sie in 3 ml 2 × YT-Brühe, die 10 ug / ml Cml. Die Kulturen bei 35 ° C inkubieren 10 h unter starkem Schütteln (225-250 UpM).
   2. Isolieren rekombinanten BAC DNAs 1 bis 1,5 ml der Bakterienkulturen mit Spin-Säulen, wie durch den Hersteller vorgeschrieben. ⁷⁰ Eluiere das extrahierte DNA (typitisch 100-200 ng) in 20 ul TE-Puffer.
   3. Führen zwei analytischen Restriktionsenzymverdaus der isolierten BACs für ~ 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 10 ul, einer, um die Anwesenheit des Vektors mit einem korrekten Insert identifiziert unter Verwendung der gleichen Enzyme für die Klonierung verwendet wird (siehe Protokoll 3.1) und das andere die Integrität des klonierten BACs mit einem geeigneten Enzym (z, Bgl II, Nco I oder Pst I) zu prüfen, Erzeugen eines einmaligen Restriktionsfragmentmuster.
   4. Propagieren die korrekt kloniert BACs durch Inokulieren 500 ul der positiven Bakterienkulturen (von Protocol 3.5.1) in 500 ml 2 × YT-Medium Cml und Kultivierung des Inokulums für 6 Stunden bei 35 ° C unter Schütteln bei 225-250 Umdrehungen pro Minute. Reinige den BAC-DNA (typischerweise 10-20 ug) aus dem 500-ml-Kultur unter Verwendung von Filterkerzen, wie vom Hersteller empfohlen. ⁷¹
      Hinweis: Die ersten vier BAC Subklone, die jeweils eine cDNA-Fragment des JEV-Genom-RNA, könnte sich auf habene oder mehrere unerwünschte Mutation (en) im Vergleich zu der Konsensus-Sequenz des viralen Genoms ⁴² (die als eine Referenzsequenz dient). Eine solche Mutation muss durch PCR-basierende stellengerichtete Mutagenese vor der Montage eines Volllängen-JEV cDNA korrigieren. ²⁷

4. Erstellen Sie ein in voller Länge JEV cDNA mit dem 5 'SP6-Promotor und 3'-Run-off-Site

1. Machen Sie drei genetische Veränderungen (siehe unten Protokolle 4.1.1-4.1.3) in den geklonten cDNAs in vitro Run-off-Transkription von Genomlänge RNAs mit der authentischen 5 'und 3' zu ermöglichen Enden des viralen Genoms.
   1. Einzuführen einen SP6-Promotor unmittelbar stromaufwärts von dem 5'-Ende des viralen Genoms durch Überlappungsextensions-PCR (1D, pBAC / F1 ^SP6).
      1. Verstärken zwei überlappenden DNA-Fragmente über die erste Standard-PCR von pBAC / F1 mit den beiden Primerpaare SP6F + SP6R (Produktgröße, 173 bp) und F1F + F1R (Produkt sIZE 676 bp), die jeweils in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend 1 & mgr; l Matrizen-DNA (~ 200 pg / ul), 10 ul 5 x PCR-Puffer, 2 ul 10 mM dNTPs, je 10 & mgr; M Vorwärts und Rückwärts 2,5 ul Primer, 0,5 ul 2 U / & mgr; l ^{DNA-Polymerase,} 68 und 31,5 & mgr; l _dH 2 O Führen Sie die PCR unter Verwendung des folgenden Zyklusprofils: 98 ° C für 30 sec, und 25 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 20 sec.
      2. Gel-Reinigung der zwei PCR-amplifizierten DNA-Fragmente nach dem Ausführen von jeder der beiden PCR-Produkte auf einem 1,5% niedrigschmelzende Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      3. Verschmelzen die beiden Gel-gereinigtes DNA-Fragmente über die zweite Fusions-PCR mit der äußersten Primer SP6F + F1R (Produktgröße, 821 bp) in einem 100 & mgr; l-Reaktion, darunter 1 & mgr; l jeder der beiden gereinigten DNA-Fragmente (~ 100 pg / ul) 20 & mgr; l 5 × PCR-Puffer, 4 ul 10 mM dNTPs, jeweils von 10 & mgr; M Vorwärts- und Rückwärts 5 ul Primer, 1 & mgr;2 U / ul ^{DNA-Polymerase,} 68 und 63 & mgr; l dH ₂ O. Verwenden Sie die folgende thermische Zyklus-Profil: 98 ° C für 30 sec, und 25 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec.
      4. Gel-Reinigung des fusionierten PCR Amplikon aus einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      5. Führen Sie die in den Protokollen 3.1-3.5 beschriebenen fünf Schritten Klonen vor, um die 760-bp Pac I- Bsi WI-Fragment des gelgereinigt verschmolzen PCR Amplikon mit dem 9532-bp Pac I- Bsi WI-Fragment von pBAC / F1 ligieren zu erzeugen pBAC / F1 ^SP6.
   2. Entfernen Sie die bereits bestehenden, internen XbaI-Stelle bei Nukleotid 9131 durch die Einführung einer stillen Punktmutation (A ⁹¹³⁴ → T) über Overlap-Extension-PCR (1D, pBAC / F3 ^KO).
      1. Amplifizieren zwei überlappenden DNA-Fragmente, die durch die erste Standard-PCR von pBAC / F3 mit den beiden Primerpaare x1F + X1R(Produkt-Größe, 746 bp) und X2F + X2R (Produktgröße, 316 bp) in einer 50 ul Reaktion unter den in Protokoll 4.1.1.1 beschriebenen Versuchsbedingungen.
      2. Gel-Reinigung der zwei PCR-amplifizierten DNA-Fragmente nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1,5% niedrigschmelzende Agarose-Gele, wie in 3.2 beschriebenen Protokoll.
      3. Verschmelzen die beiden Gel-gereinigtes DNA-Fragmente über die zweite Fusions-PCR unter Verwendung der Primer äußersten x1f + X2R (Produktgröße, 1033 bp) in einem 100 ul Reaktion unter den in Protokoll 4.1.1.3 beschriebenen Versuchsbedingungen.
      4. Gel-Reinigung des fusionierten PCR Amplikon aus einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      5. Führen Sie die in den Protokollen 3.1-3.5 beschriebenen fünf Schritten Klonen vor, um die 949-bp Avr II- Not I Fragment des gelgereinigt verschmolzen PCR Amplikon mit dem 16245-bp NotI Bsi WI und 2141 bp Bsi W I ligieren - AvrII Fragmente pBAC / F3 zu pBAC / F3 ^KO zu produzieren.
   3. Ingenieur eine neue künstliche Xba I run-off-Stelle direkt stromabwärts von dem 3'-Ende des viralen Genoms durch PCR-basierte zielgerichtete Mutagenese (1D, pBAC / F4 ^RO).
      1. Generieren Sie ein DNA-Fragment durch PCR von pBAC / F4 mit Primern ROF + ROR (Produktgröße, 324 bp) in einem 100 & mgr; l-Reaktion, die 1 & mgr; l Matrizen-DNA (~ 200 pg / ul), 20 & mgr; l 5 × PCR-Puffer, 4 ul 10 mM dNTPs, jeweils von 10 uM vorn 5 & mgr; l und Rückwärtsprimer, 1 & mgr; 2 U / & mgr; l ^{DNA-Polymerase,} 68 und 64 & mgr; l _dH 2 O Führen Sie die PCR unter Verwendung des folgenden Zyklusprofils: 98 ° C für 30 sec, und 25 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 15 sec.
      2. Gel-Reinigung des PCR-amplifizierte DNA-Fragment aus einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      3. Führen Sie die in den Protokollen 3.1-3.5 beschriebenen fünf Schritten Klonen vor, um die 283-bp Sfi I- N ligierenot I-Fragment des Gel-gereinigtes PCR-Amplicon mit der 16933-bp Sfi-NotI-Fragment von pBAC / F4, um pBAC / F4 ^RO erstellen.
2. Montieren Sie einen Satz der vier modifizierten, überlappende cDNAs in einer einzigen abendfüllenden SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) durch den Beitritt von drei natürlichen Restriktionsstellen (BSR GI, Bam HALLO, und Ava I ) in sequentieller Weise mit dem fünfstufigen Klonierungsverfahren in Protocols detailliert 3.1-3.5 (1E): F1 ^SP6 → F1 ^SP6 F2 (durch Ersetzen des BSR G-NotI-Fragment von pBAC / F1 ^SP6 mit der pBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO (durch den Austausch des Bam H-NotI-Fragment von pBAC / F1 ^SP6 F2 mit der pBAC / F3 ^KO) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^{RO (durch} Austausch der Ava-NotI-Fragment von pBAC / F1 ^SP6 F2F3 ^KO mit dem der pBAC / F4 ^RO).

5. Bereiten Sie ein hochreines Maxi-Prep des in voller Länge SA ₁₄ -14-2 BAC

1. Wachsen Sie eine Einzelkolonie von E. coli DH10B Durchführung pBAC / SA ₁₄ -14-2 in 3 ml 2 × YT-Brühe, die 10 ug / ml Cml 10 h bei 35 ° C unter Schütteln bei 225-250 rpm und dann skaliert durch Inokulieren 500 ul der 10 h Bakterienkultur in 500 ml 2 × YT-Medium Cml und Kultivierung des Inokulums für 6 Stunden bei 35 ° C unter kräftigem Schütteln.
2. Zentrifuge die Bakterienkultur in zwei 250 ml Flaschen bei 3.107 × g für 15 min bei 4 ° C. Resuspendieren jedes Pellet in 30 ml GTE-Lösung (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl und 10 mM EDTA [pH 8,0]), und fügen 500 ul 60 mg / ml Lysozym. Inkubieren Sie die beiden Zellsuspensionen auf Eis für 10 min.
3. 60 ml frisch zubereitete Lyse-Lösung (0,2 N NaOH und 1% SDS) an jeder Zellsuspension, gut mischen, bis klar ist, und halten Sie die Lysatebei RT 10 min.
4. In 45 ml Neutralisationslösung (100 ml, bestehend aus 60 ml 5 M Kaliumacetat, 11,5 ml Eisessig und 28,5 ml _dH 2 O) zu jeder Flasche, gut mischen durch Umdrehen der Flaschen und bebrüten die neutralisiert Lysaten auf Eis für 10 min.
5. Zentrifugation der Lysate bei 18.566 neutralisiert × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand der beiden Flaschen in zwei neue 250 ml-Flaschen; fügen 0,6 Volumen von 100% Isopropanol zu jedem, und bewahren Sie sie auf Eis für 20 min.
6. Spin-down der Niederschläge bei 18.566 × g für 20 min bei 4 ° C. Aufzulösen jedes Pellet in 5 ml TE-Puffer, kombiniert sie in ein 50 ml Röhrchen (10 ml gesamt) und fällt die RNA durch Zugabe eines gleichen Volumens von 5 M Lithiumchlorid. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min.
7. Zentrifuge das RNA-Präzipitat bei 14.636 × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein neues 250-ml-Tube und fallen DNA durch Zugabe von 2 Volumina 100% Isopropanol.Inkubieren der Mischung auf Eis für 20 min.
8. Zentrifugieren Sie das DNA-Präzipitat bei 18.566 × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand aspirieren, resuspendieren DNA-Pellet in 9,5 ml TE-Puffer (pH 7,6), und fügen Sie 10 g Cäsiumchlorid (CsCl) und 390 & mgr; l 10 mg / ml EtBr.
9. Laden der DNA-CsCl-EtBr-Lösung in ein 16 × 76 mm siegelbare Polypropylenröhrchen unter Verwendung einer Spritze mit einer 18 G-Nadel ausgestattet. Spin der abgedichteten CsCl Gradienten in einer Ultrazentrifuge bei 401.700 × g für 16 h bei 20 ° C (Figur 3).
10. Sammeln eine DNA-Bande von BAC-Plasmid aus dem CsCl-Gradienten unter Verwendung einer 18 G-Nadel, um eine Entlüftungsöffnung an der Oberseite des Gradienten und eine 20 G-Nadel ausgestatteten Spritze den BAC-DNA von der Seite des Gradienten abzurufen.
11. In 2,5 Volumina _dH 2 O-gesättigtem Butanol zu der EtBr-gefärbten BAC DNA-Probe und mischen durch Vortexen. Zentrifuge das Gemisch bei 13.400 × g für 1 min und übertragen die untere wäßrige Phase in ein neues 1,7 ml microtube. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal.
12. Fällt das EtBr freien BAC-DNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina 100% Ethanol zu dem Butanol extrahiert BAC-DNA und Inkubieren für 10 min auf Eis. Zentrifuge der Niederschlag bei 13.400 × g für 10 Minuten, Waschen der DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen und erneut pelle es durch Zentrifugieren.
13. Luft trocknen den DNA-Pellet 10 Minuten zu und löse es in 200 ul TE-Puffer (pH 7,6).
    ANMERKUNG: Abbildung 4 zeigt eine Übersicht der reversen Genetik System für JEV SA ₁₄ -14-2.

6. Transkribieren synthetische RNAs in vitro aus einem linearisierten voller Länge JEV BAC-DNA

1. Führen eine große Restriktionsenzymverdau pBAC / SA ₁₄ -14-2 mit XbaI in einem Gesamtvolumen von 100 ul (enthaltend 3 ug DNA, 60 U Enzym, 1 × Verdauungspuffer und 1 · BSA) bei 37 & deg; C für 12-15 h. Untersuchen Sie ein 3-ul-Aliquot der digestion Reaktion auf einem 0,8% Agarosegel, enthaltend 0,5 & mgr; g / ml EtBr.
2. Weiter Inkubieren der Aufschlussreaktion mit 25 U Mung Bean Nuclease (MBN) bei 30 ° C für 2 Stunden (4A).
3. Bringe das Volumen des XbaI-verdauten, MBN behandelten Probe bis zu 300 & mgr; l mit dH ₂ O. Ein gleiches Volumen an Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zu der verdünnten Probe, kräftig vortexen für 1 min, Schleudern bei 13.400 xg für 10 min, und dann wird die obere wässrige Phase in ein neues 1,7 ml Mikroröhrchen. Hinzufügen eines gleichen Volumen Chloroform und wiederholen Sie den Extraktionsverfahren.
4. Wiederherstellen der Phenol / Chloroform-extrahiert, linearisiert BAC durch Ethanolpräzipitation: Hinzufügen von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina 100% Ethanol und Inkubation auf Eis für 20 min. Centrifuge der Niederschlag bei 13.400 × g für 10 Minuten, waschen Sie die DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und dann drehen Sie es nach unten durch erneute Zentrifugation.
5. Der Luft trocknen den DNA pellet für 10 min zu und löse es in 30 ul dH & _{sub2; O} Überprüfen ein 1-ul-Aliquot der gewonnenen BAC auf einem 0,8% igen Agarosegel mit 0,5 ug / ml EtBr (5A).
6. Durchführen einer Ablauf Transkription des linea BAC-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 ul (enthaltend ~ 200 ng Matrizen-DNA, 0,8 mM Kappe analog ^[m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTPs 40 U RNase-Inhibitor, 20 U SP6 ^{RNA-Polymerase,} 72 und 1 × Transkriptionspuffer) bei 37 ° C für 1 Stunde (4B). Umfassen 0,5 & mgr; M ^[3 H] UTP für die RNA-Quantifizierung auf der Grundlage ^von [3 H] UTP Inkorporation, wie durch Adsorption an DE-81-Filterpapier beobachtet. ⁶⁹
7. Ausführen eines 1-2 & mgr; l Aliquot des Ablauftranskriptionsreaktion auf einem 0,6% Agarosegel, enthaltend 0,5 & mgr; g / ml EtBr (5B).

7. Bestimmen RNA Infektiosität und Virusausbeute

1. Kultivieren Sie BHK-21-Zellen in 150 mm culture Schalen in einer Dichte von 3 × 10 ⁶ Zellen / Schale für 24 h bei 37 ° C mit _5% CO 2.
   Hinweis: Beibehaltung der BHK-21-Zellen in Alpha Minimalmedium mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin, Vitaminen und Penicillin / Streptomycin ergänzt.
2. Spülen der Zellenmonoschicht mit 10 ml kalten Lösung A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na _{2 HPO 4} und 1,5 mM KH _{2 PO 4).} Trennen der Zellen von den Schalen durch Behandlung mit 4 ml Trypsin-EDTA (0,25%), und sammeln sie durch Zentrifugation bei 270 × g in einer Tischzentrifuge für 2 min.
3. Zellpellet mit 50 ml kalten Lösung A in einem konischen 50 ml-Röhrchen und zentrifugieren der Zellsuspension bei 270 × g für 2 min. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal; nach dem letzten Waschen, Zellpellet in einer Dichte von 2 × ¹⁰ 7 Zellen / ml in Sol A.
4. Mischen Sie eine 400-ul-Aliquot der Zellsuspension mit 2 μg synthetischer RNA in einem 2-mm-Spalt Küvette und prompt elektroporieren der Mischung mit einem Elektroporator unter optimalen Elektroporationsbedingungen: 980 V, 99 & mgr; s Pulslänge und 5 Impulsen (4C).
   Hinweis: Mit der ³ H-markierte RNA in Protokoll 6.5 direkt zur Elektroporation hergestellt ohne weitere Reinigung.
5. Lassen Sie die elektroporierten Zellen bei RT für 10 min und in ein 1,7 ml Mikroröhrchen, die 600 ul komplettem Kulturmedium.
6. Vorbereitung einer 10-fachen Serienverdünnung der elektroporierten Zellen in 1 ml komplettem Kulturmedium und der Platte 100 & mgr; l-Aliquot jeder Verdünnung auf den Monoschichten von BHK unelectroporated-21-Zellen (5 × 10 ^{5) in einer} Platte mit 6 Vertiefungen.
7. Nach 4-6 h Inkubation lagern die Zellen mit 0,5% Agarose in minimalem essentiellen Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Die Platten für 4 Tage bei 37 ° C mit _5% CO 2.
8. Visualisieren Sie die Infektionszentrums (Plaques), die durch Fixierung mit 7% Formaldehyd und Färbung mit 1% Kristallviolett in 5% Ethanol ²⁷ (6A).
   1. Optional: Überprüfen Sie RNA-elektroporierten Zellen bei 18-20 h nach der Transfektion für die JEV-Proteinexpression durch Immunfluoreszenztests ^27,73 (6B), und Ernte der Überstände aus den RNA-elektroporierten Zellen bei 22 und 40 Stunden nach der Transfektion für die Virus Titration von Plaque-Assays ^27,63 (6C).

Ergebnisse

Für alle Positivstrang-RNA-Viren, die Zuverlässigkeit und die Effizienz einer reversen Genetik System abhängig von der genetischen Stabilität eines klonierten cDNA voller Länge, deren Sequenz ist äquivalent zu der Konsensussequenz der genomischen Virus-RNA. ^27. Figur 1 zeigt einen fünf- Schritt-Strategie für die Konstruktion eines Volllängen-infektiösen cDNA als BAC für JEV SA ₁₄ -14-2 ^28: Schritt 1 Reinigung von viraler RNA aus der Zellkulturüberstand von JEV-infizierten BHK-21-Zellen (1A); Schritt 2 Synthese von vier überlappenden cDNA-Amplikons (F1 bis F4) überspannt die gesamte virale Genom (1B); Schritt 3 Subklonieren jedes der vier benachbarten cDNA-Fragmenten in einen BAC-Vektor, wodurch pBAC / F1 um pBAC / F4 (1C); Schritt 4 Abwandlung der klonierten cDNAs für in vitro-Run-off-Transkription mit SP6-RNA-Polymerase, das heißt, wobei sich der SP6Promotorsequenz unmittelbar stromaufwärts des viralen 5'-Ende (pBAC / F1 ^SP6), wodurch eine bereits bestehende interne Xba I-Stelle am Nukleotid 9131 durch die Einführung einer stillen Punktmutation, A → T ⁹¹³⁴ (pBAC / F3 ^KO) und das Einfügen eine neue künstliche Xba I run-off-Stelle unmittelbar stromabwärts der viralen 3'-Ende (pBAC / F4 ^RO) (1D); und Schritt 5, Montage von einer Volllängen-SA ₁₄ -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (1E). In Tabelle 1 sind die in diesem Klonierungsverfahren verwendeten Oligonukleotide. ²⁸

Für die Konstruktion eines funktionalen JEV cDNA ist ein erster wichtiger Schritt bei der Synthese der vier überlappenden cDNA-Fragmente unter Verwendung der gereinigten viralen RNA als Matrize für die RT-PCR. 2 stellt ein repräsentatives Ergebnis für die vier RT-PCR-Produkte waren auf einem 0,8%Agarose-Gel. Dieses Gel zeigt deutlich, dass ein voller Länge JEV cDNA ist in vier überlappenden cDNA-Fragmente amplifiziert. Gelegentlich kann RT-PCR-Reaktionen ein oder mehrere weitere virusspezifische oder nicht-spezifische Produkte, die meist kleiner als die erwarteten Produkts zu ergeben, wegen der nicht-spezifischen Anlagerung der Primer bei der cDNA-Synthese / Amplifikation. Andererseits wenig oder keine erwartete RT-PCR-Produkt würde aufgrund zufälliger RNase Kontamination während der viralen RNA-Isolierung oder unsachgemäße RT-PCR-Technologie amplifiziert sein.

Der nächste Schlüsselschritt ist die Clonierung und Modifikation einer Teil- oder Volllängen-JEV cDNA in BAC, die eine relativ einfache Prozedur, die von rekombinanten Standard-DNA-Techniken verwendet, ist. ⁶⁹ 3 stellt ein repräsentatives Ergebnis für die Reinigung des BAC-Klon, eine cDNA voller Länge des JEV SA ₁₄ -14-2 durch Streifenbildung in einem CsCl-Gradienten EtBr.In diesem Experiment wurde nach Zentrifugation für 16 Stunden bei 401.700 × g, zwei getrennte Banden, dh der E. coli chromosomale DNA oben und die supercoiled BAC-Plasmid-DNA unter, sind in der Mitte des Rohres unter langwelligem UV-Licht sichtbar. Ein minimales Volumen (~ 400 & mgr; l) des unteren BAC-DNA-Bande wurde vorsichtig durch das Stoßen ein Loch mit einer Spritze auf der Seite der Röhrchen gesammelt. Anschließend wurde das Ethidiumbromid aus dem BAC-DNA durch Butanolextraktion extrahiert und der EtBr freien BAC DNA wurde durch Ethanolfällung konzentriert.

Der letzte Schritt ist die Bestimmung der spezifischen Infektivität der synthetischen RNAs in vitro aus dem Volllängen-SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) nach der RNA-Transfektion in permissive Zellen (Figur 4) transkribiert. Dieser Schritt erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten: Schritt 1, Linearisierung des Volllängen-SA ₁₄ -14-2-cDNA am 3'-Ende des viralen Genoms (4A); Schritt 2 Herstellung von synthetischen RNAs, die von dem linearisierten cDNA durch Run-off-Transkription (4B); und Schritt 3, Rettung der rekombinanten Viren in BHK-21-Zellen mit den synthetischen RNAs (4C) transfiziert. Experimentell wurden zwei unabhängige Klone von pBAC / SA ₁₄ -14-2 mit XbaI Verdau linearisiert und mit MBN behandelt, um das Vier-Basen 5'-Überhang von der XbaI-Verdauung erzeugten entfernen. Die linearisierten BACs wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt, gefolgt von Ethanolfällung. Die Linearisierung der beiden gereinigten BACs wurde auf einem 0,8% igen Agarosegel (5A) demonstriert. Die Phenol-Chloroform-Extraktion muss sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß die linearisierte BACs RNase-frei. Jeder der beiden linearisierte BACs diente als Vorlage für die cDNA Ablauf Transkription unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase in Gegenwart der ^m 7 G (5 ') ppp (5') Eine Kappe analog. Die Integrität der synthetischen RNAs wurde durch Ausführen von Aliquots der zwei Transkriptionsreaktionsgemische auf einem 0,6% igen Agarosegel zusammen mit einer Referenz 1 kb DNA-Leiter (5B) dargestellt ist. In diesem einfachen Test, der Haupt prominenten RNA band stets nur migriert unterhalb der 3 kb Referenz DNA-Bande und erschien scharf sein. Allerdings verschlechtert RNA würde eine verschmierte Aussehen auf dem gleichen Gel müssen.

Eine Infektionszentrum Assay ist der Goldstandard für die Bestimmung der spezifischen Infektiosität der synthetischen RNAs. Dieser Assay wurde durch Elektroporation von BHK-21-Zellen, die mit RNA-Proben, die Beimpfung gleiche Aliquots der 10-fach seriell verdünnt elektroporierten Zellen in 6-Well-Platten, die naive BHK-21-Zellen (3 × ¹⁰ 5 Zellen / Well), und Überlagern Agarose getan auf die Zellmonoschichten. Nach einer Inkubationszeit von 4 Tagen wurden die überlebenden Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit einer Kristallviolett gebeiztolution um die Anzahl der Infektionszentren (Plaques), die die Anzahl der in den Zellen (6A) geliefert infektiöse RNA-Moleküle entspricht quantifizieren. Da die cDNA-Matrize für die in vitro Transkription eingesetzt wurde, erwiesen sich als nicht-infektiös wurde ²⁷ ein Aliquot der Transkriptionsreaktionsmischung direkt für die Elektroporation verwendet. Elektroporation ist die bevorzugte Methode zur RNA-Transfektion; alternativ kann RNAs durch andere Verfahren unter Verwendung von DEAE-Dextran und kationischen Liposomen transfiziert werden. RNA Elektroporation ist sehr effektiv, aber "Lichtbogenbildung" des elektrischen Impulses tritt selten, wenn Salze in der Reaktions Elektroporation oder die Elektroporationsküvette wiederverwendet vorliegen. Die Expression von viralen Proteinen in RNA-transfizierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Anti-NS1 Kaninchen-Antiserum (6B) untersucht. Die Produktion von Viruspartikeln in den Überständen von RNA-transfizierten Zellen akkumuliert wardurch Plaque-Assays (6C) sierten. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen deutlich, dass die cDNA-abgeleitete synthetische RNAs sind infektiös in permissiven BHK-21-Zellen, wodurch eine hohe Titer von rekombinanten Viren.

Oligonukleotid	Sequenz A (5 'nach 3')	Position b	Polarität
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisense-
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	Sinn
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisense-
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	Ameiseich spüre
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Sinn
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisense-
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisense-
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Sinn
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisense-
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10.952-10.977	Antisense-
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Sinn
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10.956-10.977	Antisense-
SP6F	cataccccgcgtattcccac ta		Sinn
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	Antisense-
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	Sinn
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisense-
X1f	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Sinn
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisense-
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Sinn
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisense-
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10670-10694	Sinn
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10.954-10.977	Antisense-
ein JEV-Sequenzen werden in Großbuchstaben angezeigt, und BAC-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben. b Nukleotid-Position bezieht sich auf die komplette Genomsequenz von JEV SA 14 -14-2 (Genbank-Zugangsnummer JN604986).

Tabelle 1: Oligonukleotide, die für die cDNA-Synthese, PCR-Amplifikation und BAC-Mutagenese verwendet.

Abbildung 1.0; Strategie für die Konstruktion einer cDNA voller Länge von JEV SA ₁₄ -14-2 als BAC (A) Isolierung von viraler RNA aus JEV Teilchen.. Gezeigt ist eine schematische Darstellung der genomischen RNA des JEV SA ₁₄ -14-2. (B) Synthese von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4), die den gesamten Virusgenom. (C) Subklonierung von vier überlappenden cDNA-Fragmente in einen BAC-Vektor, die Schaffung pBAC / F1 bis pBAC / F4. (D) Änderung der geklonten cDNAs für Run-off-Transkription in vitro. pBAC / F1 ^SP6 ist ein Derivat von pBAC / F1, der die SP6-Promotorsequenz stromaufwärts des viralen 5'-Ende enthält. pBAC / F3 ^KO ist ein Derivat der pBAC / F3, die eine stille Punktmutation (A ⁹¹³⁴ → T, Sternchen) enthält. pBAC / F4 ^RO ist ein Derivat der pBAC / F4, die eine künstliche Xba I run-off-Stelle stromabwärts der viralen 3'-Ende enthält. (E strong>) Montage eines in voller Länge SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Synthese von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4) überspannt den in voller Länge genomischen RNA des JEV SA ₁₄ -14-2. Die vier RT-PCR-Produkte werden durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarosegel bewertet. M, 1 kb DNA-Leiter. Die erwarteten Größen der vier cDNA-Fragmente werden am unteren Rand des Gels Bild angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Die Reinigung des BAC, das eine cDNA voller Länge des JEV SA ₁₄ -14-2. Die BAC-Plasmid von E. isoliert coli DH10B durch die SDS-Alkali-Lyse-Verfahren und durch Streifenbildung in einem CsCl-EtBr-Gradienten gereinigt. Präsentiert wird, ist ein Beispiel für die CsCl-Gradienten EtBr mit einem 16 × 76 mm verschließbaren Polypropylenröhrchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Überblick über die Rückgewinnung von infektiösen Viren aus einem in voller Länge JEV SA ₁₄ -14-2 cDNA in einer BAC zusammengestellt. (A) Die Linearisierung der cDNA-Matrize. Die in voller Länge JEV BAC mit geschnittenXbaI und mit MBN behandelt. (B) Synthese der RNA-Transkripte. Das linearisierte cDNA durch SP6-RNA-Polymerase in Gegenwart der ^m 7 G (5 ') ppp (5') eine Kappe analogen transkribiert. (C) Die Gewinnung des synthetischen JEVs. Die in vitro transkribierte RNAs werden in BHK-21-Zellen durch Elektroporation, die einen hohen Titer von synthetischen Virus erzeugt transfiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5. Synthese der RNAs durch in vitro Transkription unter Verwendung einer Volllängen-JEV BAC als cDNA-Templat. (A) Herstellung des linearisierten Volllängen JEV BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2. Zwei unabhängige Klone von pBAC/ SA ₁₄ -14-2 (Cl.1 und Cl.2) durch Verdau mit XbaI und anschließende Behandlung mit MBN linearisiert. Die linearisierten BACs werden durch Elektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel untersucht. (B) Herstellung der synthetischen RNAs durch Run-off-Transkription. Jeder der beiden linearisierte BACs wird als Matrize für die SP6-RNA-Polymerase-Run-off-Transkription eingesetzt. Aliquots der beiden Transkriptionsreaktionen werden auf einem 0,6% Agarosegel laufen gelassen. M, 1 kb DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6. spezifische Infektiosität der synthetischen RNAs, die von einer Volllängen-JEV BAC und die Gewinnung synthetischer virus transkribiert. BHK-21-Zellen mock-elektroporiert (Mock), oder durch Elektroporation mit den RNA-Transkripten hergeleitet sind from jede der beiden unabhängigen Klonen von voller Länge JEV BAC (Cl.1 und Cl.2). (A) RNA-Infektiosität. Die Zellen werden mit Agarose überschichtet und mit Kristallviolett gefärbt bei 4 Tage nach der Transfektion. RNA-Infektiosität durch infectious center Tests bestimmt, um die Menge der infektiösen RNA in die Zellen (links) elektroporiert abzuschätzen. Auch sind repräsentative Bilder von Infektionszentren dargestellt (rechtes Bild). (B) Proteinexpression. Die Zellen sind in 4-Well-Kammerobjektträgern kultiviert. Virale Proteinexpression in RNA-elektroporierten Zellen bei 20 Stunden nach der Transfektion (hpt) durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines primären anti-NS1 Kaninchen-Antiserum und einer Sekundär Cy3-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (rot) analysiert. Die Kerne werden mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (blau) gegengefärbt. Die Immunfluoreszenz-Bilder werden auf ihre entsprechenden Differentialinterferenzkontrastbilder überlagert. (C) Virus-Ausbeute. Die Zellen werden in 1 kultiviert50 mm Kulturschalen. Die Produktion von infektiösen Virionen in den Kulturüberständen von RNA-elektroporierten Zellen bei 22 und 40 hpt sammelt wird durch Plaque-Assays untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Das aktuelle Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Volllängen-infektiöse cDNA-Klone für zwei verschiedene Stämme (CNU / LP2 ^{27 und} SA ₁₄ -14-2 ^{28) des} JEV, einem Flavivirus, deren funktionelle cDNA hat sich als von Natur aus schwierig zu konstruieren und zu erzeugen, ausbreiten, weil Wirtszelltoxizität und die genetische Instabilität der klonierten cDNA ^8,74-76 Dieses Protokoll besteht aus drei Hauptkomponenten:. erste und maximiert die Synthese / Amplifikation einer cDNA getreue Kopie der viralen RNA unter Verwendung von High-Fidelity-Reverse Transkriptase / DNA-Polymerase; Zweitens Klonieren des viralen prM-E kodierenden Region mit toxischen Sequenzen (unveröffentlichte Daten) ^74,77,78 in sehr geringer Kopienzahlvektor BAC von der anfänglichen cDNA Subklonieren der endgültigen cDNA mit voller Länge Montageschritte; und drittens, die Verwendung eines Klonierungsvektors BAC, die eine Fremd-DNA mit einer durchschnittlichen Größe von 120-350 kb, ^19-21, die offensichtlich toleriert größere DNA inse aufnehmen kannrts als andere Klonierungsvektoren. Diese Klonierungsansatz im allgemeinen auf viele andere Positiv-Strang-RNA-Viren, insbesondere solchen mit einem großen RNA-Genom von ca. 10 bis 32 kb. Erzeugung eines infektiösen cDNA-Klon ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung einer reversen Genetik System für RNA-Viren, insbesondere bei Positiv-Strang-RNA-Viren, da das Genom wirkt als virale mRNA, die von Wirtszellen Ribosomen in Proteine ​​übersetzt wird. Somit kann die virale Replikation durch die Einführung einer cDNA-abgeleitete Genomlänge RNA-Moleküls in einer empfänglichen Wirtszelle eingeleitet werden. Die Verfügbarkeit eines infektiösen JEV cDNA-Klon, wenn sie mit rekombinanter DNA-Technologie kombiniert wird, hat das Verständnis der verschiedenen Aspekte der Lebenszyklus des Virus auf molekularer Ebene wie Genexpression ^73,79 und die Genomreplikation ^63,64 erhöht. Außerdem ist ein Volllängen-JEV cDNA-Klon hat sich als ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung von antiviralen Impfstoffen ^{28 und} Genübertragungsvektoren können. ^80,81

Wie bei allen Positivstrang-RNA-Viren gibt es mehrere wichtige Schritte bei der Konstruktion eines zuverlässigen Funktions cDNA für JEV, aus dem hochinfektiösen RNAs können in vitro synthetisiert werden. Idealerweise sollte die Sequenz der synthetischen RNAs aus einem Klon der Volllängen-cDNA transkribiert identisch sein zu derjenigen der genomischen Virus-RNA, insbesondere die 5'- und 3'-terminalen Sequenzen, die für die Initiation der viralen RNA-Replikation erforderlich sind, . ^60-62 In der aktuellen Protokolls der authentische 5'-und 3'-Enden wurden durch Anordnen der SP6-Promotorsequenz stromaufwärts des ersten Adeninnucleotid des viralen Genoms und Positionieren einer einzigartigen künstlichen Xba I-Restriktionsstelle stromabwärts des letzten sichergestellt Thymin Nukleotid des viralen Genoms sind. Capped synthetischen RNAs mit der authentischen 5 'und 3'-Enden wurden durch Run-off-Transkription einer Xba I-linearisiert und MBN behandelten cDNA te hergestelltmplate mit SP6 RNA-Polymerase mit der ^m 7 G (5 ') ppp grundiert (5') eine Kappe analog. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Für in vitro-Transkription, eine andere Bakteriophagen-RNA-Polymerase (zB T3 oder T7) kann in Verbindung mit seinen gut definierten Promotor-Sequenz ^{27 als} Run-off-Website verwendet werden. Kann eine andere Restriktionsstelle verwendet werden, wenn es nicht vorhanden sein, das virale Genom und wenn synthetische RNA aus dem linearisierten cDNA-Enden mit dem authentischen 3'-Ende. Die Wichtigkeit des 3'- Ende Nukleotidsequenz wurde durch einen ca. 10-fachen Verringerung der Infektiosität RNA nachgewiesen, wenn eine synthetische RNA enthält drei oder vier virus unabhängigen Nukleotide an seinem 3'-Ende. ²⁷ in einem in vitro-Transkriptions-Reaktion, sowohl die ^m 7 G (5 ') ppp (5') A und ^m 7 G (5 ') ppp (5') G cap Analog kann gleichermaßen verwendet werden, obwohl die letzteren Orte eine unabhängige zusätzliche G-Nukleotid stromaufwärts des viralen 5 '-Ende, aber dasZusatz nicht die Infektiosität oder Replikation von synthetischer RNA verändern. ²⁷ ist darüber hinaus nicht für die RNA-Infektiosität Prüfungen erforderlich Entfernen der cDNA-Matrize aus dem RNA-Transkripte durch DNase I-Verdau, da der cDNA-Matrize selbst ist nicht infektiös. ²⁷

Die BAC-Technologie wurde nun auf den Bau infektiösen cDNA-Klone für eine Handvoll Positiv-Strang-RNA-Viren, nämlich zwei JEVs, CNU / LP2 ^{27 und} SA ₁₄ -14-2 ²⁸ (Genomgröße, ~ 11 kb) zugrunde gelegt wurden; zwei Dengue-Viren, BR / 90 ^{26 und} NGC ²⁹ (~ 11 kb); das Virus der bovinen Virusdiarrhoe, SD1 (~ 12 kb); ²⁵ zwei KSP-Viren, C und Paderborn (~ 12 kb); ²⁴ die Grenze Euche-Virus, Gifhorn (~ 12 kb); ²⁴ das PRRS-Virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); ³⁰ die Transmissible Gastroenteritis Virus PUR46-MAD (~ 29 kb); ¹⁶ die Feline Infektiöse Peritonitis-Virus,DF-2 (~ 29 kb); ³² das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus, Urbani (~ 30 kb); ⁹ der MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb); ^{17 und der} menschlichen Coronavirus, OC43 (~ 31 kb) ^31. Der Hauptvorteil der Verwendung BACs für die cDNA-Konstruktion ist der hohe genetische Stabilität der großen, 1- oder 2-copy BAC-Plasmide. jedoch ist die intrinsische Natur ihrer extrem niedrigen Kopienzahl auch ein großer Nachteil, wegen der sehr geringen Ausbeuten von BAC-DNA und der daraus folgenden Verringerung der Reinheit der BAC-DNA in Bezug auf die chromosomale DNA beherbergen. Im aktuellen Protokoll wird die Ausbeute von BAC-DNA durch wachsende E. maximiert coli DH10B transformiert mit dem infektiösen BAC pBAC / SA ₁₄ -14-2 in einem nährstoffreichen Medium, 2xYT. Trotz dieser Bemühungen ist das mittlere Ausbeute nur ~ 15 ug BAC-DNA aus 500 ml 2 × YT-Brühe. Auch ist die Reinheit des BAC-DNA am besten mit CsCl-EtBr-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung erreichtAnstelle des üblicherweise verwendeten spaltenbasierten Plasmidisolierung. Allerdings ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass die BAC-transformierten E. coli sollte nicht überwuchern, denn es könnte die genetische Stabilität des geklonten cDNA zu gefährden, und ein höheres Wachstum nicht zwangsläufig zu größeren Ausbeuten oder höhere Reinheit BAC DNA führen.

Das hier beschriebene Protokoll ist eine optimierte, effiziente und gestraffte Verfahren für den Bau und die Ausbreitung eines genetisch stabil voller Länge infektiösen cDNA-Klon als BAC für JEV, ein Verfahren einmal dachte, praktisch unmöglich. Diese gleichen Klonierungsstrategie kann auch auf viele andere Positiv-Strang-RNA-Viren angewendet werden. Im allgemeinen infektiöse cDNA-Klone ermöglichen es uns, eine Vielzahl von Mutationen (zB Deletionen, Insertionen und Punktmutationen) zu einer viralen RNA-Genom einzuführen, um ihre biologischen Funktionen in die virale Replikation und Pathogenese studieren. Diese cDNA-basierte reversen Genetik-System macht es möglich, zu entwickeln und zu test-Impfstoff und therapeutischen Kandidaten gezielt ein Virulenzfaktor (n) eines bestimmten Positiv-Strang-RNA-Virus von Interesse. Darüber hinaus kann diese infektiösen cDNA-Technologie auch als ein viraler Vektor, der fähig ist, ein fremdes Gen (en) von Interesse exprimieren, für viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1. Molecular Cloning
2xYT Bouillon	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radioaktiv
50 ml Tube	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
250 ml Flasche	Beckman Coulter	356011
Agarose	Lonza	50004
Agarose (niedriger Schmelzpunkt)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	Neu England BioLabs	R0575S
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Cäsiumchlorid	Fisher Scientific	BP1595-1
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	krebserregend
DE-81 Filterpapier	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP-Mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E7637	Giftige und hochgradig mutagene
Filtersäule (Plasmid Maxiprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Eisessigsäure	Sigma-Aldrich	A6283	Reizende
Glukose	Sigma-Aldrich	G5400
Glykogen	Roche	10901393001
High-Fidelity DNA-Polymerase	New England BioLabs	M0491S
Isoamylalkohol	Sigma-Aldrich	I9392	Entzündliches
Isopropanol	Amresco	0918	Entflammbare
LB-Bouillon	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
Lithiumchlorid	Sigma-Aldrich	L9650
Lysozym	Amresco	0663
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Reverse Transkriptase	Life Technologies (Invitrogen)	18080-044
Mungobohnen-Nuklease	New England BioLabs	M0250S
Nadel (18G, 20G)	BD	305196, 305175	biologisch gefährlich (scharfe Abfälle)
NotI	New England BioLabs	R0189S Oligonukleotid
	Integrierte DNA-Technologien	Kundenspezifische Oligonukleotidsynthese
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Phenol (puffergesättigt)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Giftiges und stark ätzendes
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol	Life Technologies (Invitrogen)	15593-031	Giftiges und stark ätzendes
Phenol:Guanidin-Isothiocyanat	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Giftiges, ätzendes und reizendes
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Kaliumacetat	Amresco	0698
RNase-Inhibitor	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP-Set	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
Verschließbares Polypropylen-Rohr (16 x 76 mm) & nbsp;	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889
Natriumdodecylsulfat	Amresco	0227
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 RNA-Polymerase	New England BioLabs	M0207S
Spin Säule (Plasmid Miniprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
Spritze	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (Hefe)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Name	Company	Katalognummer<	strong>Comments
2. Zellkultur
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Konisches Röhrchen (50 mL)	VWR	21008-242
Kristallviolett	Sigma-Aldrich	C0775
Kulturschale (150 mm)	TPP	93150
Küvette (2 mm Abstand)	Harvard Apparatur	450125
Fötales Rinderserum	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635	Giftiges und krebserregendes
Glutamin	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P3911
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P9791
Sechs-Well-Platte	TPP	92006
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S3014
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsin-EDTA (0,25%)	Life Technologies ( Gibco)	25200-056
Vitamine	Sigma-Aldrich	M6895
Name	Company	Katalognummer<	strong>Comments
3. Ausrüstung
Agarose Gel-Elektrophorese-System	Mupid	MPDEXU-01
CO2 Inkubator	Thermo Scientific	Heracell 150i
Desktop-Zentrifuge	Thermo Scientific	ST16R
Elektroporator	Harvard Gerät	ECM 830
Langwellen-UV-Lampen (Handheld)	UVP	UVGL-58
Tischzentrifuge	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Life Technologies (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Scientific Industries	G-560
Wasserbad	Jeio Tech	WB-10E