Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Summary

Zell-zu-Zell-Transfer von Proteinaggregaten oder proteopathischen Seeds könnte dem Fortschreiten der Pathologie bei neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen. In dieser Arbeit wird ein neuartiger FRET-Durchflusszytometrie-Assay beschrieben, der einen spezifischen und sensitiven Nachweis der Seeding-Aktivität aus rekombinanten oder biologischen Proben ermöglicht.

Abstract

Immer mehr Beweise unterstützen die transzelluläre Vermehrung von toxischen Proteinaggregaten oder proteopathischen Seeds als Mechanismus für die Initiierung und das Fortschreiten der Pathologie bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit und den damit verbundenen Tauopathien. Die potenziell entscheidende Rolle von Tau-Samen bei der Krankheitsprogression spricht für die Notwendigkeit eines sensitiven Assays, der die Aussaataktivität in biologischen Proben leicht nachweisen kann.

Durch die Kombination der Spezifität des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET), der Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie und der Stabilität einer monoklonalen Zelllinie wurde ein hochempfindlicher Seeding-Assay entwickelt, der mit der Keimdetektion von rekombinanten oder biologischen Proben, einschließlich Homogenaten des menschlichen und des Mausgehirns, kompatibel ist. Der Assay verwendet monoklonale HEK 293T-Zellen, die die aggregationsanfällige Wiederholungsdomäne (RD) von Tau stabil exprimieren, die die krankheitsassoziierte P301S-Mutation beherbergt, die entweder mit CFP oder YFP fusioniert ist und bei der Proteinaggregation ein FRET-Signal erzeugt. Die Aufnahme von proteopathischen Tau-Seeds (aber nicht von anderen Proteinen) in die Biosensorzellen stimuliert die Aggregation von RD-CFP und RD-YFP, und die Durchflusszytometrie überwacht diese aggregationsinduzierte FRET sensitiv und quantitativ. Der Assay detektiert femtomare Konzentrationen (Monomeräquivalent) von rekombinanten Tau-Samen, hat einen dynamischen Bereich von drei Größenordnungen und ist kompatibel mit Gehirnhomogenaten von Tauopathie-transgenen Mäusen und menschlichen Tauopathie-Probanden. Mit leichten Modifikationen kann der Assay auch die Seeding-Aktivität anderer proteopathischer Seeds, wie z. B. α-Synuclein, nachweisen und ist auch mit primären neuronalen Kulturen kompatibel. Die Leichtigkeit, Sensitivität und breite Anwendbarkeit der FRET-Durchflusszytometrie macht sie nützlich, um ein breites Spektrum von Proteinaggregationsstörungen zu untersuchen.

Introduction

Die intrazelluläre Akkumulation von tau Amyloide definiert Tauopathien, wie Alzheimer-Krankheit. In frühen Krankheitsstadien, wird Pathologie allgemein auf diskreten Bereichen des Gehirns lokalisiert ist, aber mit Fortschreiten der Krankheit, Pathologie sind immer an unterschiedliche neuronale Netzwerke ^1-5 ausbreitet. Mehr deutet darauf hin transzellulären Ausbreitung toxischer Proteinaggregaten zugrunde liegt diese Pathologie (in ^6-10 prüft). In diesem Modell werden proteopathic Samen (zB tau) von Spenderzellen freigesetzt und geben Nachbarzellen, die Umwandlung nativen Tau-Protein in die fehlgefalteten Form über templated Konformationsänderung ^11-15. Der hier beschriebene Assay wurde entwickelt, um solche Aussaat Aktivität empfindlich detektieren. Es ist mit einem rekombinanten Protein und biologischen Proben kompatibel und ermöglicht die Quantifizierung von Minute Ebenen proteopathic Aussaat Aktivität ^16.

HEK 293T-Zellen, die stabil exprimieren tau repeat domain (RD), das die krankheitsassoziierte Mutation P301S entweder GFP oder YFP fusioniert (nachstehend tau-RD-CFP / YFP-Zellen bezeichnet) dienen als stabile Biosensor seeding Aktivität. In Abwesenheit von proteopathic Samen, die Zellen aufrechtzuerhalten tau als lösliches Monomer und keinen nennenswerten Hintergrund FRET. Spontane Aufnahme oder die Liposomen-vermittelte Transduktion tau Samen in Zellen resultiert jedoch in RD-CFP und YFP RD-Aggregation, die eine FRET-Signals, die innerhalb einzelner Zellen über Durchflusszytometrie gemessen wird erzeugt.

Zahlreiche Komponenten dieses Tests wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und verringern die Variabilität. Ein monoklonaler Zelllinie mit einem 1: RD-CFP / YFP Expressionsverhältnis 1 wurde ausgewählt, da sie eine optimale Signal: Lärm. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit, sind Phospholipide verwendet werden, um Samen einzuführen direkt in Zellen (wenn auch in biologischen Mechanismen der Aufnahme zu studieren, kann diese weggelassen werden). Schließlich Durchflusszytometrie Monitoren FRET auf Bevölkerungsebene und einer einzelnen Zelle Ebene, im Gegensatz zu anderen Proteinaggregation Assays. Das endgültige Ergebnis zu messen, integrierte FRET Dichte ist hoch quantitative und gehen sowohl die Zahl der Zellen mit Aggregation und dem Grad der Aggregation innerhalb jeder Zelle aufgetreten. Alle diese optimierten Parameter zu verbessern Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Dieses System wurde vor kurzem in einer umfassenden Studie an transgenen Mäusen P301S Tauopathie ^17, die die zeitliche Entstehung und Progression von Tau-Seeding-Aktivität im Vergleich zu anderen gängigen tau pathologischen Markern (zB MC1, AT8, PG5 und Thioflavinen) bewertet beschäftigt. Seeding-Aktivität ist bei weitem der frühesten und robusten Marker der tau-Pathologie bewertet vorhergehenden histologischen Nachweis von mindestens 6 Wochen. Seeding Aktivität scheint bei 1,5 Monaten steigt progressiv mit dem Alter zu, was auf eine kausale Rolle der proteopathic Samen bei der Entstehung und / oder Progression der Neurodegeneration ^16.

e_content "> Genaue Quantifizierung von Minuten Levels von Saatgut aus biologischen Proben können Studien, die Anfang der Krankheitsfortschritt überwachen zu erleichtern. Durch die Verkürzung Studiendauer und ermöglicht Verwendung von jüngeren Tieren, könnte dies die Effizienz und Genauigkeit der präklinischen Tierversuchen zu erhöhen. Zum Beispiel in das P301S Maus zuvor beschrieben, konnten Leitstrukturen so früh wie 4-6 Wochen geliefert werden (unmittelbar vor oder am Beginn der Aussaat Aktivität) und zur Wirksamkeit von 2-4 Wochen beobachtet. Die Bestimmung ist genau keine Verringerungen der Aussaat zu quantifizieren Aktivität. FRET Durchflusszytometrie wurde in vitro Screening-Anwendungen. Zum Beispiel können anti-tau-Reagenzien (zB Antikörper, von kleinen Molekülen etc.) schnell auf ihre Fähigkeit Impfen Induktion direkt in Kultur unter Verwendung von entweder rekombinanter tau zu Block prüfenden Aggregate oder Gehirn stamm Lysaten als Keimquelle (Abbildung 5). Mit diesem Setup einmal Keimmaterial hergestellt wird, eine Ex-Experiment dauert nur drei Tage, um abzuschließen, einschließlich der Datenanalyse. Die schnelle Quantifizierung von proteopathic Aussaat Aktivität kann somit zu erleichtern viele Studien der Neurodegeneration.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll betont die Verwendung von FRET Durchflusszytometrie zur Erfassung Seeding-Aktivität von Maus-biologischen Proben. Es ist auch mit rekombinanten Fibrillen und menschlichen biologischen Proben kompatibel. Maus Euthanasie und Gehirn der Ernte wurde in Übereinstimmung mit IACUC genehmigten Verfahren durchgeführt.

1. Gehirn Extraction

1. Nach tiefe Betäubung mit Isofluran (2%), durchströmen eine Maus mit eiskaltem PBS, die 0,03% Heparin, und extrahieren Sie die Gehirn nach den in Gage et al Details. ¹⁸
2. Zeigen extrahierten Gewebe in einem Kryo-Fläschchen, und Snap freeze indem in flüssigem Stickstoff. Alternativ einfrieren Gewebe auf Trockeneis. Wenn sie gefroren ist, übertragen Gewebe auf -80 ° C und Speicherung für eine längere Zeitspanne, falls erforderlich.
   Hinweis: Dieses Protokoll ist mit ganzen Hirnhomogenaten oder Mikro seziert Hirnregionen kompatibel. Siehe Hagihara et al. Für eine detaillierte Mikrodissektion Protokoll ^19.

2. Herstellung von Biological Impfmaterial

1. Bereiten Homogenisierungspuffer durch Auflösen von Protease-Inhibitoren (EDTA frei) in 1x TBS (1 Tablette pro 10 ml). Vortex kräftig, und speichern Sie auf dem Eis. Protease-Inhibitoren muss EDTA kostenlos um Biosensor Zelllebensfähigkeit zu bewahren.
2. Wiegen gefrorenen Hirngewebe in einer Wegwerf wiegen Boot, und in ein 5 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen eiskaltem Homogenisierungspuffer so daß die endgültige Lösung 10% Gewicht / Volumen. Temporäre Speicherung auf Eis. Gewebemasse und anschließende Homogenisation Puffervolumen wird in Abhängigkeit von der Größe des Gehirns und / oder Regionen variieren. Hier wird ein erwachsener Mäuse mit einem Gewicht von 0,2 g hemibrain in 2 ml einer 10% w / vol Lösung suspendiert.
3. Transfer von Proben in einem kalten Raum, und stellen Sie eine Ultraschallsonde, um den entsprechenden Einstellungen. Für Sondenbeschallung mit einem Omni Ruptor (hier abgebildet) stellen Sie den Haupt zu 20%, was etwa 75 W. Verwenden Sie eine Impuls-Modus entspricht, um sicherzustellen, Proben nicht ovwährend der Beschallung er-erhitzt. Stellen Sie den Impulsgeber zu 30%, entsprechend ca. 500 msec.
4. Reinigen Sie die Spitze der Ultraschallsonde durch Spülen mit Wasser, Isopropanol und Wasser wieder, Abwischen der Sonde zwischen jeder Lösung. Achten Sie darauf, spülen Sie und wischen Sie sowohl die Seiten und der Boden der Sonde mit Lab-Wischtücher.
5. Arbeiten mit einer Probe zu einer Zeit, tauchen Sie die Sondenspitze in die Homogenisierungspuffer, und starten Sie das Ultraschallgerät. Verwendung der oben beschriebenen Kraft und Impulsgeber Einstellungen liefern insgesamt 25 Impulse. Stellen Sie sicher, dass Gewebe ist völlig in der Schwebe. Seien Sie vorsichtig, um das Schäumen der Probe in diesem Schritt zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Proben sind anfällig für schäumende, wenn a) die Gesamtlautstärke ist gering, oder b) das Homogenat erwärmt. Mit dieser spezifischen Instruments, nicht mit einem Volumen von weniger als 250 & mgr; l zu beschallen. Um sicherzustellen, Proben bleiben gekühlt, können Röhrchen auf Eis bei diesem Schritt gespeichert werden.
6. Reinigen Sie die Sonde durch Wischen entfernt restliche Lysat, liefern dann 10 Impulse in einen Becher of sauberes Wasser. Die Seiten und der Boden der Sonde mit Wasser, Isopropanol und Wasser wieder ausspülen (wie in Schritt 2.4), Wisch Trocknen zwischen jedem Schritt. Um Verunreinigungen zu vermeiden, spülen Sie die Sonde in zwischen den Proben.
   HINWEIS: Tau-Aggregaten, haben wir gefunden, daß strengere Reinigungsverfahren zur Verhinderung von Probe zu Probe Kontamination erforderlich sind. Andere Amyloide können jedoch zusätzliche Pflege, die wurde ausgiebig in der Literatur beschrieben ^20,21 erforderlich.
7. Speicher Homogenate auf Eis, bis alle Proben verarbeitet worden sind.
8. Spin Homogenate bei 21.300 · g für 15 min bei 4 ° C.
9. Den Überstand in einem sauberen Rohr, kümmert sich nicht um das Pellet zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. Aliquots des Überstands und Speichern Lysate bei -80ºC zur weiteren Verwendung. Vermeiden Einfrieren / Auftauen der Homogenate jedoch, wie dies reduziert Impfeffizienz.

3. Replattierung Biosensor-Zellen

HINWEIS:Verwenden Sie vier Zelllinien für diesen Test: HEK 293T (Zelllinie # 1), RD-P301S-CFP (Zelllinie # 2), RD-P301S-YFP (Zelllinie # 3) und RD-P301S-CFP / YFP ( Zelllinie # 4). Beziehen Sie sich auf Tabelle 1 für die Beiträge der einzelnen Zelllinie auf den Test.

1. In einer sterilen Umgebung ansaugen Kulturmedium. Spülen Sie Zellen mit warmem PBS und absaugen. Trypsinize Zellen (3 ml Trypsin-EDTA (0,05%)) für 3 min, gequenscht mit warmem Kulturmedium (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% Pen / Strep, 1% Glutamax), und Zellen, die unverzüglich in einen konischen Rohr.
2. Zentrifuge Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei RT. Saugen Sie Medium, und resuspendieren Zellpellet in warmem Kulturmedium.
3. Verwendung eines Hämocytometer, bestimmen die Zelldichte für jede Zelllinie. Zelldichte in Abhängigkeit von Konfluenz zum Zeitpunkt der Ernte und Resuspensionsvolumen variieren. Die Zellen aus einer 10-cm-Schale mit 90% Konfluenz in 10 ml Medium geerntet, zur Zelldichte etwa 1 Millionen Zellen / ml liegen.
4. Machenein Master-Mix aus Zellen + Medium derart, dass jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen werden jeweils 35.000 Zellen in 130 ul Medium enthalten (beispielsweise um einen Master-Mix für 100 Vertiefungen bilden, Resuspendieren 3,5 Millionen Zellen in 13 ml Medium). Ändern Sie die Zellzahl auf einzelne Versuchspläne und Zeitpläne passen. Für Zellbehandlung ~ 18 Stunden nach dem Plattieren hinzufügen 35.000 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
5. Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette langsam pipettieren 130 ul des Master-Mix Zellsuspension in jede Vertiefung einer flachen Boden, Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte. Während Plattierung, legen Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Brunnens, den Boden der Platte berührt.
   Hinweis: Obwohl Plattieren Format kann geändert werden, so dass n = 4 Vertiefungen für jede der Zelllinien 1-3 pro Platte empfohlen. Der Rest der Platte (n = 84) für die Zelllinie # 4 (Biosensor-Zellen) vorbehalten.
6. Lassen Sie die Zellen, indem man die Platte ungestört für 10 Minuten bei RT zu begleichen. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO _{2 und} &# 8805; 80% relative Luftfeuchtigkeit.

4. Behandlung von Zellen

HINWEIS: Die folgenden Tages, als Tau-Biosensor-Zellen sind 60-65% konfluent, bereiten Samenübertragung Komplexe wie folgt:

1. In einem Rohr, zu verbinden Transfektionsreagenz wie Lipofectamin mit serumreduzierten wie Opti-MEM, um einen Master-Mix zu machen. Pro Loch, fügen 1,25 ul Transfektionsreagenz und 8,75 & mgr; verringert Serum Medien. Flick Rohr sanft zu mischen, kurz spin down, und Inkubation für 5 min bei RT.
2. In einem anderen Rohr, Drill Material (Aliquot des Lysats aus Schritt 2.9) mit reduziertem Serum Medien.
   HINWEIS: Volumen des Impfmaterials wird entsprechend der einzelnen Tests variieren. Bei der Auswahl der Samenvolumen, berücksichtigen: Fülle von Samen in einer Probe und potentielle Toxizität. Crude Homogenate können Zellen toxisch sein. Als solche, die niedrigste Lautstärke möglich, um die gewünschte Wirkung zu überwachen. Zuvor getesteten Mengen an Lysat / well Bereich from 1-5 & mgr; l, das entspricht 5-20 & mgr; g Gesamtprotein. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen pro Vertiefung (Samen + reduzierten Serum Medien) ist 10 & mgr; l.
3. Kombinieren Sie Inhalte aus den beiden in 4.1 und 4.2, Flick beschrieben zum Mischen leicht Rohre, kurz Spin-Down (1000 · g, 5 sec), und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 20 min und bis zu 2 Std.
4. Vorsichtig pipettiert 20 ul Transduktionskomplex auf der Seite der einzelnen Biosensor Vertiefungen. Verwenden Sie drei technische Replikate, wenn möglich. Zurückzukehren behandelten Zellen in den Inkubator für 24-48 Std. Inkubiere unter denselben Bedingungen wie in Schritt 3.6 beschrieben.
   HINWEIS: Die entsprechenden Negativkontrolle Voraussetzung für diese Einstellung ist Biosensor-Zellen mit leeren Liposomen (dh Liposomreagenz + reduzierten Serummedien) behandelt, weil die Anwendung von Phospholipiden führt eine leichte Verschiebung in der Fluoreszenz-Profil in Bezug auf Zellen, um unbelichtete Liposomreagenz Biosensor.

5. Ernte Cells für FRET Durchflusszytometrie

Hinweis: Vor Ernten der Zellen-Regel 24-48 Stunden nach der Behandlung ist es möglich, eine Vorab-Auslesen der Aussaat Aktivität zu erhalten unter Verwendung des GFP-Filter auf einem Standard-invertierten Fluoreszenzmikroskop. Zellen ohne Keimmaterial (dh leere Liposomen) behandelt werden diffuse Fluoreszenz zeigen, wohingegen Zellen, die mit Samenmaterial behandelt werden intensive punktförmige und netzartige intrazelluläre Einschlüsse (1A - B) zeigen.

1. Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette absaugen alle Zellmedium (150 ul),. Trypsinieren (50 ul) Zellen für 5 min und Abschreckflüssigkeit mit 150 ul Kulturmedium gekühlt. Fügen Sie nicht einen PBS spülen, bevor in diesem Schritt Trypsinierung, denn es kann Zell Heben und anschließende Zellverlust führen. Keine verunreinigenden toten Zellen und Trümmer auszuschließen während Durchflusszytometrie über Gating-Strategien.
2. Unmittelbar nach dem Abschrecken, Transferzellen in eine 96-Well-Rundbodenplatte und Zentrifuge bei 1.000 × g für 5 min bei RT.
3. Absaugen und entsorgen Medium, wobei darauf zu achten das Zellpellet zu stören.
4. Sanft, aber gründlich, Zellpellet in 50 ul 2% Paraformaldehyd, und Inkubation für 10 min. Alternativ können Sie Zellen leben, obgleich Fixierung bietet saubere und konsistente Ergebnisse.
5. Zentrifuge Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei RT. Absaugen und entsorgen Paraformaldehyd, wobei darauf zu achten das Zellpellet zu stören.
6. Sanft, aber gründlich, Zellpellet in 200 ul gekühlt Durchflusszytometrie-Puffer (HBSS, 1% FBS 1 mM EDTA) und führen Sie die Platte so schnell wie möglich zu Zelle Verklumpung zu vermeiden.

6. FRET Durchflusszytometrie

HINWEIS: Verwenden Sie ein Durchflusszytometer wie die MACSQuant VYB, die mit FRET-kompatiblen Laserlinien und Filtersätze (Tabelle 2) ausgestattet ist. Für jeden Schritt in diesem Abschnitt, klicken Sie auf die auch von Interesse unter Verwendung der Software 96-Loch-Vorlage, und klicken Sie auf"Play", um Probenaufnahme und Durchfluss beginnen. Machen Grundstücke oder Statistiktabellen, indem Sie auf die "neue Analysefenster" -Symbol. Ändern Achsparameter auf einzelne bivariate Grundstücke, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse und der Auswahl der geeigneten Filter. Um Zellpopulationen oder Fluoreszenzsignale zu verschieben, erhöhen oder verringern die Spannungen mit den entsprechenden Filter zugeordnet ist. Mit diesem Instrument laufen <1.000 Veranstaltungen / sec, um eine genaue Einzelzellenüberwachung zu gewährleisten.

1. Machen Sie ein Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Umgebung (FSC-A) bivariate Grundstück und mit Zelllinie # 1 laufen, passen Sie die SSC und FSC-Spannungen bis die Zellpopulation in der linken unteren Quadranten. Klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug, und definieren die Zellpopulation (Tor P1). Für alle Gating-Parameter siehe Abbildung 2.
2. Machen Sie eine FSC-H (Höhe) vs FSC-A bivariate Grundstück und gelten Tor P1 zu dieser Handlung, indem Sie auf "live" über der Handlung, und die Auswahl P1. Mit Zelllinie # 1läuft, klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug und definieren Einzelzellen (Tor P2).
3. Machen 3 Histogramm Plot, eine für jeden der Filter von Interesse: CFP, YFP und FRET. Bewerben Tor P2, alle diese Grundstücke, indem Sie auf "live" über die Grundstücke und die Auswahl P2. Mit Zelllinie # 1 läuft, stellen Spannungen, so dass die mittlere Zellpopulation in der GFP, YFP, und FRET-Histogramme sind alle zwischen 0 und 1. Zum Messen GFP und FRET, erregt Zellen mit der 405 nm-Laser und Capture-Fluoreszenz mit ein 450/50 nm und 525/50 nm-Filter auf. Um zu messen, YFP, erregt Zellen mit einem 488 nm Laser-und Capture-Fluoreszenz mit einer 525/50-nm-Filter. Laser- und Filtereinstellungen sind ferner in Tabelle 2 beschrieben.
4. Führen Ausgleich für CFP Spillover in die FRET und YFP-Kanälen.
   HINWEIS: Kompensation ist der Prozess der Fluoreszenzstreuung Korrektur. Fluoreszenzstreuung tritt auf, wenn die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom innerhalb eines Filter desi detektiertengned zum Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen. Mit der richtigen Kompensation kann die GFP Spillover-Fluoreszenz der FRET und YFP Kanäle entfernt werden.
   HINWEIS: Kompensation erfordert die Anwesenheit von beiden Fluoreszenz-positiven und -negativen Zellen. Somit an GFP-positiven Zellen zu kompensieren (Zell-Linie # 2), negative Zellen (Zelllinie # 1) auf der Probe vor dem Durchlauf hinzugefügt.
   1. Spike in 30 ul Zelllinie # 1-Suspension aus einer Hand gut in 200 ul Zelllinie # 2 Suspension unmittelbar vor der Kompensation.
   2. Klicken Sie auf das Symbol "Geräteeinstellungen" und dann Registerkarte "Entschädigung", und überprüfen Sie "Matrix", um die Kompensationstabelle zu öffnen.
   3. Machen Sie eine FRET-A vs GFP-A bivariate Handlung, und wenden Sie Gate P2, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Mit Zelllinien 1 + 2 läuft, klicken Sie auf das Symbol "Quadranten" und zeichnen Quadranten, so dass die Fluoreszenz-negative und -positive Populationen werden durch die unteren zwei Quadranten getrennt (Tore LL3 einnd LR3, respectively).
   4. Erstellen Sie eine Statistiktabelle, die die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von FRET für die LL3 und LR3 Gates zeigt. Stellen Sie den Parameter FRET in der Kompensationsmatrix, bis der MFI des FRET-Signals entspricht zwischen LL3 und LR3. Nach diesem Schritt der MFI des FRET-Signals ist gleich zwischen ungefärbten Zellen und GFP-positiven Zellen, was auf die Abwesenheit von GFP Spillover in die FRET-Kanal.
   5. Einen YFP-A vs GFP-A bivariate Handlung, und wenden Sie Gate P2, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Zeichnen Quadranten (LL4 und LR4) ähnlich wie in Schritt 6.4.3 durchgeführt.
   6. Erstellen Sie eine Statistiktabelle, die die MFI von YFP für LL4 und LR4 zeigt. Passen Sie die Parameter-YFP in der Kompensationsmatrix, bis der MFI des YFP-Signal entspricht zwischen LL4 und LR4. Nach diesem Schritt wird die MFI einer YFP-Signal ist gleich zwischen ungefärbten Zellen und GFP-positiven Zellen, was auf die Abwesenheit von GFP Spillover in die YFP-Kanal.
5. Follaufgrund Gate Setup-und Entschädigung, markieren Brunnen von Interesse und führen Sie den Rest der Platte.
6. Nachdem alle Proben, indem Sie auf "Datei" und dann "Kopieren" ausgeführt wurde, Exportdatendateien. Wählen Sie die Registerkarte "Dateien", markieren Sie den Versuch Ordner, und klicken Sie auf "Kopieren".

7. Datenanalyse

HINWEIS: Achsenparameter ändern zu einzelnen bivariate Grundstücke, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse und der Auswahl der geeigneten Filter.

1. FCS offene Dateien in der Durchflusszytometrie-Analyseprogramm.
2. Basierend auf Streueigenschaften, verwenden eine polygonale Gate, um die Zellpopulation (SSC gegen FSC) und Singulett-Bevölkerung (FSC-H vs FSC-A) von Zellen mit leeren Liposomen behandelt ähnlich wie in Abschnitt 6 beschrieben definieren.
3. Wenn CFP Vergütung wurde während der Installation durchgeführt wird, nicht weiter anpassen GFP.
4. Erstellen Sie eine FRET vs YFP bivariate Grundstück. Verwendung von Zelllinie # 3Definieren Sie eine falsche FRET-Gate durch Ziehen einer polygonalen Tor, das entlang der Steigung der FRET-positive Zellpopulation führt. Dieses Tor schließt YFP single-positive Zellen, die ein Signal innerhalb des FRET Filter zu emittieren, und ist ähnlich dem zuvor durch Verbieten et al gezogen. ²²
5. Definieren Sie eine FRET-Gate durch Auftragen leere Liposomen behandelt CFP / YFP-Zellen auf einem FRET vs GFP bivariate Grundstück. Einführung einer polygonalen Gate entlang der Neigung der Bevölkerung, die sich nach oben erstreckt und weg von der Bevölkerung nach links. Dieses Tor sollten die meisten Zellen (~ 99%), schließen, so daß Hintergrund FRET ≥1% der Zellen. Alle Ereignisse, die in diesem Tor verschieben werden als FRET-positiv.
   Hinweis: Jeder einzelnen oben beschriebenen Gate mit allen Proben vor dem Bau nachfolgenden Gates angelegt. Nach der Analyse werden vier einzelne Gates definiert (Zellpopulation; Singulett; falsche FRET; FRET).
6. Nehmen Sie Analyseparameter von Interesse, darunter: Prozent FRET Positivität und MFIFRET-positiven Zellen. Manuell berechnen die integrierte FRET Dichte durch Messung der Produkt von Prozent Positivität und MFI.
   HINWEIS: Wenn integriert FRET Dichte als Endziel, Set Hintergrund FRET und MFI größer oder gleich 1 ist, um die Berechnung eines Produkts, das weniger als die beiden einzelnen Faktoren zu vermeiden (wie in Schritt 7.5 definiert sind) verwendet wird.

Results

FRET Durchflusszytometrie ermöglicht empfindliche, quantitative und schnelle Erkennung von Aussaat Aktivität von rekombinantem oder biologischen Proben. Assay Einrichtung leicht ist: Monoklonaler abgeleitete stabile Zelllinien, die tau-RD-CFP / YFP mit Impfmaterial transduziert, 24-48 h inkubiert und zogen Zytometrieanalyse (1A) fließt. In Abwesenheit von Samen, Biosensorzellen aufrechtzuerhalten tau in einer löslichen, monomeren Form (Abbildung 1B). In Gegenwart der Samen jedoch Biosen...

Discussion

Die hier beschriebene FRET Durchflusszytometrie-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die schnelle und quantitative Beurteilung tau Aussaat Aktivität. Es erfordert nur moderate Zellkulturerfahrung und Grundkenntnisse in FRET und Durchflusszytometrie. Andere Seeding-Assays, wie Thioflavin T - die verstärkte Fluoreszenz zeigt, wenn es um Beta-Faltblatt-Struktur gebunden - sind aufwendig und erfordern ein reines, rekombinantes Protein-Substrat. Zusätzlich kann in vitro Aussaat Assays für tau sind n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBS	Sigma	T5912
cOmplete Protease-Inhibitoren (EDTA-frei)	Roche	4693159001
Kryo-Fläschchen	Sarstedt	72.694.006
Analysenwaage	Mettler Toledo	XSE 105DU
Wägeschiffchen	Fisher Scientific	13-735-743
15 ml konisches Röhrchen	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultraschall-Homogenisator	Omni International	18-000-115
Mikrospitze für Ultraschall-Homogenisator	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
Ohrenschützer mit Geräuschunterdrückung	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes	Fisher Scientific	S47299
1,5 ml Röhrchen	USA Scientific<	a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30071.03
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml konische Röhrchen	Phenix Research	SS-PH15
25 ml Reagenzien-Resevoirs	VWR	41428-954
Mehrkanalpipette	Fisher Scientific	TI13-690-049
96-Well-Platten mit flachem Boden	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96 Well runde Bodenplatten	Corning	3788
16% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie	Sciences RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 Zentrifuge	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner Schwingschaufelrotor	Thermo Scientific	75003796
Hämazytometer	VWR	15170-172
MACSQuant VYB Durchflusszytometer	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Gestell	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo Analysesoftware	Flow Jo
20 μ l Pipettenspitzen	Rainin	GPS-L10
200 μ l Pipettenspitzen	Rainin	GPS-250
1 ml Pipettenspitzen	Rainin	GPS-1000
200 μ l Pipettenspitzen	USA Scientific	1111-1800
5 ml serologische Pipette	Phenix Research	SPG-606180
10 ml serologische Pipette	Phenix Research	SPG-607180
25 ml serologische Pipette	Phenix Research	SPG-760180