Methodenartikel

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

DOI:

10.3791/53205

⸱

8. Dezember 2015

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zell-zu-Zell-Transfer von Proteinaggregaten oder proteopathischen Seeds könnte dem Fortschreiten der Pathologie bei neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen. In dieser Arbeit wird ein neuartiger FRET-Durchflusszytometrie-Assay beschrieben, der einen spezifischen und sensitiven Nachweis der Seeding-Aktivität aus rekombinanten oder biologischen Proben ermöglicht.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immer mehr Beweise unterstützen die transzelluläre Vermehrung von toxischen Proteinaggregaten oder proteopathischen Seeds als Mechanismus für die Initiierung und das Fortschreiten der Pathologie bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit und den damit verbundenen Tauopathien. Die potenziell entscheidende Rolle von Tau-Samen bei der Krankheitsprogression spricht für die Notwendigkeit eines sensitiven Assays, der die Aussaataktivität in biologischen Proben leicht nachweisen kann.

Durch die Kombination der Spezifität des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET), der Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie und der Stabilität einer monoklonalen Zelllinie wurde ein hochempfindlicher Seeding-Assay entwickelt, der mit der Keimdetektion von rekombinanten oder biologischen Proben, einschließlich Homogenaten des menschlichen und des Mausgehirns, kompatibel ist. Der Assay verwendet monoklonale HEK 293T-Zellen, die die aggregationsanfällige Wiederholungsdomäne (RD) von Tau stabil exprimieren, die die krankheitsassoziierte P301S-Mutation beherbergt, die entweder mit CFP oder YFP fusioniert ist und bei der Proteinaggregation ein FRET-Signal erzeugt. Die Aufnahme von proteopathischen Tau-Seeds (aber nicht von anderen Proteinen) in die Biosensorzellen stimuliert die Aggregation von RD-CFP und RD-YFP, und die Durchflusszytometrie überwacht diese aggregationsinduzierte FRET sensitiv und quantitativ. Der Assay detektiert femtomare Konzentrationen (Monomeräquivalent) von rekombinanten Tau-Samen, hat einen dynamischen Bereich von drei Größenordnungen und ist kompatibel mit Gehirnhomogenaten von Tauopathie-transgenen Mäusen und menschlichen Tauopathie-Probanden. Mit leichten Modifikationen kann der Assay auch die Seeding-Aktivität anderer proteopathischer Seeds, wie z. B. α-Synuclein, nachweisen und ist auch mit primären neuronalen Kulturen kompatibel. Die Leichtigkeit, Sensitivität und breite Anwendbarkeit der FRET-Durchflusszytometrie macht sie nützlich, um ein breites Spektrum von Proteinaggregationsstörungen zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die intrazelluläre Akkumulation von tau Amyloide definiert Tauopathien, wie Alzheimer-Krankheit. In frühen Krankheitsstadien, wird Pathologie allgemein auf diskreten Bereichen des Gehirns lokalisiert ist, aber mit Fortschreiten der Krankheit, Pathologie sind immer an unterschiedliche neuronale Netzwerke 1-5 ausbreitet. Mehr deutet darauf hin transzellulären Ausbreitung toxischer Proteinaggregaten zugrunde liegt diese Pathologie (in 6-10 prüft). In diesem Modell werden proteopathic Samen (zB tau) von Spenderzellen freigesetzt und geben Nachbarzellen, die Umwandlung nativen Tau-Protein in die fehlgefalteten Form über templated Konformatio....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hinweis: Dieses Protokoll betont die Verwendung von FRET Durchflusszytometrie zur Erfassung Seeding-Aktivität von Maus-biologischen Proben. Es ist auch mit rekombinanten Fibrillen und menschlichen biologischen Proben kompatibel. Maus Euthanasie und Gehirn der Ernte wurde in Übereinstimmung mit IACUC genehmigten Verfahren durchgeführt.

1. Gehirn Extraction

  1. Nach tiefe Betäubung mit Isofluran (2%), durchströmen eine Maus mit eiskaltem PBS, die 0,03% Heparin, und extrahieren Sie die Gehirn nach den in Gage et al Details. 18
  2. Zeigen extrahierten Gewebe in einem Kryo-Fläschchen, und Snap freeze indem in flüssigem Stickstoff. ....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET Durchflusszytometrie ermöglicht empfindliche, quantitative und schnelle Erkennung von Aussaat Aktivität von rekombinantem oder biologischen Proben. Assay Einrichtung leicht ist: Monoklonaler abgeleitete stabile Zelllinien, die tau-RD-CFP / YFP mit Impfmaterial transduziert, 24-48 h inkubiert und zogen Zytometrieanalyse (1A) fließt. In Abwesenheit von Samen, Biosensorzellen aufrechtzuerhalten tau in einer löslichen, monomeren Form (Abbildung 1B). In Gegenwart der Samen jedoch Biosen.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebene FRET Durchflusszytometrie-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die schnelle und quantitative Beurteilung tau Aussaat Aktivität. Es erfordert nur moderate Zellkulturerfahrung und Grundkenntnisse in FRET und Durchflusszytometrie. Andere Seeding-Assays, wie Thioflavin T - die verstärkte Fluoreszenz zeigt, wenn es um Beta-Faltblatt-Struktur gebunden - sind aufwendig und erfordern ein reines, rekombinantes Protein-Substrat. Zusätzlich kann in vitro Aussaat Assays für tau sind n.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Assay wurde an Janssen Pharmaceuticals lizenziert.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Tau Consortium (M.I.D) unterstützt; National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), ein Grant des Verteidigungsministeriums PT110816 (an M.I.D.), 1F32NS087805 (an J.L.F.) und 1F31NS079039 (an B.B.H.).

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TBSSigmaT5912
cOmplete Protease-Inhibitoren (EDTA-frei)Roche4693159001
Kryo-FläschchenSarstedt72.694.006
AnalysenwaageMettler ToledoXSE 105DU
WägeschiffchenFisher Scientific13-735-743
15 ml konisches RöhrchenUSA Scientific1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultraschall-HomogenisatorOmni International18-000-115
Mikrospitze für Ultraschall-HomogenisatorOmni InternationalOR-T-156
2-PropanolFisher ScientificA451
Ohrenschützer mit GeräuschunterdrückungFisher Scientific19-145-412
KimwipesFisher ScientificS47299
1,5 ml RöhrchenUSA Scientific<a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510
Mikrozentrifuge Eppendorf5424 000.215
DPBSLife Technologies14190-136
DMEMLife Technologies11965-084
Fötales RinderserumHyCloneSH30071.03
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
GlutaMaxLife Technologies35050-061
Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
50 ml konische RöhrchenPhenix ResearchSS-PH15
25 ml Reagenzien-ResevoirsVWR41428-954
MehrkanalpipetteFisher ScientificTI13-690-049
96-Well-Platten mit flachem BodenCorning3603
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
96 Well runde BodenplattenCorning3788
16% ParaformaldehydElektronenmikroskopieSciences RT 15710
PBSSigma-AldrichP5493
EDTASigma-AldrichED2SS
HBSSLife Technologies14185-052
Sorvall ST 40 ZentrifugeThermo Scientific75004509
BIOLiner SchwingschaufelrotorThermo Scientific75003796
HämazytometerVWR15170-172
MACSQuant VYB DurchflusszytometerMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 GestellMiltenyi Biotec130-094-459
Flow Jo AnalysesoftwareFlow Jo
20 μ l PipettenspitzenRaininGPS-L10
200 μ l PipettenspitzenRaininGPS-250
1 ml PipettenspitzenRaininGPS-1000
200 μ l PipettenspitzenUSA Scientific1111-1800
5 ml serologische PipettePhenix ResearchSPG-606180
10 ml serologische PipettePhenix ResearchSPG-607180
25 ml serologische PipettePhenix ResearchSPG-760180

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neu....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Tau AggregationBiosensoren ZellenDurchflusszytometrische AnalyseFluoreszenzkompensationNachweis der Seeding Aktivit trekombinante Tau SeedsGehirnhomogenateHEK 293T Zellen

Verwandte Artikel