Methodenartikel

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

8.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/53211

⸱

23. November 2015

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Biochemistry, Chang Gung University College of Medicine, 3Molecular Medicine Research Center, Chang Gung University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir ein in vitro Kultursystem vor, das effizient pDCs erzeugen kann, indem gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen mit AC-6-Feederzellen in Gegenwart von Flt3-Liganden co-kultiviert werden.

Zusammenfassung

Plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind starke Typ I Interferon (IFN-I) Herstellung von Zellen, die in Reaktion auf eine Infektion oder bei entzündlichen Reaktionen aktiviert werden. Leider wird Studium der PDC-Funktion durch ihre niedrigen Frequenz in lymphatischen Organen behindert, und die bestehenden Verfahren zur in-vitro-DC Generation überwiegend zugunsten der Produktion von cDCs über pDCs. Hier präsentieren wir einen einzigartigen Ansatz, um effizient zu erzeugen pDCs von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) in vitro. Speziell beschriebene Protokolldetails, wie CLPs aus dem Knochenmark zu reinigen und zu erzeugen pDCs kokultiviert mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von Flt3-Liganden. Ein einzigartiges Merkmal dieses Kultursystems ist, dass die CLPs wandern unter den AC-6-Zellen und werden gepflasterten Fläche bildenden Zellen, ein kritischer Schritt zur Erweiterung pDCs. Morphologisch DCs, nämlich pDCs und cDCs wurden mit einer Zusammensetzung aus 7 erzeugte nach ca. 2 Wochen0-90% pDCs unter optimalen Bedingungen. Typischerweise ist die Anzahl der pDCs durch dieses Verfahren erzeugte etwa 100-fachen der Anzahl der CLPs ausgesät. Daher ist dies ein neuartiges System, das eine robuste erzeugen die eine große Zahl von pDCs erforderlich, weitere Untersuchungen über die Entwicklung und Funktion der Zellen zu erleichtern.

Einleitung

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Kontrolle der Immunantwort 1 eine wichtige Rolle spielen. Während DCs sind heterogen, sie können grob in zwei Populationen klassifiziert werden, herkömmliche DCs (cDCs) und plasmazytoiden DCs (pDCs) 2,3. Zusätzlich zu lymphoiden Organen, sind cDCs und pDCs auch in Geweben, einschließlich Lunge, Darm, Haut und 2 gefunden. Die Morphologie cDCs und pDCs unterscheidet, mit cDCs aufweist Dendriten artigen Vorsprünge und die Form pDCs wobei mehrere Plasmazellenartigen. Darüber hinaus wird der gemeinsame Maus DC Marker, CD11c, stärker auf als auf pDCs cDCs ausgedrückt. CDCs und CD11b - - CD24 + cDCs, die beide exprimieren höhere Niveaus von MHC-Klasse II und kostimulatorische Moleküle als dies pDCs 2 kann darüber hinaus weiter in cDCs CD11b + CD24 teilen. Reife pDCs, andererseits hat sich gezeigt, selektiv auszudrücken Siglec-H und BST2 4. Functionally sind cDCs besser Antigen-präsentierenden Zellen sind als pDCs; jedoch können pDCs eine große Menge an Typ I Interferon bei der Virusinfektion oder entzündlichen Stimulation 5 zu produzieren.

Beide cDCs und pDCs sind kurzlebig und müssen deshalb ständig von Vorläufern im Knochenmark (BM) 6,7 nachgefüllt werden. Adoptiven Transfer von gemeinsamen myeloischer Stammzellen (CMPs) und gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) in letal bestrahlten Mäusen zeigt, dass cDCs und pDCs kann von beiden Abstammungslinien 8-10 erzeugt werden. Jedoch gibt es eine Untergruppe von pDCs die RAG1 / 2 ausdrücken und besitzen umge DJ Abschnitte der IgH-Locus 11,12. Diese Zellen teilen auch molekulare Ähnlichkeit mit B-Lymphozyten, einschließlich Ausdruck der B220 Marker, Nukleinsäure-Sensing-Rezeptoren (TLR7 / TLR9) und Transkriptionsfaktoren (SPIB und BCL11A) 13, verfügt über alle geglaubt, um Unterschriften der lymphoiden Linie zu sein. Daher CLPs kann eine gute Wahl für in-vitro-Erzeugung von pDCs wegen der Abstammung Ähnlichkeit zu sein.

Während die Frequenz der beiden cDCs und pDCs bei Mäusen und Menschen ist sehr gering 6 DCs, insbesondere cDCs kann in vitro aus BM oder Vorläuferzellen in der Gegenwart von Cytokinen, wie GM-CSF 11,14 oder Flt3-Liganden erzeugt werden (FL ) unter Verwendung von Feederfreie Systeme 11,15,16. Leider ist es jedoch nicht möglich, eine große Anzahl von pDCs in vitro unter Verwendung von FL 11,15,16 herzustellen. Bisher haben wir gezeigt, dass pDCs effizient in vitro aus CLP mit der AC-6 Speisesystem 17 erzeugt werden. Der Vorteil der Verwendung der AC-6 Stromazelllinie im Kultursystem ist, dass er Zell-Zell-Kontakt und die Sekretion von Cytokinen, die die Erzeugung einer großen Zahl von pDCs von CLPs Unterstützung bietet. Obwohl die Produktion mit diesem System ist sehr robust, ist eine sorgfältige Replikation der Verfahren unten beschrieben erforderlich in, um eine effiziente Erzeugung von pDCs gewährleisten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse wurden von der National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan gekauft. Alle Mäuse wurden gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Protokolle und Tiernutzung Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der National Taiwan University College of Medicine (Permit-Nummer: 20120075) zugelassen. Darüber hinaus machte die Forscher alles tun, um das Potenzial für die Schmerzen, Leiden oder Angst bei den Tieren zu reduzieren, während die Durchführung von Experimenten. Alle beschriebenen Verfahren wurden bei RT mit Handschuhen.

1. Herstellung von AC-6 Feeder-Zellen

Hinweis: Die AC-6.21 (AC-6 in kurzen) Stromazelllinie 18 (von I. Weissman, der Stanford University zur Verfügung gestellt) sollten in RPMI aufrechterhalten werden, ergänzt mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Als Feeder-Zellen dienen, sind AC-6-Zellen γ-bestrahlt mit 3000 rad (30Gy) einen Tag vor der Co-Kultur, um ihre Verbreitung zu verhindern. Hinweis thbei AC-6 Zellen neigen dazu, ihre Differenzierung unterstützende Fähigkeit zu verlieren, wenn bei der Wartung überfüllten verlassen, oder wenn ihre Durchgang Nummer ist über 20.

  1. Wasch AC-6 Zellen einmal mit 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gewaschen und durch Absaugen zu entfernen DPBS. Behandlung von AC-6-Zellen mit 0,8 ml Trypsinlösung (0,05% Trypsin und 0,5 mM EDTA in DPBS) für 3-5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2 und stoppt dann die Reaktion durch mit 10 Volumina Kulturmedium zu verdünnen machen Einzelzellsuspension.
  2. Samen AC-6-Zellen bei 5.9x10 4 Zellen / Well in 12-Well-Platten und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO & sub2; O / N.
    Anmerkung: Die Dichte des AC-6-Zellen ist sehr wichtig, da eine geringere Dichte wird cDC- Erzeugung begünstigen. Aussaat mit einer Dichte von 5.9x10 4 Zellen / Vertiefung ermöglicht AC-6 bis zur Konfluenz am nächsten Tag, die optimal für die Ableitung pDCs von CLPs ist zu erreichen.
  3. Bestrahlen AC-6-Zellen mit 3000 rad (30 Gy) unter Verwendung von γ-Bestrahlungsvorrichtung.
    Notiz: Das zur AC-6 bestrahlen Dosis ist optimiert, um die Zellen aus proliferierenden zu verhindern und dennoch tragfähig zu halten sie lange genug, um die für die Differenzierung der DCs von CLPs erforderlich Zytokine und Zell-Zell-Kontakt.
  4. Saugen Sie Medium und ersetzen mit 1 ml komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 50 ug / ml Gentamycin und 50 uM β-Mercaptoethanol).

2. Isolieren BM Zellen von Mäusen

  1. Opfern Mäuse durch CO 2 Ersticken und Genickbruch. Platzieren Sie die Maus auf eine Dissektion Tablett und sterilisieren mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt in der Mitte der Unterleib und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, die die unteren Extremitäten.
  2. Sezieren Mäuse in einem semi-sterile Haube. Um den Oberschenkel und Schienbein zu lösen, Clip den Oberschenkelknochen und Schienbeine oben unterhalb des Kniegelenks. Lösen Sie die Muskeln von den Knochen mit einer Schere und legen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit 5 ml RPMI abzuschließen.
  3. Gehen Sie zu einem sterilen Kultur Kapuze. Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 27G Nadel mit komplettem RPMI verbunden. Schneiden Sie die beiden Enden der Knochen mit einer Schere, und legen Sie die 27G Nadel, um das Mark aus den Knochen durch leichtes Einspritzen von komplettem RPMI einmal von jedem Ende zu spülen.
  4. Vorbereitung einer Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren die Zellen auf und ab 3-5 mal in der Kulturschale mit der Spritze ohne Nadel.
  5. Zentrifugieren die Zellen 5 min bei 500 xg und dekantiert den Überstand.
  6. Lyse der roten Blutzellen, die mit 1 ml ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA) Inkubation für 1 min und Abstoppen der Reaktion durch Verdünnen mit 10 Volumina komplettem RPMI. Lassen Sie Zellen für 5 Minuten, um durch die Schwerkraft zu pelletieren tot Zellklumpen und Gewebereste stehen.
    Hinweis: Stellen Sie sich nicht mehr als 5 Minuten, da dies in der Zellverlust durch Absetzen der lebensfähigen Zellen führen.
  7. Langsam decant zellhaltige Überstand in ein neues Röhrchen verlassen Trümmerhinter der original tube.
  8. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 500 xg, um die Zellen zu pelletieren, dann entfernen und den Überstand verwerfen.
  9. Resuspendieren Gesamt BM-Zellen in 100 & mgr; l FACS-Puffer (1 × PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA) (typischerweise 4-6 × 10 7 Zellen werden aus BM eine Maus erhalten wurde).

3. FACS Analyse und Sortierung der CLP

  1. Fügen Sie anti-CD16 / 32 (Hybridom-Überstand Clone 2.4G2, 50 ul / Reaktion oder 1-2 ug / Reaktion) in Zellen in FACS-Puffer (Schritt 2.9) für 1-2 min, um Fc-Rezeptoren zu blockieren.
    Hinweis: Anti-CD16 / 32 ist auch Fc-Block, der zugegeben wird, um nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die Fc-Rezeptoren, einschließlich Granulozyten, Monozyten und B-Lymphozyten zu verhindern bezeichnet.
  2. Gleichzeitig gefärbt werden Zellen mit den folgenden Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern (für 4x10 7 Zellen) für 15 Minuten auf Eis unter Vermeidung Umgebungslicht. Antikörper: PE-konjugierten Lineage Marker (jeweils 0,2 ug), das anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), Anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) und anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 & mgr; g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 & mgr; g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 & mgr; g anti-M-CSFR-APC (AFS98) und 0,2 & mgr; g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Wasche die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
  4. Die Zellen in 300 ul FACS Puffer und Filterzellen durch ein 40 & mgr; M Zellsieb.
  5. Waschen Sie die Röhrchen mit einem zusätzlichen 100 ul FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen und die Filter in eine sterile FACS-Sortierung Rohr mit der gleichen Zellsieb.
  6. Führen Durchflusszytometrieanalyse unmittelbar nach der Färbung mit entsprechenden Filtern und Spannungen zur Signalerfassung. Verwenden 488 nm-Laser, um die FITC-PerCP-Cy5.5-markierten Antikörpern, 561 nm-Laser, um die PE- und PE-Cy7-labelded Antikörper und 633 nm erfassen laser, um die APC-markierten Antikörper zu erkennen.
  7. Sortieren Sie CLP nach folgenden Marker lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (wie in Schritt 3.2 gefärbt) mit einem Zellsortierer. Sammeln der sortierten Zellen in ein 15 ml Röhrchen, enthaltend 8 ml komplettem RPMI als Polster.
  8. Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen durch den Zellsortierer am Ende des Durchlaufs angezeigt. Typischerweise kann 5x10 4 CLP vom BM einer Maus gewonnen werden.

4. Cokultur CLP und AC-6

  1. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 3.7 für 10 Minuten bei 500 xg, entfernen Sie den Überstand und Zellpellet mit genügend komplettem RPMI um eine Zelldichte in der Umgebung von 5x10 4 Zellen / ml zu erhalten. Seed 500 Zellen / Well in 12-Well-Platte mit Feeder-Zellen in Schritt 1.4 vorbereitet.
  2. In 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig in-house mit einem Expressionssystem von M. Manz, Universi unsere Anbieterty Spital Zürich, Schweiz) und bei 37 ° C, 5% CO 2 mit periodischen visuelle Überwachung der DC Entwicklung unter dem Mikroskop.
    Anmerkung: Im Handel erhältliche rekombinante menschliche FL oder Maus FL kann als Ersatz für hu-Flt3L-Ig DC Entwicklung bereitgestellt werden können.
  3. Sammeln der Zellen im Überstand am Tag 12 und Waschen der Wells einmal mit 0,5 ml RPMI-Medium Kombinieren der resultierenden Überstände zu vervollständigen. 0,5 ml frisches Medium und Schrott, die haftenden Zellen mit einem Zellschaber.
  4. Verbinden die Zellen enthaltenden Mediums aus beiden Teilen und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
  5. Dekantieren und resuspendieren Zellen in 50 ul FACS-Puffer. In 50 ul anti-CD16 / 32 Hybridomüberstand und Inkubation für 1-2 Minuten an Fc-Rezeptoren zu blockieren.
  6. Aufzuzählen und färben alle Zellen mit den folgenden Antikörpern (jeweils 0,05 ug) Anti-CD11c-APC (N418), Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE.
  7. Waschen und Zentrifuge die Zellen wie beschriebend in Schritt 3.3.
  8. Die Zellen in 100 ul FACS-Puffer, Tor auf CD11c + und zu analysieren, für cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) und pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Insgesamt 4-6x10 7 BM-Zellen werden typischerweise aus Oberschenkelknochen und Schienbein einer 6-8 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6-Maus isoliert. Zu sortieren, CLP, sind insgesamt BM-Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen Linie Marker (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 und MHC-II), anti gebeizt c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC und Anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysiert und sortiert werden mit einem Zellsortierer. Die Sortierstrategie für CLP ist in Abbildung...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Hier beschreiben wir ein in-vitro-Kultursystem für die robuste Erzeugung von DCs und pDCs insbesondere aus einer kleinen Anzahl von CLPs. Die Einzigartigkeit dieses Kultursystem ist auf die Verwendung von AC-6-Zellen, eine Stromazelllinie, Speiser. Diese Vorgehensweise hat sich gezeigt, dass nicht nur die Cytokine, wie IL-7, SCF, M-CSF und FL 20 vorzusehen, sondern auch die Zell-Zell-Kontakt 21 notwendig DC Entwicklung zu unterstützen. AC-6 Zellen wurden zuvor verwendet, um die Untersuchun...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Drs. Markus Manz und Irving Weissman für die Bereitstellung von Reagenzien. Der Service von der Analyse über Durchflusszytometrie und Zellsortierung Core Facility des ersten und zweiten Kern Laboratory an der National Taiwan University College of Medicine und NTU Krankenhaus zur Verfügung gestellt Wir erkennen auch auf. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unterstützt (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) und den Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI und NHRI-EX103-10256SI).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-Maus Ly6g/Ly6c (PE), Klon RB6-8C5Biolegend108408Abstammungsmarkierung
Anti-Maus NK1.1 (PE), Klon PK136Biolegend108708Abstammungsmarkierung
Anti-Maus  CD11b (PE), KlonM1/70Biolegend101208Abstammungsmarkierung
Anti-Maus CD19 (PE), Klon eBio1D3Biolegend115508Abstammungsmarkierung
Anti-Maus B220 (PE), Klon RA3-6B2Biolegend103208Abstammungsmarkierung/FACS
Anti-Maus CD3 (PE), Klon 17A2Biolegend100308Abstammungsmarkierung
Anti-Maus CD8a (PE), Klon 53-6.7Biolegend100707Abstammungsmarkierung
Anti-Maus MHC-II (PE), Klon NIMR-4Biolegend107608Abstammungsmarkierung
Anti-Maus Ter119 (PE), Klon TER-119Biolegend 116208Abstammungsmarkierung
Anti-Maus Thy1.1 (PE), Klon HIS51eBioscience12-0900-83Abstammungsmarkierung
Anti-Maus M-CSFR (APC), Klon AFS98Biolegend135510FACS
Anti-Maus C-Kit (PerCP/Cy5.5), Klon 2B8Biolegend105824FACS
Anti-Maus Sca-1 (FITC), Klon D7Biolegend108106FACS
Anti-Maus IL-7Ra (PE/Cy7), Klon A7R34Biolegend135014FACS
Anti-Maus CD11c (PerCP/Cy5.5), Klon N418Biolegend117328FACS
Anti-Maus CD11b (FITC), Klon M1/70Biolegend101206FACS
FACSAria IIIBD BiosciencesZellsortierer
FACS-Sortierröhrchen BD Biosciences352054
FlowJoFlowJo LLCDurchflussanalyse-Software

Referenzen

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

DurchflusszytometrieFlt3 LigandCobblestone Area Forming CellsKnochenmarkisolierungZellkulturGammabestrahlungZellsortierung

Verwandte Artikel