Methodenartikel

VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal

DOI:

10.3791/53215

⸱

28. Dezember 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Abfrage der rekombinierten Immunglobulin-Schwerketten-VDJ-Regionen von Lymphomen durch Tiefensequenzierung und Abrufen des VDJ-Rearrangements und des somatischen Hypermutationsstatus, um die klonale Architektur einzelner Tumoren abzugrenzen. Der Vergleich der klonalen Architektur zwischen gepaarten Diagnose- und Rezidivproben zeigt die klonalen Evolutionsmodi von Lymphom-Rezidiven.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verständnis Tumor Klonalität ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und Progression der Erkrankung beteiligt sind. Zusätzlich Verständnis der klonalen Zusammensetzungsänderungen, die innerhalb eines Tumors in Reaktion auf bestimmte Mikroumgebung oder Behandlungen auftreten können, um die Gestaltung komplexer und wirksame Ansätze führen zu beseitigen Tumorzellen. Allerdings hat Tracking Tumor klonale Subpopulationen war aufgrund des Fehlens der unterscheidbaren Markierungen schwierig. Zur Lösung dieses Problems wurde ein VDJ-seq-Protokoll erstellt, um die klonalen Evolution Muster der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) Rückfall durch Ausnutzung VDJ Rekombination und somatische Hypermutation (SHM), zwei einzigartige Features von B-Zell-Lymphomen zu verfolgen.

In diesem Protokoll wurden Next-Generation Sequencing (NGS) Bibliotheken mit Indexierung Potential von verstärkten umge Immunglobulin-Schwerkette (IgH) VDJ-Region von Paaren von Primärdiagnose und Rückfall DLBCL samp aufgebautles. Im Durchschnitt mehr als eine halbe Million VDJ-Sequenzen pro Probe wurden nach Sequenzierung, die sowohl VDJ Umlagerung und SHM Informationen enthalten erhalten. Zusätzlich wurden angefertigt Bioinformatik Leitungen entwickelt und vollständig genutzt Sequenzinformation für die Charakterisierung der IgH-VDJ Repertoire in diesen Proben. Darüber hinaus ermöglicht die Pipeline des Wiederaufbaus und der Vergleich der klonalen Architektur der einzelnen Tumoren, die die Prüfung des klonalen Heterogenität innerhalb der Diagnose von Tumoren und Abzug der klonalen Evolution Muster zwischen Diagnose und Rezidivtumor Paaren ermöglicht. Bei der Anwendung dieser Analyse auf mehrere Diagnose-Rückfall-Paare aufgedeckt haben wir wichtige Beweismittel, dass mehrere Unterscheidungstumor evolutionären Muster könnte zu DLBCL Rückfall führen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch auf andere klinische Aspekte wie Identifizierung der minimalen Resterkrankung, Überwachung Rückfall Fortschritt und Ansprechen auf die Behandlung und Untersuchung von Immun Repertoire erweitert werdenn in nicht-Lymphom Kontexten.

Einleitung

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Krebs ist eine klonale Erkrankung. Seit vor dreißig Jahren, als Peter C. Nowell vorgeschlagen, den Krebs zu klonalen Evolution Modell 1 haben viele Studien versucht, klonalen Populationen innerhalb Tumorproben zu sezieren und zu rekonstruieren klonalen Expansion und Evolution Muster, die die Tumorentstehung Prozess 2 zugrunde liegen. Vor kurzem hat Vollgenomsequenzierung Forschern ermöglicht, einen tiefen Blick auf die klonalen Heterogenität und Evolution 3,4 zu nehmen. Aufgrund des Mangels an tractable Marker in vielen Zelltypen ist es jedoch schwierig, die genaue klonalen Architektur und Entwicklungspfad abzuleiten. Glücklicherweise gibt es eine natürliche Klonalität Marker in reifen B-Zellen, aus denen viele malignen Lymphomen, einschließlich DLBCL, stammen. Als Antwort auf Antigen-Stimulation, wobei jede B-Zelle kann eine einzelne produktive IgH VDJ Sequenzsegment zusammen aus einem großen Pool von diesen Segmenten zu bilden, durch Verbinden einer V H (variable), eine D (Diversity) und ein J H (Verbindung). Während dieser process können kleine Teile der ursprünglichen Sequenz deletiert werden und zusätzliche ohne Matrize Nukleotide können verwendet werden, um eine einzigartige VDJ-Rearrangement erstellen. Diese spezifische VDJ Umlagerung kann in allen Nachkommen dieser B-Zelle geerbt werden daher Tagging einzelne reife B-Zelle und ihrer Nachkommenschaft 5. Weiterhin tritt SHM an rekombinierten VDJ-Sequenzen in der anschließenden Keimzentren (GC) Reaktion zur zusätzlichen Mutationen für die Erweiterung des Antikörperpool und die Verstärkung der Antikörperaffinität 6 einzuführen. Daher wird durch Vergleich und die Gegen VDJ und SHM Muster Lymphom Proben, die diese Prozesse durchlaufen haben könnte intratumorale Heterogenität abzugrenzen und klonale Entwicklungsweg der Krankheit kann abgeleitet werden.

Bisher konnten VDJ-Rearrangement und SHM durch PCR Amplifikation der rekombinierten Bereiche, Klonierung der PCR-Produkte, und anschließend die Sanger-Sequenzierung, um Sequenzinformation zu erhalten, identifiziert werden. Dieser Ansatz is niedrigem Durchsatz und niedrige Ausbeute, Abrufen nur einen sehr kleinen Teil des gesamten rekombiniert VDJ Repertoire und innerhalb einer gegebenen Probe behindern die Charakterisierung der Gesamtdarstellung der klonalen Population. Ein modifizierter Ansatz wurde von Erzeugung NGS indexiert Sequenzierungsbibliotheken von VDJ PCR-Produkte und die Durchführung PE 2x150 bp-Sequenzierung, um mehr als eine halbe Million rekombiniert VDJ-Sequenzen pro Probe zu erhalten erstellt. Darüber hinaus wurde eine benutzerdefinierte Pipeline entwickelt, um die Qualitätskontrolle (QC) durchführen, richten, Filter VDJ Sequenzierung liest den Umlagerungen und SHM jedes Lese identifizieren und durchzuführen phylogenetische Analyse auf der klonalen Architektur jeder Probe. Darüber hinaus wurde ein neuer Ansatz wurde gegründet, um weiteren Charakterisierung der klonalen Evolution Muster für Proben bei verschiedenen Krankheitsstadien gesammelt.

Wir haben diese Technik, um DLBCL Patientenproben angewendet. DLBCL ist eine aggressive Form von Non-Hodgkin-Lymphom mit häufigen Rückfällen in bis zu einem third der Patienten 7. DLBCL Rückfälle in der Regel früh auftreten, innerhalb von 2 bis 3 Jahren von der ersten Diagnose, obwohl einige haben nach 5 Jahren 8 auftreten. Prognose für die Rückfall-Patienten ist schlecht, mit nur 10% zu erreichen 3 Jahre das progressionsfreie Überleben aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Dies ist die Grundlage, um den dringenden Bedarf an neuen Ansätzen zur DLBCL Rezidiv 9,10 behandeln. Allerdings sind die molekularen Mechanismen mit DLBCL Rückfall assoziiert noch weitgehend unbekannt. Insbesondere ist die Rolle von klonalen Heterogenität bei der Diagnose und klonale Entwicklung während DLBCL Rezidiv Entwicklung derzeit nicht charakterisierten, was es schwierig macht, eine genaue und nützliche Biomarker Rezidiv vorher definieren. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir unsere angelegten VDJ-Sequenzierungsansatz auf mehreren paarweise mit identischer Primärdiagnose-Rückfall DLBCL Probenpaare. Zwei verschiedene klonale evolutionären Szenarien Rezidiv aus dem Vergleich der klonalen Architekturen zwischen der Diagnose und Rezidiv samp tauchtles, die mehrere molekulare Mechanismen schlägt in DLBCL Rückfall einbezogen werden.

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Protokoll

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1. VDJ Amplification

1.1) DNA-Extraktion aus Tumorproben

  1. Extrahieren von DNA aus dünnen Abschnitten (10-20 um) eingefroren Oktober eingebettet normalen oder malignen Geweben.
    1. Verdauen 10-30 dünne Schnitte von eingebetteten Gewebe von einem Kryostat-Mikrotom in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2, 0,3 M NaCl, 0,002 M Na 2 EDTA) geschnitten mit Proteinase K (0,5 mg / ml, Endkonzentration ) und 0,625% SDS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen in einem 37 ° C-Wasserbad über Nacht.
    2. 1 ml gesättigtem NaCl (5 M), um die Verdauung des Gemischs und kräftig schütteln, 15 Sek.
    3. Zentrifuge bei 1.100 xg für 15 min bei Raumtemperatur.
    4. Den Überstand in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen und fügen Sie zwei Volumina 100% Ethanol.
    5. Mischen Sie durch Umdrehen des Röhrchens 6-8 mal. Zentrifuge bei 5000 × g für 60 min bei 4 ° C, um die gefällte DNA zu sammeln.
    6. Zweimaliges Waschen des DNA-Pellets mit 70% Ethanol. Centrifuge bei 5.000 xg für 15 Minuten jedes Mal, um das Pellet zu erhalten.
    7. Aufzulösen DNA in 100-400 ul TE-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttler über Nacht. Die DNA-Ausbeute beträgt 5 bis 200 & mgr; g (Endkonzentration zwischen 50-500 ng / & mgr; l) in Abhängigkeit von der Größe der Gewebe
  2. Extrahieren von DNA aus dünnen Abschnitten (10-20 & mgr; m) von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) normalen oder malignen Gewebe.
    1. Inkubieren Paraffinschnitte in 1 ml Xylol bei Raumtemperatur zweimal für je 10 min in einem 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu de-Paraffin säubern. Sammle die Gewebeschnitte durch Schleudern bei 13.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Abschnitte in 1 ml 100% Ethanol zweimal bei Raumtemperatur inkubiert, 10 Minuten jedes Mal zu Xylolen Rückstände zu entfernen. Sammle die Gewebeschnitte durch Schleudern bei 13.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Das Paraffin wird vollständig an dieser Stelle aufgelöst und nur die Gewebeschnitt verbleibt.
    3. Der Luft trocknen die Teile bei Raum temperatur für 10-15 min.
    4. Machen Sie eine 0,5 mg / ml Proteinase K-Lösung mit 1x PCR-Puffer (ab 10x PCR-Puffer mit Nuklease-freies Wasser verdünnt). Füge das Proteinase-K-Lösung zu den Proben in einem Endvolumen von 50-100 ul beimpft und über Nacht bei 37 ° C.
    5. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 10 min, um Proteinase K zu inaktivieren
      Anmerkung: In diesem Schritt wird die DNA-Probe in der PCR-Puffer gelöst und kann in den Schritten 1.2 und 1.3 direkt verwendet werden. Die DNA-Ausbeute beträgt 0,5 bis 20 & mgr; g (Endkonzentration 10-200 ng / & mgr; l) in Abhängigkeit von der Größe des Gewebes.

1.2) DNA Quality Assessment

  1. Mix 0,25 ul Taq DNA Polymerase mit 45 & mgr; l der Master-Mix aus dem Handelsleiter-Kit in einem PCR-Röhrchen.
  2. In 5 von 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 hergestellten ul DNA in die PCR-Röhrchen und mischen Sie gut durch und Abpipettieren für mindestens 5-mal.
  3. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und Halten bei 15 ° C.
  4. Vorbereitung einer 2% igen Agarosegel in TBE (Tris / Borat / EDTA).
  5. Mischungs 20 ul PCR-Reaktion mit 4 ul 6x Ladepuffer und geladen auf ein 2% iges Agarosegel.
  6. Flecken auf der Agarosegel mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung und detektieren PCR-Produkte mit einem Gel Vorstellen Systems. Hinweis: Die Proben, die 5 PCR-Produkte ergeben in Größen von 100, 200, 300, 400, und 600 bp wird weiterhin VDJ Amplikons zu erzeugen.
    VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein potenter mutagen. Bitte mit äußerster Vorsicht durch das Tragen von Schutzzahnräder, dh Handschuhe, und entsorgen Sie in bestimmte Behälter pro Richtlinien Institution.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) Amplify rekombiniert IgH VDJ-Segment von Framework-Region 1 (IgVHFR1)

  1. Mix 45 ul Master-Mix aus der Tube Labeled als "Mix 2" eines kommerziellen somatische Hypermutation IGH-Assay für Gel-Nachweis-Kit, 0,25 & mgr; l Taq-DNA-Polymerase, und 5 ul von 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 in einem PCR-Röhrchen hergestellte Probe DNA.
  2. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C für 7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und Halten bei 15 ° C.
  3. Lösung der gesamten PCR-Produkts in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese.
  4. Flecken auf der Agarosegel mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung und detektieren PCR-Produkte mit einem Gel-Bildgebungssystem. Monoklonaler Amplifikat wird mit dem Grßenbereich von 310-380 bp zu erwarten.
  5. Auszuschneiden Gelanteils mit dem monoklonalen Amplikon zwischen 310 bis 380 bp.
  6. Reinigen DNA von exzidierten Gel unter Verwendung einer Standard-Gel-Extraktions-Kit nach Herstellerprotokoll. Anmerkung: Für Proben, die FR1-Fragmente erhalten werden konnte, gibt es keine Notwendigkeit, IgV reichlichHFR2 und IgVHFR3.

1.3.2) Amplify rekombiniert IgH VDJ-Segment von Framework-Region 2 (IgVHFR2)

  1. Mix 45 ul Master-Mix aus der Tube als "Tube B" einer kommerziellen IGH Gene Klonalität Assay zur Gel-Nachweis-Kit, 0,25 & mgr; l Taq-DNA-Polymerase, und 5 ul Proben-DNA aus 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 in einem PCR-Röhrchen vorbereitet markiert .
  2. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C für 7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und lassen bei 15 ° C.
  3. Lösung der gesamten PCR-Produkts in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese.
  4. Visualisieren PCR-Produkt (e) von 0,5 ug / ml Ethidiumbromid. Monoklonaler Amplikon kann im Größenbereich von 250-295 bp beobachtet werden.
  5. Auszuschneiden Gelanteils mit dem monoklonalen Amplikon zwischen 250 bis 295 bp.
  6. Reinige DNA aus ausgeschnittenen Gel mit einem Standard-Gel-ExtraktIonen Kit nach Herstellerprotokoll.

1.4) Optimize VDJ PCR

  1. Mithilfe der folgenden modifizierten PCR-Bedingungen zu amplifizieren IgVHFR1 und IgVHFR2 Verwendung suboptimaler DNA: 95 ° C für 7 min, 40 Zyklen von 95 ° C für 60 sec, 60 ° C für 60 sec, und 72 ° C für 90 sec, abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min.

2. VDJ Amplicon Bibliothek Vorbereitung und Sequencing

2.1) Bibliothek Vorbereitung

2.1.1) End-Reparatur

  1. Bringen VDJ PCR-Produkt aus 1.3 in ein PCR-Röhrchen und fügen Resuspensionspuffer von DNA-Probenvorbereitung Kit auf 60 ul zu bringen Sie die Lautstärke.
  2. In 40 ul End Repair Mix aus DNA Probenvorbereitung Kit und gründlich mischen.
  3. Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Thermocycler (30 ° C) mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 ° C.
  4. Mischen Sie 136 ul magnetische Perlen und 24 & mgr; l PCR grade Wasser zuerst in einem 1,5-ml-Röhrchen, übertragen Sie dann die gesamte End-Reparaturreaktion von 2.1.1.3 in die 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie gut mit dem Perlen-Lösung.
  5. Die Röhrchen auf einem magnetischen Ständer für 2 min, um die Trennung der Beads von der Lösung zu ermöglichen. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Perlen mit 80% frisch zubereiteten EtOH zweimal, während das Rohr auf dem Magnetständer.
  6. Saugen Sie das Ethanol-Lösung vollständig und ermöglichen die Perlen an der Luft trocknen für 15 Minuten bei Raumtemperatur für 15 min.
  7. Nehmen Rohr von den Magnetstativ und resuspendieren Perlen in 17,5 ul Resuspensionspuffer.
  8. Die Röhrchen wieder auf die magnetische Halterung für 2 min zu trennen Perlen aus der Resuspensionspuffer. Entfernen Sie die Resuspensionspuffer (End-Repair-Produkt ist nun in der Resuspension Puffer) in ein sauberes PCR-Röhrchen.

2.1.2) A-Tailing

  1. In 12,5 ul A-Tailing-Mix in den PCR-Röhrchen, das End-Repair-Produkt und gründlich mischen.
  2. Inkubieren des PCR-Röhrchen bei 37 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Thermocycler (37 ° C) mit einem vorgewärmt Deckel bei 100 ° C.

2.1.3) Adaptor-Ligation

  1. In 2,5 ul Resuspensionspuffer, 2,5 ul Ligationsmischung und 2,5 ul DNA-Adaptor-Index in die A-Tailing-Reaktion.
  2. Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 30 MINL in einem vorgewärmten Thermocycler (30 ° C) mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 ° C.
  3. In 5 ul Stop-Ligationspuffer in jede Reaktions und gründlich mischen.
  4. Mix 42,5 ul gut gemischten magnetischen Kügelchen, um die Reaktion folgende Schritte 2.1.1.5 bis 2.1.1.8 zu reinigen. In 50 ul Resuspensionspuffer, um den Adapter-ligierte Produkt zu eluieren.
  5. Reinigen Sie den Adapter-ligierte Produkt ein zweites Mal unter Verwendung von 50 & mgr; gut gemischten AMPure XP Perlen und eluieren das Produkt in 25 ul Resuspensionspuffer in ein sauberes PCR-Röhrchen.

2.1.4) Amplify DNA-Fragmenten

  1. In 5 ul PCR Primer Cocktail und 25 & mgr; l PCR-Master-Mix auf die PCR-Röhrchen, das Adapter-ligierte Produkt und gründlich mischen.
  2. Die Amplifikation in einer vorprogrammierten Thermocycler unter den folgenden Bedingungen: 98 ° C für 30 sec; 10 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 30 sec; dann 72 ° C für 5 min Halten bei 10 ° C.
  3. Bereinigen Sie die Reaktion unter Verwendung von 50 & mgr; l gut gemischte magnetische Kügelchen, und eluieren das Endprodukt in 30 ul Resuspensionspuffer.

2.1.5) Bibliothek Validation

  1. Quantifizierung des Endproduktes mit einem Fluorometer unter Verwendung der Herstellerprotokoll. Endgültige Bibliothek-Konzentration zwischen 2,5 bis 20 ng / & mgr; l.
  2. Beurteilung der Qualität des Endproduktes mit Hilfe eines Analyseinstrument mit hoher Empfindlichkeit DNS-Chips nach dem Protokoll des Herstellers. Erwarten Sie eine einzelne Bande mit der erwarteten Größe für entweder IGVHFR1, IGVHFR2 oder IGVHFR3. DichRWARTETE Größe der Bibliothek Produkt entspricht der Größe des ursprünglichen VDJ Amplikon sowie die Größe der Adapter (~ 125 bp).

2.2) VDJ-PCR-Bibliothek Pooling und Sequenzierung

  1. Berechnung der Molarität jeder Bankfraktion mit der folgenden Formel: NM = [(ng / 1.000) / bp * 660] x 10 9 ng wo die Konzentration des VDJ-PCR-Bibliothek in Schritt 2.1.5.1 gemessen und bp ist der Spitzen Größe des VDJ-PCR-Bibliothek in Schritt 2.1.5.2 gemessen.
  2. Verdünnen Sie die Bibliothek bis 2 nm (10 ul insgesamt) mit DNase-freiem Wasser.
  3. Kombinieren Sie die 10 ul der verdünnten 2 nM Bibliotheken zusammen in ein 1,5-ml-Tube.
  4. Hinzufügen eines gleichen Volumens PhiX Spike-Kontrolle in die 1,5-ml-Tube.
  5. Laden Sie den Pool am 07.00 Konzentration auf eine Durchflusszelle.
  6. Sequenz, die die Bibliotheken mit einem Paired-End 150 Zyklussequenzer nach Herstellerprotokoll.

3. Datenanalyse

Hinweis: Ein summary der Bioinformatik-Skripte in diesem Abschnitt verwendet, kann als Ergänzungs-Code-Datei.

3.1) Ausrichtung und QC

  1. Karte Paired-End-Sequenzierung liest gegen einen menschlichen IGH V, D und J-Region-Datenbank aus der IMGT Website 11 mit einer angepassten Nukleotid-BLAST-Algorithmus, basierend auf 'blastn' von NCBI mit gap open penalty 2, gap extension penalty von 1 heruntergeladen, Wortlänge von 7 und E-Wert, der sich von 10 -4. Entsorgen Sie die Lese-Paar nicht, um sowohl eine IGH V und J-Region zuzuordnen.
  2. Zählen der verbleibenden Lesepaare, IGH V- und J-Zuordnungen müssen die Frequenzen der pass VJ Kombinationen für alle Lesepaare von der Sequenzierungslauf auf der Probe erhalten wird. Graf eine Lesepaar, wenn es sich sowohl auf eine IGH V und J-Gen kartiert, und fügen Sie ihre Allel an die entsprechende Zählung für die besondere VJ Kombination.
  3. Rang der Zählungen für jede neu kombiniert VDJ-Region von 3.1.2 von der Hoch erhaltenest zur niedrigsten. Die Region verfügt über die höchste VDJ liest Zählung wird als Haupt Umlagerung Kombination definiert.
  4. Entsorgen Sie ausgerichteten Sequenzen, die weniger als 35% des Gebietes Haupt Umlagerung in 3.1.3 fest decken.

3.2) SHM Profil Identification

  1. Zählen Sie alle SHM Muster über das liest aus Schritt 3.1.3. Definieren Sie die SHM Muster als Subklon.
  2. Zählen die Anzahl von den Subklonen, die verschiedene einzigartige SHM Mustern entsprechen, und die Anzahl von Lesevorgängen, die auf einzelne Subklone abgebildet werden.

3.3) Grafische Darstellung der Ergebnisse

  1. Führen die phylogenetische Analyse der Subklone mit ihren entsprechenden SHM-Muster unter Verwendung einer Nachbarschaftsverbindungsverfahren von R-Paket "Affe" entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Berechnen einer Distanzmatrix von den einzelnen unterschiedlichen Ausrichtungen, um den Subklon phylogeny zur Keimbahnsequenz der V verwurzelt neuJ Kombination in Frage für jeden gepaarten Probensatz.
  2. Verwenden der Nukleotidsequenz von jedem Subklon als Zeichenvektors und Berechnen der ungefähren Saitenabstand zwischen allen Subklone in der Haupt VJ Umlagerung zur Diagnose und entsprechende Rückfall Proben unter Verwendung eines Levenshtein Abstandsmaß wo mathematisch der Abstand zwischen zwei Ausrichtungen durch d x, y gegeben (i, j), wobei d x, y (i, j) = 1, wenn i ≠ j und 0 sonst, und summieren diese Funktion über die Länge der Zeichenfolge entspricht, Sequenzen, i und j Nukleotids.
  3. Graphisch die resultierende Matrix der Subklon Abstände und ihre entsprechenden Subklon Zählungen in den zwei folgenden Arten:
    1. Verwenden Sie R-Paket "Masse" nach Herstellerprotokoll zur multidimensionalen Skalierung auf den Subklon Distanzmatrix anzuwenden und erzeugen eine zweidimensionale Prinzip koordiniert Karte, die dann aufgetragen wird zusammen mit dem Logarithmusder subclonal zählt wie der Radius des Kreises.
    2. Konstruieren Sie einen ungerichteten Graphen basierend auf der Levenshtein-Distanz, wo die Scheitelpunkte entsprechen den jeweiligen unterschiedlichen Subklon, die aus der großen VJ Umlagerung.
      Hinweis: Wenn der Abstand zwischen zwei anderen Klone gleich eins ist, dann gibt es eine Kante zwischen diesen beiden Eckpunkten. Wenn die Entfernung größer als eins ist, dann gibt es keinen Rand verbindet.
    3. Zur graphischen Bestimmungen 3.3.3.2 mit der tkplot Funktion in der "IGRAPH" R-Paket mit dem Kamada Kawai-Layout nach dem Protokoll des Herstellers. Der Radius der Ecken ist proportional der dritte Wurzel der Gesamtzahl an Klonen, es abgebildet und die Schattierung verwendet einen roten und blauen Bereich, um den Anteil von Klonen, gehören entweder zur Diagnose (blau) oder Rückfall (rot) Proben bezeichnen .

3.4) Heterogenität (Entropie) Messung

  1. Untersuchen Sie die Zahlen und Subklon Grafen von derEinzelmuster somatische Hypermutation in der Haupt VJ Umlagerung für jede vorkommende gepaarten Proben gesetzt.
  2. Berechnen die empirische Entropie und Rest empirische Entropie für die Anzahl der unterschiedlichen Klone in jeder Probe unter Verwendung des Standard-Histogramms auf Basis Entropieschätzung eingestellt.

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Ergebnisse

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Das Gesamtverfahren der VDJ-Sequenzierung (VDJ-seq), einschließlich DNA-Extraktion, rekombiniert VDJ-Region Amplifikation und Reinigung, Sequenzierung Bibliothekskonstruktion liest Verarbeitung und phylogenetische Analyse, ist in Abbildung 1 dargestellt. Routinemßig 5-200 ug DNA kann aus abgerufen werden gefroren oder Gewebeschnitten von 0,5 bis 20 & mgr; g DNA aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Abhängig von der Qualität, Umlagerung Muster und SHM ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aufgrund der nahezu unbegrenzten Anzahl von Iterationen der Sequenzinformation von VDJ Umlagerung und SHM am IGH-Locus der humanen B-Zellen kodiert, Untersuchung des gesamten IGH Repertoire von Hochdurchsatz-deep-Sequenzierung erwies sich als eine effiziente und umfassende Weise zu umreißen klonalen sein und Sub-klonale B-Zellpopulationen. Darüber hinaus kann diese Strategie verwendet, um die klonale Entwicklungspfad von B-Zell-Tumor-Entwicklung, Remission, und Rückfall durch Vergleich der klonalen und Unter klonalen Ar...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten sich bei Dr. Rita Shaknovich und den Mitgliedern des Elemento-Labors, des Melnick-Labors und des Tam-Labors für die nachdenklichen Diskussionen bedanken. Wir möchten uns auch bei der Genomics Resources Core Facility am Weill Cornell Medical College für die Durchführung der VDJ-Sequenzierung bedanken. YJ wurde durch den ASH Scholar Award unterstützt. WT und OE werden durch den Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant unterstützt. OE wird unterstützt durch den NSF CAREER Award, das Starr Cancer Consortium und den Hirschl Trust. Wir danken auch Katherine Benesch, JD, MPH für ihre großzügige Unterstützung dieses Projekts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EthanolVWR89125-170200 proof, für Molekularbiologie
TEPuffer Life Technologies12090-01510 mM Tris· Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA
XyloleVWREM-XX0055-6500 ml
Proteinase K Life Technologies25530-015100 mg
Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) SolutionPromegaU151510 mM pro Nukleotid
10x PCR-PufferRoche11699105001ohne MgCl2
AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase mit Goldpuffer und MgCl2LifeTechnologien431180650 & micro; l bei 5 U/µ l
Leiter für die ProbenkontrolleInvivoscribe Technologies 2-096-002033 Reaktionen
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - GeldetektionInvivoscribe Technologies 5-101-003033 Reaktionen, Mix 2 für den IGVHFR1 Nachweis
IGH Gene Clonality Assay - GeldetektionInvivoscribe Technologies 1-101-002033 Reaktionen, Röhrchen B für IGVHFR2 Nachweis
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM829120 µ l bei 5 U/µ l
10X Tris-Borat-EDTA (TBE) PufferCorning (cellgro)46-011-CM6x1 L
50x TAE PUFFER   VWR101414-2981 L
Ethidiumbromid-LösungSigma-AldrichE151010 mg/ml
25 bp DNA LadderLife Technologies105970111 & Mikro; g/µ l
100 bp DNA LadderLife Technologies15628-0191 µ g/µ l
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500500 g
40 % Acrylamid/Bis-LösungBio-Rad Laboratories1610144500 ml
QIAquick Gel Extraction KitQiagen2870450 Säulen
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay KitLife TechnologiesQ32854
Hochempfindliches DNA-KitAgilent Technologies5067-4626
2100 BioanalysatorAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
MiSeqIllumina
Qubit 2.0 FluorometerLife TechnologiesQ32872
Resuspensionspuffer (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
Endreparaturmischung (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
A-Tailing-Mischung (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
Ligationsmischung (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
DNA-Adapter-Index (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
Stopp-Ligationspuffer (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
PCR-Primer-Cocktail (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
PCR-Mastermix (Illumina TruSeq DNA-Probenvorbereitungskit v2)IlluminaFC-121-2001
Magnetisches StativLife Technologies4457858
Gel-BildgebungssystemBio-Rad Laboratories170-8370
Mix

Referenzen

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