Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Summary

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Abstract

Mitochondrien der Skelettmuskulatur spielen eine spezifische Rolle bei vielen Krankheitspathologien. Daher hat sich die Messung des Sauerstoffverbrauchs als Indikator für die mitochondriale Funktion in diesem Gewebe immer mehr durchgesetzt. Obwohl es viele Technologien und Assays gibt, die mitochondriale Atmungswege in einer Vielzahl von Zellen, Geweben und Spezies messen, gibt es derzeit eine Lücke in der Literatur in Bezug auf die Zusammenstellung dieser Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus dem Skelettmuskel der Maus für die Verwendung in Mikroplatten-basierten Technologien. Wichtig ist, dass der Einsatz von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays unter Mitochondrienbiologen zunimmt, da sie Messungen mit hohem Durchsatz mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien ermöglichen. Aus diesem Grund wurde eine Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays entwickelt, die in der Lage sind, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu beurteilen. Die hierin vorgestellten Verfahren bieten Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung dieser Assays mit einer optimalen Menge an mitochondrialem Protein und Reagenzien und hoher Präzision, wie durch die minimale Varianz über den dynamischen Bereich jedes Assays nachgewiesen wird.

Introduction

Die wichtigste physiologische Rolle von Skelettmuskel Mitochondrien ist es, ATP aus oxidative Phosphorylierung ¹ zu produzieren. Wichtig ist, zu spielen Skelettmuskel Mitochondrien eine besondere Rolle bei der körperlichen Leistungsfähigkeit ^2, Alterung ^3, degenerative Erkrankung ^{4 und} Diabetes Typ II ^5. Als einer alternden Gesellschaft und Typ-II-Diabetes als ^die 7. führende Todesursache in den Vereinigten Staaten ^6, der Bedarf an Methoden, die die Funktion der Mitochondrien zu beurteilen hat sich immer häufiger in der biomedizinischen Forschung ^7,8. Insbesondere ist die Messung des Sauerstoffverbrauchs hat außergewöhnliche Nützlichkeit bei der Beurteilung der Mitochondrienfunktion, da sie das koordinierte Zusammenwirken zwischen mitochondrialen und nuklearen Genome stellt den funktionalen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung ⁹ auszudrücken.

Mehrere Technologien existieren, ermöglichen die Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen und zu isolieren,d Mitochondrien ^7-10. Darüber hinaus haben Tests für mehrere Zelltypen und Geweben entwickelt worden und in einer Vielzahl von Arten, die für die Messung der mitochondrialen Atmungswege und Steuer ^9,11,12 ermöglichen. Allerdings gibt es derzeit eine Lücke in der Literatur in Bezug auf die Zusammenstellung aller dieser Tests unter Verwendung von isolierten Mitochondrien aus Maus Skelettmuskel für die Verwendung in auf Mikrotiterplatte Sauerstoffverbrauch Technologien. Wichtig ist, dass Verwendung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays unter mitochondrialen Biologen wächst und ermöglicht hohe Durchsatzmessungen mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien ^9. Daher ist eine Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests wurden entwickelt, die die Ermittlung, wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der Elektronentransportkette (ETC) auftreten werden, zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden zwei weitere auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays entwickelt, die die Analyse der Koordinierung betwee aktivierenn der Tricarbonsäure (TCA) Zyklus und der ETC und zwischen ß-Oxidation und der ETC. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden liefern eine klare und präzise Art und Weise, um mechanistische Veränderungen im mitochondrialen Funktion in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll beginnt, nachdem man Mitochondrien aus roten Skelettmuskel isoliert. Mitochondrien wurden isoliert, wie zuvor von ~ 75 beschrieben - 100 mg rote Skelettmuskel ^13. Zwischen 5-10 ug / ul der mitochondrialen Protein aus dieser Menge an Gewebe durch Resuspendieren des endgültigen mitochondriale Pellet in ≤50 ul Isolationspuffer für Mitochondrien (IBM) 2 (Siehe Frisard et al ¹³⁾ erreicht werden.

1. Setup-

1. Bereiten Sie Arbeitsstammlösungen (Tabelle 1) und mitochondriale Assay-Lösung (MAS) Mischungen (Tabelle 2) für nachfolgende Tests.
   Hinweis: Die meisten der Vorbereitung auf die Tests können im Voraus erfolgen, da die meisten Aktien-Lösungen und MAS gespeichert werden können, werden.
2. Die Nacht hydratisieren eine respirometrischen Analysenkartusche in 1 ml Kalibrierungslösung vor dem Experiment in einem _nicht-CO 2 Inkubator bei 37 ° C.
3. Der Tag des Experiments, take aus gefrorenen Beständen (Substrate und mitochondriale Modulatoren, MAS-Mix, MAS W / O-BSA, Tabelle 1) und Tauwetter in 37ºC Bad oder Inkubator.
4. Bereiten Sie alle Substratlösungen (Tabelle 3) und Injektionen (Tabelle 4-5) und stellen pH nach Wunsch (pH 7,4). Nachdem der pH-Wert eingestellt, gespeichert auf Eis.
5. Programmieren Sie die Multi-Well-Sauerstoffverbrauch Messmaschine die richtige Mischung, warten, und messen Parameter (siehe Tabelle 6) und Label Hintergrund und Gruppe / Zustand Vertiefungen durch Eingabe der ersten Analyse-Software, gefolgt von dem Modus "Standard".
   1. Geben Sie in das "Gast" Forums und klicken Sie auf die "Test-Assistent". Einmal in der "Test-Assistent", klicken Sie auf "Protokoll", um Mischung zu ändern, warten Sie, und messen Parameter. Beschriften Sie die Hintergrundbrunnen unter dem "Back. Correction "Registerkarte und sicher sein, die Option" Do Grundkorrektur ".
   2. Label conditions indem Sie zuerst auf die Registerkarte "Gruppen & Labels", gefolgt von der Registerkarte "Gruppen-Info". Nachdem diese Parameter eingegeben haben, klicken Sie auf "Ende", gefolgt von "Vorlage speichern".

2. Der Testlauf

1. Laden Sie die Injektionslösungen in einen Testlauf Patrone und starten Sie die Kalibrierung durch Eingabe der ersten Analyse-Software, gefolgt von der Eingabe der "Standard" Modus. Geben Sie in das "Gast" Forum. Öffnen Sie die Vorlage in Schritt 1.5 unter der "XF" Platte gespeichert, auf der Registerkarte "Vorlagen". Einmal geöffnet, klicken Sie auf "Start", um die Kalibrierung zu starten.
   Hinweis: Der Testlauf Patrone muss mit der abgeschrägten Ecke nach links unten in die Maschine eingegeben werden. Dies dauert etwa 30 min. Achten Sie darauf, Lösungen in die richtigen Anschlüsse zu injizieren. Injektionen in Tabelle 4-5 werden in der Reihenfolge der Lade aufgeführt.
2. Sanft, aber gründlich mischen die mitochondria Lager durch Rühren der Lösung mit 200 ul Pipettenspitze, gefolgt von sanft Verreiben des Lager mit einer 200 ul Pipettenspitze, die seine Öffnung durch Schneiden ~ 3 mm vom Ende der Spitze mit einer Schere erweitert hatte.
3. Führen Bicinchoninsäure (BCA) Assay, um die Proteinkonzentration der mitochondrialen Lager zu bestimmen.
4. Verwendung der aus Schritt 2.3 erworbene Stoffkonzentration resuspendieren 10 ug mitochondrialen Protein / 200 ul des Succinat / Rotenon Substratmischung (Tabelle 3). Resuspendieren 14 ug mitochondrialen Protein / 200 & mgr; l der verbleibenden Substratmischungen (Dies muss für jedes Substrat Mischung durchgeführt werden) (Tabelle 3). Legen Sie alle mitochondrialen Protein / Substratmischungen auf Eis.
   Anmerkung: Die optimale Menge an Mitochondrien-Protein pro Well für jeden Assay wurde wie zuvor beschrieben ^{bestimmt. 9} Es wurde festgestellt, daß das Pyruvat / Malat, Palmitoylcarnitin / Malat, Glutamat / Malat eind Elektronenfluss Assays verwendet 3,5 ug des mitochondrialen Proteins, während das Succinat / Rotenon Assay verwendet 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Vertiefung. Daher muss der Forscher genug mitochondrialen Protein resuspendieren 4 repliziert in diesem Schritt, da entweder 2,5 ug oder 3,5 ug pro 50 ul pro Vertiefung geladen (siehe Schritt 2.6).
5. Mischen Sie die Mitochondrien / Substratlösungen sanft, aber gründlich durch Rühren der Lösung mit 200 ul Pipettenspitze, gefolgt von sanft Verreiben des Lager mit einer 200 ul Pipettenspitze, die ~ 3 mm von seinem Ende gehabt hat abgeschnitten.
6. Legen Sie eine Zellkulturplatte auf Eis und in dreifacher Ausfertigung, Last 50 ul / Vertiefung von jedem der Mitochondrien / Substratmischungen. Die Entwickler des auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assay empfehlen Verlassen ein Minimum von zwei Leerprobe (ohne Mitochondrien) Brunnen, vorzugsweise auf beiden Seiten auf der Zellkulturplatte.
7. Spin der Zellkulturplatte bei 2.000 g für 20 min bei 4 ° C. Während die Platte sPinning, Aufwärmen der Substratlösungen in einem 37 ° C Wasserbad.
8. Nach der Spin vollständig ist, sorgfältig 450 ul jeder Substratlösung auf seiner entsprechenden Wells laden (dh, legen Sie das Pyruvat / Malat-Substrat in die Vertiefungen, die Mitochondrien zunächst in der Substratlösung resuspendiert haben). Achten Sie darauf, die Platte bei RT zu laden. Hinweis: Blank Brunnen sollte mit 500 ul Substrat geladen werden. Für den Elektronenfluss Assay bezeichnet leere Vertiefungen sollten mit dem Elektronenfluss Substrat (Pyruvat / Malat + FCCP) geladen werden, während die gekoppelten Assay Blindvertiefungen mit jedem Kopplungsassay Substrat geladen werden.
   Hinweis: Bei der Durchführung der gekoppelten und Elektronenfluss-Tests auf der gleichen Platte, muss der Forscher Hintergrund Brunnen an die jeweiligen Tests neu zuweisen, nachdem der Testlauf abgeschlossen ist, mit Hilfe der "XF Reader" Plattform über den Reiter "Instrument". Einmal in der "Instrument" Einstellung, klicken Sie auf die "Verwaltung"Reiter, gefolgt von "Background Correction". Hit "Geräte Setup beenden", wenn Sie fertig. Dies ist, weil die Kombination von Ascorbat / TMPD können _O 2, wodurch eine separate Hintergrundkorrektur für jeden Assay benötigten Typ zu verbrauchen.
9. Nachdem das 450 & mgr; l Substrat zu jeder Vertiefung zugegeben, Ansicht der Schicht aus Mitochondrien in der Vertiefung zu gewährleisten, die Mitochondrien sind gleichmäßig in einem einzigen Monoschicht dispergiert (20-facher Vergrößerung [siehe Rogers ^9, 4]). Wells, die scheinbar nicht um eine gleichmäßig verteilte Monolage haben können post hoc entfernt werden.
10. Nach der Überprüfung für mitochondriale Einhaltung, legen Sie die Mikroplatte in die respirometrischen Assay Instrument und starten Sie den Test, indem Sie auf "OK" ausgeführt werden.
    Hinweis: Die Kalibrierung von Schritt 2.1 muss abgeschlossen sein, bevor der Lauf beginnt. Sobald die Forscher klickt "OK", wird die Maschine das Dienstprogramm Platte, die für die Kalibrierung verwendet wurde ausgeworfen.
    1. Entfernen Sie das Dienstprogramm Platte und setzen Sie den Zellkulturplatte, die die Mitochondrien auf dem Tablett enthält. Die blaue Kerbe auf der Zellkulturplatte sollte in der unteren linken Ecke des Behälters platziert werden. Klicken Sie auf "Weiter", um den Testlauf zu starten.
11. Nach dem Durchlauf abgeschlossen ist, werfen die Zellkulturplatte und Kassette mit der Taste "Auswerfen" auf dem Bildschirm.
    1. Sobald die Platte ausgeworfen wird, entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturplatte und Kassette und klicken Sie auf "Weiter" auf dem Bildschirm. Der Lauf wird automatisch als .xls-Datei in der Datei "Data" gespeichert werden.
12. Öffnen Sie diese Datei und ändern Sie die Anzeige von "O2" auf "OCR", indem Sie auf den Abwärtspfeil unter dem "Y1:" Marker.
    1. Nächste Änderung "Middle Point" auf "Punkt-zu-Punkt-Preise" unter dem "Rate Daten angezeigt, wie:" -Option. Klicken Sie auf "OK", um diese Änderungen zu übernehmen.
13. Klicken Sie auf die Registerkarte "Nun Gruppen-Modus" auf unten links auf dem Bildschirm, um Gruppe Näpfe ähnlichen Bedingungen zusammen. Schließlich klicken Sie auf "Probe Mittelwert / Standardfehler" Registerkarte in Richtung auf die Mitte des Bildschirms, auf der linken Seite. Alternativ können diese Befehle eingerichtet werden, bevor der Test beginnt in der "Test Wizard" -Einstellung.
    Hinweis: Jeder Zustand wird ein Mittelwert ± Standardabweichung für jede Rate und jede Bedingung anzuzeigen. Es gibt Rate Messungen pro Zustand (State 2 [Kupplung] / State3u [Elektronenfluss] Atmung durch vier Injektionen folgten) übernommen. Verwenden Sie den Mittelwert des Staates 2 Rate der zweiten Messung zu bestimmen Staat 4o bei der minimalen Punkt nach Oligomycin Injektion, verwenden Sie den Maximalpunkt für Zustand 3 und Zustand 3U nach ADP und FCCP Injektion, bzw., und verwenden Sie die Mindestpunkt für Antimycin A induzierte Atmung für die Kopplung Assays. Verwenden Sie den Maximalpunkt für die Pyruvat / Malat-induzierten Zustand 3u Atmung, verwenden Sie die MindestPunkt für Rotenon induzierte Respiration, verwenden Sie den Maximalpunkt für Bernsteinsäure-induzierte Staat 3u Atmung, und verwenden Sie die Mindestpunkt für Antimycin A induzierte Atmung für den Elektronenfluss-Assay. Alle Versuche wurden 3-mal durchgeführt, und die gezeigten Daten sind die Ergebnisse einer repräsentativen Verfolgung.

Results

Abbildung 1 für Sauerstoff Verbrauchsraten (OCR) für die Pyruvat / Malat, Succinat / Rotenon, Palmitoylcarnitin / Malat und Glutamat / Malat-Assays (Coupling-Assays). Diese Assay-Kurven werden als Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR, als Funktion der Zeit angezeigt wird, werden Hintergrund correceted und werden als Punkt-zu-Punkt-Preise angezeigt. Jedes Panel repräsentiert Sauerstoffverbrauch in verschiedenen mitochondrialen Zustände wie durch Zufall und Williams ¹⁴ beschrieben. Die erste Platte darstellt basale Sauerstoffverbrauch oder Zustand 2 der zweiten Platte, nach der Injektion von ADP stellt maximale gekoppelt Atmung oder Zustand 3 der dritten Platte nach Injektion Oligomycin A (ein Inhibitor der Komplexe V) darstellt, die Atmung durch Protonenleck oder Staats 4o. Die vierte Platte nach Injektion FCCP stellt maximale entkoppelt Atmung oder Staats 3u. Schließlich wird das fünfte Panel nach der Injektion von Antimycin A, stellt die Hemmung der oxidativen Atmung. Bemerkenswerterweise all mitochondrialen Staaten haben minimale Standardabweichung. Dies ist auf eine gute Durchmischung der mitochondrialen Lager und den Mitochondrien / Substratmischungen und die Verwirklichung eines einzelnen Monoschicht der Mitochondrien nach der Einhaltung Spin (Schritt 2.6). Auf der anderen Seite, das Laden ungleiche Mitochondrien in jede Vertiefung geben und nicht das Erreichen einer einzigen Monoschicht aus Mitochondrien in der Vertiefung der Mikroplatte führt zu der Standardabweichung in jedem Zustand erhöht, wie in Abbildung 2 dargestellt.

Die Kurven in Abbildung 1 Anzeigeebenen für jedes mitochondriale Staat und für jedes Substrat. Das Plateau nach zwei Meßzyklen erreicht schlägt gute mitochondrialen Qualität und die Mitochondrien bleiben an dem auch während der gesamten Dauer des Assays haftet. Zusätzlich kann das Erreichen des Maximalplateau Raten wünschenswert sein, da dies ermöglicht es dem Forscher, die durchschnittliche OCR an diesen mitochondrialen Zustände einnehmen, wodurch Vorspannung, die auftreten können Reduktionsdurch willkürliches Auswählen eines Punktes.

Die Höhe der Mitochondrien pro Vertiefung wurde durch Optimierungsversuche ermittelt. Die optimale Menge an Mitochondrien pro Vertiefung sollte in State 2 Raten zwischen 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten <1,500 pmol / min / Loch, da diese Werte in dem dynamischen Sauerstoffmessbereich des Multiwell-Sauerstoff- Verbrauchsmessung Maschine. Laden zuviel mitochondrialen Protein pro Well in OCRs über den dynamischen Bereich des Instruments (3A) führen. 3 veranschaulicht das Laden mit 3,5 ug des mitochondrialen Protein pro Well (blaue Spur) im Vergleich zum Lade 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Well (red Tracing) für die Succinat / Rotenon Assay. Laden zuviel mitochondrialen Protein pro Vertiefung kann auch auf die Erschöpfung der Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer des Bohrlochs zu führen, wodurch eine genaue Messung der OCR für jede aufeinanderfolgende Messung ⁹ (3B </ strong>). Punkt-zu-Punkt OCR die momentane Änderungsrate des OCR. Wenn flach, ist das OCR stetigen / stable, aber wenn abnimmt, dann kann es eine biologische oder technische Problem sein. Der starke Rückgang in OCR in Zustand 3 und Zustand 3u Atmung (3A) wird von den Mitochondrien anstrengend die Sauerstoffversorgung vor dem Ende der Messung (3B) verursacht.

4 stellt OCR gegen die Zeit für den Elektronenfluss Assay. Das Verfolgen korrigiert und angezeigt, wie für Figur 1 beschrieben wurde. Die erste Platte in diesem Test entspricht dem Stand 3u Atmung auf Pyruvat / Malat über komplexe I. die zweite Platte nach Injektion Rotenon stellt die Hemmung der Komplex I vermittelte Atmung. Das dritte Panel, nach der Injektion von Succinat, stellt Substrat angeregt Staat 3u mit Elektronen in die ETC in Complex II (Complex II vermittelten Atmung). Die vierte Platte nach Injektion Antimycin A stellt die Hemmung der Komplex III und damit insgesamt die Atmung. Schließlich wird das fünfte Panel nach Injektion von Ascorbat / TMPD stellt Komplex IV vermittelten Atmung. Ähnlich den Kurven in Figur 1 haben alle mitochondrialen Zustände minimale Standardabweichung und jeweils Rate hat oder beinahe ein Plateau erreicht.

Abbildung 1. Kupplung Assays. (A) 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat, (B) 10 mM Succinat / 2 uM Rotenon, (C) 40 & mgr; M Palmitoylcarnitin / 1 mM Malat und (D) 10 mM Glutamat / 10 mM Malat gekoppelt mitochondriale Atmung Assay-Kurven, wie durch Multi-Well-Messung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 & mgr; g für alle Tests außer Succinat / rotEnon, das 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Vertiefung verwendet. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvat; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; PAL-C = Palmitoylcarnitin; GLUT = Glutamat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2 sehr unterschiedlich Pyruvat / Malate Assay. Sehr variabel 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat-Test durch unvollständig Misch Mitochondrien aus der mitochondrialen Lager im Substrat / MAS-Mix, damit variable mitochondrialen pro führenden verursachtProteinbeladung in jede Vertiefung. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 & mgr; g. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Überlastung mitochondriale Protein für die Succinat / Rotenon Assay. (A) Die Sauerstoffverbrauchsraten außerhalb des dynamischen Bereichs der Multiwell Sauerstoffverbrauchsmessmaschine durch Laden 3,5 ug mitochondrialen Protein pro Well (blau Verfolgung) verursacht im Vergleich zum Lade 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Well (rot Verfolgung). (B ) OxyGen Spannung nähert folgenden ADP und FCCP Injektionen durch Laden übermäßige mitochondriale Protein (3,5 ug) pro Vertiefung (blaue Spur) verursacht im Vergleich zu dem Laden eine optimale Menge (2,5 ug) der mitochondrialen Protein pro Well (rot Verfolgung) Null. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikate pro mitochondriale Proteinmenge. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; _O 2 = Sauerstoff; mm Hg = Millimeter Quecksilber. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Elektronenfluss Assay. 5 mM Pyruvat / 1 mM Malat + 4 uM FCCP, Elektronen fniedrige mitochondriale Atmung Assay Verfolgung durch Multi-Well-Messung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 & mgr; g. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; Anti-A = Antimycin A; Asc = Ascorbate; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- p-Phenylendiamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Reagens	Lizenz Konzentration	MW	Schluss Volume	Masse gegeben	Kommentare / Beschreibung
	(M)	(g / mol)	(ml)	(g oder ml)
EGTA, pH 7,2	0.1	380,35	100 ml 1 M Tris-Base	3,801 g	Lagerung bei 4 ° C
HEPES	1	238,3	250 ml DiH 2 O	59. 57 g	Lagerung bei 4 ° C
MgCl 2, Hexahydrat	1	203,31	250 ml DiH 2 O	50,82 g	Lagerung bei 4 ° C
Pyruvat-pH-Wert 7,4	0.1	88.06 (Kommt als 14.11 M Lösung)	40 ml DiH 2 O	0,283 ml Pyruvinsäure	Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C, stellen frische alle zwei Wochen
Bernsteinsäure pH-Wert 7,4	0,5	118,09	100 ml DiH 2 O	9,4 g succinic Säure	Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C
Malate, pH 7,4,	0,5	134,09	100 ml 95% Ethanol	6,7 g Apfelsäure	Stellen Sie 200 ul Aliquots und bei -20 ° C
TMPD	0,01	164,25	10 ml	0,0164 g	Stellen Sie 300 ul Aliquots und bei -20 ° C; Mischen Sie mit einer äquimolaren Menge von Ascorbat zu TMPD zu halten reduziert
Palmitoyl-L-Carnitinchlorid	0,01	436,07	1,14 ml 95% Ethanol	0,005 g	Machen Sie 40 ul Aliquots und bei -20 ° C
Oligomycin A	0,006	791,06	0,987 ml 95% Ethanol	0,005 g	Machen Sie 20 ul Aliquots und bei -20 ° C
FCCP	0,01	254,17	3,9 ml 95% Ethanol	0,01 g	Machen Sie 40 ul Aliquots und bei -20 ° C
Rotenon	0,001	394,4	10 ml 95% Ethanol	0,0039 g	Lagerung bei -20 ° C
Antimycin A	0,005	548,63	9,12 ml 95% Ethanol	0,025 g	Lagerung bei -20 ° C
K + ADP	0,5	501,32	3,9 ml DiH 2 O	1,0 g	Lagerung bei -20 ° C
Äpfelsäure, pH 7,4	0,5	134,09	40 ml	2,68 g	Stellen Sie 200 ul Aliquots und bei -20 ° C

Stammlösungen

Reagens	Lizenz Konzentration	Masse gegeben	Endmolarität / Percent
	(M)	(g oder ml)
Saccharose	-	11.98 g	70 mM
Mannit	-	20,04 g	220 mM
Monobasisches Kaliumphosphat	-	0,34 g	5 mM
MgCl 2, Hexahydrat	1	2,5 ml	5 mM
HEPES	1	1,0 ml	2 mM
EGTA	0.1	5,0 ml	1 mM
Im Wesentlichen Fettsäure Free- BSA	-	1,0 g	0,20%

. Tabelle 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml Aliquot und bei -20 ° C * Hinweis: Ausschließen BSA für die Assay-Injektionen verwendet MAS-Mix.

Substrat Medium	Endkonzentration	Lagerbestand (ul)	Anzahl der MAS * (ml)
Pyruvat / Malate	10 mm / 5 mM	Pyruvat: 1.000	9
		Malate: 100
Succicinate / Rotenon	10 mm / 2 & mgr; M	Succinate: 200	10
		Rotenon 20
* Pyruvat / Malate + FCCP	5 mm / 1 mm / 4 & mgr; M	Pyruvat: 500	10
		FCCP: 4
		Malate: 20
Palmitoyl L-Carnitin / Malate	40 uM / 1 mM	Palmitoylcarnitin: 40 Malate: 20	10
Glutamat / Malate	10 mm / 10 mM	Glutamate: 400	10
		Malate: 200

Table 3. Substratlösungen pH 7,4: Stellen Sie frischen der Tag des Experiments. * Electron-Flow-Assay-Lösung.

Injektionsmittel	Konzentration	Lagerbestand (ul)	Anzahl der MAS (ml)	Menge in Patrone injiziert	Endkonzentration
					(Nach dem in der Platte eingespritzt)
ADP	50 mM	300 & mgr;	3	50 & mgr;	5,0 mM
Oligomycin A	20 & mgr; M	10 & mgr;	3	55 ul	2,0 & mgr;
FCCP	40 & mgr; M	12 ul	3	60 & mgr;	4,0 & mgr; M
Antimycin A	40 & mgr; M	24 & mgr;	3	65 & mgr;	4,0 & mgr; M

TLage 4. Injektionen zur gekoppelten Assays pH 7,4:. Machen Sie frische der Tag des Experiments. * Kupplung Tests umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Pyruvat / Malat, Succinat / Rotenon, Palmitoylcarnitin / Malat und Glutamat / Malat.

Injektionsmittel	Konzentration	Lagerbestand (g oder ul)	Anzahl der MAS (ml)	Menge in Patrone injiziert	Endkonzentration (Nach dem in der Platte eingespritzt)
Rotenon	20 & mgr; M	60 & mgr;	3	50 & mgr;	2,0 & mgr;
Bernsteinsäure-	50 mM	300 & mgr;	3	55 ul	5,0 mM
Antimycin A	40 & mgr; M	24 μ; l	3	60 & mgr;	4,0 & mgr; M
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 & mgr;	3	65 & mgr;	100 uM, 10 mM
		Ascorbate: 0.059 g

Tabelle 5. Injektionen zur Elektronenfluss Assay pH 7,4:. Machen Sie den Tag des Experiments Frisch

Befehl	Zeit (min)	# Von Zyklen
Kalibrieren
Warte ab	10 min (zu ermöglichen Platte aus Einhaltung Schritt erwärmen)
Mischen	1 Minute	2
Michasure	2 min
Inject A
Mischen	1 Minute	2
Maßnahme	2 min
Injizieren B
Mischen	1 Minute	2
Maßnahme	2 min
Injizieren C
Mischen	1 Minute	2
Maßnahme	2 min
Injizieren D
Mischen	1 Minute	2
Maßnahme	2 min

Tabelle 6. Instrument Run Protocol.

Discussion

Die in diesem Artikel vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mitochondrien aus 75 isoliert - 100 mg Maus-Skelettmuskel. Diese Tests können mit hoher Präzision durchgeführt werden, wie durch die enge Standardabweichung zwischen den drei Vertiefungen belegt. Wichtig ist, dass diese respirometrischen Assays erlauben die Ermittlung von wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der ETC, TCA-Zyklus, β-Oxidationswegs, Substrat-Transporter etc. auftreten werden, in einem häufig verwendeten Tiermodell.

Es ist wichtig, den Grund für die Verwendung verschiedener Brennstoffe und Inhibitoren in diesem Protokoll verwendet markieren. Pyruvat / Malat und Glutamat / Malat respirometrischen Assays erlauben die Beurteilung komplexer I vermittelte Atmung, sowie die Beurteilung der jeweiligen Transporter, und im Fall von Glutamat, Desaminase ^15. Alternativ kann die Kombination vonSuccinat / Rotenon ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Atmungsfluss durch Complex II des ETC seit Rotenon hemmt Komplex I und Succinat bietet Elektronen-Komplex II über die Reduktion von Flavinadenindinucleotid (FADH ₂₎ ^15. Diese Untersuchungen liefern substratspezifischen Information, die Kopplungseffizienz und maximale Atmung. Der Elektronenstrom Assay ist, daß die Kombination von Substraten und Inhibitoren ermöglicht die Bewertung von Mehrfachkomplexen in mitochondrialen Atmungsfluss ⁹ einzigartig. Das Ausgangssubstrat Mischung von Pyruvat / Malat + FCCP erlaubt die Auswertung von maximal Atmung durch Komplex I angesteuert, während die Injektion von Rotenon gefolgt von Succinat ermöglicht die Beurteilung maximale Atmung durch Complex II angetrieben. Die Injektion von Antimycin A, ein Inhibitor der Komplex III, gefolgt von der Injektion von Ascorbat / TMPD ermöglichen die für die Auswertung der Atmung durch Komplex IV da die Ascorbate angetrieben / TMPD istElektronendonor zu Cytochrom C / Complex IV. Während keine Informationen über die Kopplungseffizienz erreicht wird, ist das Verfahren ideal für sehr kleine Probengrößen, die das Ausführen mehrerer Substrate unabhängig auszuschließen. Schließlich ermöglicht die Analyse der Koordinierung zwischen β-Oxidation und die ETC da die aus der Oxidation von Palmitinsäure (β-Oxidation) hergestellt Reduktionsäquivalent der Einsatz von Palmitoylcarnitin / Malat Einspeisung ins ETC durch das Elektronenübertragungs Flavoprotein ^15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Kupplung und die Elektronen fließen Assays können auch in Tandem aufgrund einiger Eingriff (medikamentöse Behandlung, genetische Manipulation) verwendet werden, um Veränderungen in der mitochondrialen Funktion identifiziert werden.

Die hohe Präzision für diese Assays erreicht ist vor allem eine gute Durchmischung der Mitochondrien, sei es vor der Proteinbestimmung, bzw. mit den Substratlösungen ist. In diese Richtung einmal den Mitochondrien in das Substrat solutio resuspendendns, ist es wichtig, diese Lösung gut vor dem Laden der Zellkultur-Platte, wie in Schritt 2.2 mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze beschrieben mischen. Die Nichtbeachtung der Mitochondrien gründlich mischen wird, um große Variation innerhalb des Assays führen. Zusätzlich mit einer schmalen Öffnung Pipettenspitze wird Scherkräfte zu erzeugen, während das Mischen der Mitochondrien und erhöht das Potential, um die Membranen der Mitochondrien und die Freisetzung von Cytochrom C. Die Einhaltung der Schritt (2.7) ist ebenfalls ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll zu beschädigen. Bei Nichtbeachtung der geladenen Zellkulturplatte lang / schnell genug drehen wird in unvollständiger Einhaltung der Mitochondrien zum Brunnen führen, so führen erhöhte Variabilität zwischen den Bohrlöchern und Messungen.

Die beschriebenen Protokoll wurde optimiert, um die folgenden: Laden eine optimale Menge an mitochondrialer Protein pro Loch, mit den richtigen Konzentrationen / Herstellungsverfahren, um Lager und Substratlösungen zu machen, die Änderung der Testlauf, um mitochondriale Zustand pla sicherzustellen,teaus und geeignete Durchmischung der mitochondrialen Lager und mitochondriale / Substratmischungen. Vor diesen Optimierungsbemühungen stießen die Autoren Fallstricke in der Testlauf. Im Folgenden beschreibt Methoden zur Problembehandlung / Änderungen, die hilfreich bei der Optimierung dieses Protokoll gab. In Bezug auf die optimale Beladung wird geladen zu wenig Mitochondrien nicht eine robuste Reaktion hervorzurufen, während das Laden zu viel Mitochondrien wird die Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer erschöpfen und führen zu ungenauen Messungen. Rogers et al ⁹ enthält Beispiele für die Bestimmung der optimalen Beladungsmengen der Mitochondrien pro Vertiefung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays. Häufiger zu viel Mitochondrien pro über 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten> 1500 pmol / min / Vertiefung geladen sowie durch staatliche belegt 2 Raten. Wenn über Laden auftritt, ein Experiment mit verschiedenen Konzentrationen von mitochondriales Protein (beispielsweise zwischen 1 -. 10 ug) zu OCR innerhalb des dynamischen r hervorrufenange des Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine. Herstellung und Verwendung der richtigen Konzentrationen von Substraten und Aktien ist von größter Bedeutung. Verwenden Sie immer die Säureform von Substraten / Injektionen und der pH-Wert mit Kaliumhydroxid oder HCl; Natrium-Puffer / Lösungen sind nicht zu empfehlen. Darüber hinaus Resuspendieren Substrate / Aktien in DMSO oder 100% Ethanol wird in der Messfehler oder Fehler. Achten Sie darauf, 95% Ethanol zu verwenden, wo gemerkt. Es ist üblich, Palmitoylcarnitin, um aus dem 95% Ethanol nach dem Auftauen des gefrorenen stock auszufällen, wodurch große Variabilität. Seien Sie sicher zum Aufwärmen der Palmitoylcarnitin Lager und Wirbel vor Gebrauch gut. Darüber hinaus kann ein sehr variables Pyruvat / Malat-Assay-Ergebnis durch die Pyruvat stock Befinden> 2 Wochen alt sein. Achten Sie darauf, gefrorenen Aliquots von Pyruvat alle 2 Wochen erneuern. Der Testlauf wurde auf 2-min-Messungen modifiziert, um mitochondriale Staatsebenen zu gewährleisten. Wenn Beobachtung der Erschöpfung der ADP gewünscht wird, kann der Forschererstrecken sich die Messzeit auf der Registerkarte "Protokoll" unter dem "Test Wizard" Forum. Schließlich tritt große Variabilität bei der mitochondrialen Lager und Mitochondrien sowie Substratlösungen sind nicht vollständig vor dem Verladen homogenisiert. Wenn Variabilität zwischen Brunnen hoch ist nach dem Testlauf, müssen Sie vollständig vor dem nächsten Versuch mischen die Substratlösung. Nie vortexen die Mitochondrien / Substratlösungen, sondern rühren, Maische, und sanft verreiben mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze.

Es gibt einige Einschränkungen dieser Technik, die erwähnenswert sind. Erstens ist die Anzahl der Vertiefungen auf der Zellkulturplatte für diese Assays verwendeten relativ niedrig ist (dh., Mit 24 Vertiefungen und die Blindvertiefungen bezeichnet mindestens 2). Wenn es gewünscht ist, alle 5 dieser Assays auf einer Platte durchzuführen, ist der Forscher nur in der Lage, die Reaktionen aus einer Maus zu einem Zeitpunkt zu untersuchen. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass 96 auch Instrumente zur Verfügung steht higher Durchsatz. Zweitens gibt es inhärente Stärken und Schwächen bei der Beurteilung mitochondriale Dysfunktion in isolierten Mitochondrien im Vergleich zu intakten Zellen ^1. Einige Schwachstellen sind mit weniger physiologische Relevanz im Vergleich zu intakten Zellen und induzieren Artefakte aus dem Isolationsprozess. Schließlich ist der Erfolg dieser Methode abhängig von der Qualität der mitochondrialen Isolationsprozesses.

Obwohl einige dieser Assays wurden entweder in verschiedenen Systemen entwickelt haben oder in anderen Tiermodellen validiert, die hier vorgestellten Verfahren sind die ersten, alle zuvor erwähnten Tests für die optimale Verwendung in einer Multi-Well-Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine mit Maus synthetisieren Skelettmuskulatur. Wichtiger ist, daß alle 5 dieser Assays mit der Menge an Mitochondrien aus ~ 75 getrennt durchgeführt werden, - 100 mg Maus Skelettmuskel, wodurch hohen Durchsatz bei geringen Material. Von großer Bedeutung ist die Fähigkeit der MultiwellSauerstoffverbrauch Technologien auf Assays mit minimalen Mengen von Mitochondrien, in Kombination mit einer optimierten Isolierungsverfahren durchzuführen, ermöglicht es dem Forscher, eine Vielzahl weiterer Experimente mit dem Rest des Skelettmuskelgewebe (z. B. Western-Blots durchzuführen, RT-PCR, enzymatische Assays, etc.), die oft ein Kampf mit diesem Tiermodell.

Abschließend können die hier vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden benötigen nur minimale Mengen von Gewebe und Mitochondrien. Einmal gemeistert werden die hierin beschriebenen Techniken können die Forscher einen potentiellen Mechanismus, einer Verbindung oder eines Genprodukts mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem üblicherweise verwendeten Tiermodell zu bestimmen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharose	Sigma Aldrich	S7903	Bei RT
lagern D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	Bei RT lagern
Kaliumphosphat einbasisch, mindestens 99,0 %	Sigma Aldrich	P5379	Bei RT aufbewahren
Magnesiumchlorid-Hexahydrat, ACS-Reagenz, 99,0-102,0 %	Sigma Aldrich	M9272	Bei RT
HEPES mindestens 99,5 % Titration	Sigma Aldrich	H3375	Store at RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	Store at RT
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	Store at 4 °
C-Säure-frei - BSA-Brenztraubensäure
, 98%	Sigma Aldrich	107360	Bei 4 & deg lagern; C
Bernsteinsäure	Sigma Aldrich	S9512	Bei RT
lagern L(-) Apfelsäure, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Bei RT
aufbewahren L-Glutaminsäure	Sigma Aldrich	G1251	Bei RT
n,n,N″,N′-Tetramethyl-p-phenylendiamin	Sigma Aldrich	T7394	Bei RT
aufbewahren 99%, Pulver [TMPD]
Palmitoyl L-Carnitinchlorid	Sigma Aldrich	P1645	Bei -20 ° C
Oligomycin A, &ge 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Bei -20 ° lagern; C
Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Bei 2 - 8 ° lagern; C
Phenylhydrazon
≥ 98% (DC), Pulver [FCCP]
Antimycin A aus Streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20 ° C
Adenosin 5′-diphosphat monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Bei -20 μg lagern; C
Rotenon	Sigma Aldrich	R8875	Store bei RT
Pierce™ BCA-Protein-Assay-Kit	Thermo Scientific	23225	N/A