Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen

Summary

Wir berichten über signifikante Verbesserungen bei der reproduzierbaren Messung von somatischen Mutationen von Dickdarmstammzellen nach Exposition von Mäusen gegenüber potentiellen DNA-schädigenden Stoffen.

Abstract

Die Fähigkeit zur Stammzellmutationen zu messen, ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um in einer kritischen Zellpopulation zu quantifizieren, ob und in welchem ​​Umfang kann eine chemische Mutationen, die möglicherweise zu Krebs führen zu induzieren. Die Verwendung eines enzymatischen Assays zur Stammzellmutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Gens zu quantifizieren wurde bereits berichtet. ¹ Dieses Verfahren erfordert die Herstellung von Gefrierschnitten und Inkubation des geschnittenen Gewebes mit einem Reaktionsgemisch, das ein ergibt blaue Farbe, wenn die Zellen produzieren funktionelle Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Enzym. Wenn nicht, werden die Zellen erscheinen weißlich. Haben wir die Reaktionsmischung unter Verwendung optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT) Medium anstelle von Polyvinylalkohol modifiziert. Dies erleichtert die pH-Messung erhöht Solubilisierung der G6PD Färbungskomponenten und schränkt die Diffusion der G6PD-Enzym. Um zu demonstrieren, dass eine Mutation aufgetreten ist in einer Stammzelle muss der gesamte Krypta G6PD enzymatische fehltAktivität. Nur wenn eine Stammzelle birgt eine phänotypische G6PD Mutation wird die gesamte Nachkommenschaft in der Krypta fehlt G6PD enzymatische Aktivität. Um Krypten mit einer Stammzelle Mutation zu identifizieren, wurden vier aufeinander folgenden benachbarten Gefrierschnitten (Stufe A) bei 7 & mgr; m Dicke geschnitten. Dieser Ansatz zur Herstellung von benachbarten Schnitten bietet Konformation, die eine Krypta wurde vollständig mutiert, da dieselbe mutierte Krypta in benachbarten Abschnitten beachten. Objektträger mit Gewebeproben, die mehr als 50 & mgr; m getrennt waren bereit waren, insgesamt> 10 ⁴ Krypten pro Maus zu bewerten. Die Mutationsfrequenz ist die Anzahl der beobachteten mutiert (weiß) Krypten durch die Anzahl der Wildtyp (blau) Krypten in einer Behandlungsgruppe ÷.

Introduction

Darmkrebs ist gedacht, um die Exposition gegenüber Umweltfaktoren und Nahrungskomponenten, die DNA schädigen kann es sich um und produzieren Aktivieren somatische Mutationen in Onkogenen (zB ß-Catenin) oder inaktivierende Mutationen im Tumorsuppressor-Gene (zB APC). Es wird angenommen, dass diese kritische Mutationen in colonic Stammzellen vorkommen. Aufgrund der einzigartigen Architektur der Krypta Kolonepithel, ist es möglich, Stammzellmutationen im Dickdarm nach dem Belichten Tiere Chemikalien Coloncarzinogenese zu bemessen. Mehrere X-chromosomal-Enzyme können als Indikatoren für die Mutationen, die in Stammzellen auftreten dienen, wie die Mutati....

Protocol

Die experimentellen Verfahren und ethische Behandlung von Tieren wurde von der University of Pittsburgh IACUC (Protokoll # 1104674) zugelassen.

1. Herstellung von G6PD Färbemischung

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der einzelnen Reagenzien ist wie folgt; 5 mM Glucose-6-Phosphat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl _2, 0,35 mM 1-methoxy-5-Methylphenazinium-Methylsulfat (MMPMS) und 0,8 mM NBT. ^1,8,9 für jedes Reagenz die anfängliche Konzentration wurde für 40 ml Endvolumen abgeleitet. Lösungen wurden frisch zubereitet und verwendet werden, jeden Tag.

1. 2 ml 200 mM pH 7,4 Phosphatpuffer (PB)....

Results

Die Fähigkeit, Kolon-Stammzellmutationen in Tieren zu messen, bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Mutationen zu Krebs Induktion korreliert. Normalerweise wird angenommen, dass der kritische Schritt bei der Karzinogenese beinhaltet aktivierende Mutationen in Onkogenen und / oder inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen. Injizierten wir C57BL / 6-Mäuse mit 200 ul PBS oder 10 mg / kg AOM in 200 ul PBS. AOM ist ein bekanntes Karzinogen Doppelpunkt. ^5-7 nach 90 Tagen wurden die Doppelpunkte für die S.......

Discussion

Oft die genotoxische Wirkung einer Verbindung wird durch ihre Fähigkeit, zu modifizieren DNA bestimmt. Dies wird normalerweise durch Isolieren der Gewebe und Messen der globalen Ebene der DNA-Addukte erfolgt. AOM wäre dies die Quantifizierung ^O 6 -Methylguanin-Addukte in den Dickdarm. Unter Verwendung dieses Ansatzes Informationen zu Schäden innerhalb bestimmter Zelltypen, wie in der Stammzellnische wird verloren. Darüber hinaus ist ein DNA-Addukt nicht das gleiche wie eine Mutation, da nur ein kleiner Teil d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenzien
Nitroblau, Tetrazolium
, NADP
, Glucose-6-phosphat
1-methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat
Dimethylformamidphosphat
, Puffer (pH 7,4
Optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT)
Ausstattung
Lichtmikroskop ausgestattet mit 5 Megapixel Kamera
, Kryostat
warmer Raum