Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen

Zusammenfassung

Quorum-Quenching-Enzyme sind antivirulente und antibakterielle Optionen, die die Pathogenese abschwächen können, ohne das Risiko einer Resistenz einzugehen, indem sie die Expression von Virulenzfaktoren und Genen verhindern, die mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung verbunden sind. In dieser Studie berichten wir über eine Methode, die die Wirksamkeit von Quorum-Quenching-Enzymen bei der Störung des bakteriellen Biofilms demonstriert.

Zusammenfassung

Das rasche Auftreten multiresistenter Bakterien hat den Bedarf an neuartigen therapeutischen Ansätzen zur Bekämpfung lebensbedrohlicher Infektionen beschleunigt. Die Persistenz einer bakteriellen Infektion ist oft mit der Bildung von Biofilmen verbunden, die durch Quorum Sensing vermittelt werden. Die Unterbrechung dieses Signalschaltkreises stellt daher eine attraktive Anti-Virulenz-Strategie dar. Es wurde berichtet, dass Quorum-Quenching-Lactonasen wirksame Disruptoren von Quorum-Sensing-Schaltkreisen sind. Es gibt jedoch nur sehr wenige Berichte über den wirksamen Einsatz dieser Enzyme bei der Störung der Bildung bakterieller Biofilme. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Unterbrechung der Biofilmbildung in einem klinisch relevanten A. baumannii S1-Stamm durch die Verwendung einer technischen Quorum-Quenching-Lactonase. Acinetobacter baumannii ist ein wichtiger humanpathogener Erreger, der weltweit an schweren Krankenhausinfektionen beteiligt ist, und seine Virulenz wird hauptsächlich auf die Zähigkeit seines Biofilms zurückgeführt. Durch die technische Lactonase-Behandlung wurde eine signifikante Reduktion des A. baumannii S1-Biofilms erreicht. Diese Studie zeigte auch die Möglichkeit, gentechnisch veränderte Quorum-Quenching-Enzyme in der zukünftigen Behandlung von Biofilm-vermittelten bakteriellen Erkrankungen einzusetzen. Schließlich kann das Verfahren verwendet werden, um die Kompetenz vielversprechender Quorum-Quenching-Enzyme zu bewerten.

Einleitung

Behandlungsmöglichkeiten für Infektionskrankheiten durch die rasche Zunahme der Multidrug-resistenten Bakterien, die immun gegen ein breites Spektrum von Antibiotika ¹ sind kompliziert. Mit hoher Morbidität und Mortalität von resistenten Bakterien-vermittelte Infektionen, gibt es einen Bedarf an Arzneimittelentwicklungsprozesse zu eskalieren und / oder entdecken bessere antibakterielle Alternativen Therapiemöglichkeiten zu verbessern. In letzter Zeit wird die anti-Virulenz Ansatz gewinnen an Interesse gegeben sein Potenzial bei der Verhinderung von Virulenz über nicht bakterizide Methoden, damit Minderung der Risiken der Resistenzmechanismen ^2.

Quorum-Sensing ist ein "Hauptschalter" in bakteriellen Virulenz und Störung dieses Signal Phänomen ist eine vielversprechende anti-Virulenz Verfahren gegen Pathogenese ^3. Der Beginn der Virulenz erfordert die Ansammlung von Quorum-Moleküle in der extrazellulären Umgebung, nachdem ein kritischer bakterielle Bevölkerungsdichte erreicht ist. Wie quorum Moleküle diffundieren in die intrazelluläre Matrix, die Bindung mit ihren verwandten Rezeptoren führt zur Aktivierung von Virulenzfaktoren sowie Gene mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung ⁴ verbunden. Im Allgemeinen Quorum-Sensing-Störung beinhaltet Hemmung Quorum Molekül und Rezeptor-Wechselwirkung, ohne die primären Stoffwechselwege. Daher spielt es keine direkten Auswirkungen auf das Zellwachstum. Da Fitness nicht beeinträchtigt wird, es eine minimale Selektionsdruck für Bakterien zu entwickeln und zu erhalten Widerstand gegen solche Behandlungen ^5. Zusätzlich kann ein Quorum-sensing Störung mit inhärenten Bakterienschutzmechanismen interferieren, wie im Fall der Bildung von Biofilmen, die Schutz gegen antibakterielle Mittel bereitstellt und Wirt-Immunantworten.

Es wird geschätzt, dass 99% der Mikroben auf der Erde existieren in komplexen Biofilm artigen Matrizes verleih entscheidende Lebensvorteil für die lebenden Mikroorganismen innerhalb these ^Strukturen 6. Noch wichtiger ist, ist die Bildung dieser sessile Domains die Ursache der hartnäckigsten und chronischer Krankenhausinfektionen ^7. Acinetobacter baumannii ist eine der wichtigsten menschlichen Krankheitserreger, die mit der globalen Krankenhausinfektionen verbunden ist und dessen Virulenz ist weitgehend auf die Quorum-Sensing zurückzuführen vermittelte Biofilmbildung ^8. Quorum-Abschrecken Enzyme erfolgreich in stören Quorum-vermittelte Signaltransduktion durch gezielt eine Gruppe von Verbindungen, wie N-Acyl Homoserinlactone (AHLs), die von Gram-negativen Bakterien ⁹ sind bekannt dafür verwendet worden. Mehrere Studien haben auch von der Verwendung dieser Enzyme erweitert, um bakterielle Pathogenese durch die Reduktion von Virulenzfaktor Expression und Zellzahlen in Biofilmen ^10,11 blockieren. Leider gibt es nach wie vor ein Mangel an greifbaren Beweis für die effektive Nutzung von Quorum-Abschrecken Enzyme gegen die Biofilmbildung durch bakterielle Erreger. dasre es Versuche, Quorum-Inhibitoren (AHL-Analoga), anstelle von Quorum-Abschrecken Enzyme verwenden, um A. zu stören baumannii Biofilmbildung ^12. Obwohl diese Methode der Verwendung von kleinen Molekülen Inhibitoren ist ein gültiger Ansatz können erhalt seine Bioverfügbarkeit in der translationalen Verwendungen eine Herausforderung sein. Im Gegenteil könnte die Verwendung von katalytischen quorum Abschrecken Enzyme die Bioverfügbarkeit Problem zu umgehen, wie Enzyme sind empfänglicher gegen Immobilisierung an Oberflächen von biomedizinischen Vorrichtungen für therapeutische Wirkungen.

Hier beschreiben wir eine Bewertung der Auswirkungen von gentechnisch Quorum lösch Lactonasen von Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ auf bakterielle Biofilmbildung, mit Kristallviolett-Färbung und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Diese Studie ist die erste erfolgreiche Demonstration von Biofilm Störung in einem klinisch relevanten A. baumannii S1-Stamm unter Verwendung Quorum lösch Enzyme. Beschriebenen Verfahrenin dieser Studie sind nützlich für die Beurteilung der Wirksamkeit anderer quorum Abschrecken Enzyme in nachfolgenden therapeutischen Entwicklungsbemühungen gegen pathogene gramnegative Bakterien.

Protokoll

1. Kristallviolett Quantifizierung von Biofilm-Bildung in A. baumannii S1

1. Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB-Medium (LB) (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / L) bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden.
2. Stellen Sie die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte _OD 600 von 0,8 auf. Verwendung eines 96-Well-Platte, zu inokulieren Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frisches LB, das 10 & mgr; l gereinigtes GKL-Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 100 ul.
3. Bereiten Sie eine Kontrollkultur als auch, Dies hat jedoch keinerlei Enzym enthalten. Wiederholen ähnlichen Bedingungen, um die gewünschte Anzahl an Wiederholungen ergeben.
4. Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Die Platte bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien.
5. Fügen Sie eine weitere 100 ul frischem LB-Medium zu der Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 21 Stunden bei 30 ° C.
6. Nach der zweiten Inkubationszeit, entfernen Sie vorsichtig alle Medien. Waschen Sie die planktonischen Bakterien-Zelle mit 200 ul sterilem Wasser. Sicherzustellen, dass es nur eine minimale Störung der Zellen während des Waschvorgangs.
7. Fügen Sie 100 ul von 1% Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei RT. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Waschen der gut mit 200 ul sterilem Wasser. Wiederholen Sie den Waschgang für zwei weitere Male.
8. 100 l 33% Essigsäure in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 15 min unter leichtem Schütteln; Dies wird den Farbstoff aufzulösen.
9. Quantifizieren der Menge des Biofilms durch Messung der Absorption des Kristallviolett bei 600 nm ausgebildet. Die Menge an Kristallviolett, ist proportional zu der Menge an Biofilm gebildet.

2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie von A. baumannii S1 Biofilm

1. Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden.
2. Anzeigenur die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte _OD 600 von 0,8 auf. Mit Hilfe eines 35-mm-Glasboden μ-Dish, zu impfen die Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frischem LB, das 30 & mgr; l des gereinigten GKL Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 1 ml.
3. Decken Sie die μ-Dish mit Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Inkubieren Sie die μ-Dish bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien. Werden 30 & mgr; l gereinigtes GKL Enzym und frisches Medium, das bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml zu bringen. Inkubation für weitere 21 h bei 30 ° C.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.3 und inkubieren Sie die μ-Dish für einen weiteren 24 Stunden bei 30 ° C. Dann entfernen Sie die Medien vorsichtig.
5. Gib 500 ul 5 ug / ml Alex Fluo 488 konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin (WGA) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit dem μ-Geschirr gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird das gebildete Biofilm färben. Entfernen Sie die Farblösung und waschen ter u-Teller mit 2 ml HBSS. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal.
6. Gib 500 & mgr; l von 3,7% igem Formaldehyd in HBSS gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird den Biofilm auf den μ-Dish beheben. Einmal Waschen Sie die μ-Dish mit 2 ml HBSS und entfernen Sie die Lösung vollständig. Die μ-Schale mit Biofilm fixiert kann in der Dunkelheit bei 4 ° C vor dem CLSM Abbildungs ​​gespeichert werden.
7. Für CLSM Bildgebung und Analyse sind 63-facher Vergrößerung und 97 Stapel pro Bild mit einem Abstand von 0,21 um pro Stapel zu erzeugen.

Ergebnisse

In der Kristallviolett Quantifizierung Experiment wurden zwei Quorum lösch Enzyme verwendet, um Machbarkeit stören Biofilmbildung zu demonstrieren: Wildtyp-GKL und eine verbesserte GKL Doppelmutante (E101G / R230C). Beide Enzyme wurde gezeigt, Lactonase-Aktivität gegen demonstrieren 3-Hydroxy-decanoyl-L-homoserinlacton (3-OH-C ₁₀ -HSL), der Haupt Quorum Molekül von A. verwendet baumannii S1 ^14. Für gültige Beurteilung der Biofilm Unterbrechung wurd...

Diskussion

In beiden Sätzen von Experiment A. baumannii S1 wurde in LB-Medium ohne NaCl weise einer hohen Salzkonzentration kann die Menge des Biofilms von den Bakterien ^{15 ausgebildet} reduzieren kultiviert. Das Vorhandensein solcher Artefakt könnte die Menge der Biofilm gebildet, sowie die Auswirkungen der Quorum-Abschrecken Enzyme in verschiedenen Behandlungsbedingungen unterschätzen. Die Verwendung einer katalytisch inaktiven Enzym ist wichtig, da eine negative Kontrolle, die möglichen Effekte der Enzymbindu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypton	BD	211705
Hefeextrakt	BD	212750
96-Well-Platte	Costar	3596
Crystal	Violet Sigma-Aldrich	C6158
Essigsäure	Lab-Scan	PLA00654X	Achtung: Entzündlich
μ-Schale	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-konjugiert WGA	Invitrogen	W11261
Hank' s ausgewogene Salzlösung	Invitrogen	141475095
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775	Vorsicht: Korrosiv
Synergy HT Mikroplatten-Reader	BioTek
1X-81 Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus