Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von exzidierten Darmgewebepräparaten oder "Darmsäcken" als ex vivo Modell der Darmbarrierefunktion. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Integrität sowohl der Epithelbarriere als auch der Schleimhautgelschicht an spezifischen Darmstellen in Tiermodellen für Verdauungserkrankungen zu beurteilen.
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Methodenartikel
Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die epitheliale Barriere ist der erste angeborenen Abwehr des Gastrointestinaltraktes und regelt selektiv Verkehr von dem Lumen zu dem darunter liegenden Gewebe Fächer, den Transport von kleineren Molekülen über das Epithel zu beschränken und nahezu vollständig zu verbieten epithelialen makromolekulare Transport. Diese Selektivität wird durch die Schleimhaut Gelschicht bestimmt, die den Transport von lipophilen Molekülen und sowohl den apikalen Rezeptoren und enge Verbindungsprotein-Komplexe des Epithels begrenzt. In-vitro-Zellkulturmodellen des Epithels sind bequem, aber als ein Modell, es fehlt ihnen die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen der Mikroflora, Schleim-Gel, Epithel und Immunsystem. Auf der anderen Seite, in vivo Beurteilung der intestinale Absorption oder Durchlässigkeit kann durchgeführt werden, aber diese Tests insgesamt Magen-Darm-Absorption zu messen, ohne Angabe von Ortsspezifität. Ex-vivo-Durchlässigkeit Tests "Darmsäcken" können; sind eine schnelle und empfindliche Verfahren entweder Gesamtdarm Integrität oder Vergleichs Transport eines spezifischen Moleküls, mit dem zusätzlichen Vorteil der intestinalen Ortsspezifität messen. Hier haben wir die Herstellung von Darmsäcken für Durchlässigkeit Studien und die Berechnung des scheinbaren Durchlässigkeit (P app) beschreiben eines Moleküls durch die Darmbarriere. Diese Technik kann als ein Verfahren zur Beurteilung der Arzneimittelabsorption verwendet werden, oder regional Epithelbarriere Dysfunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.
Einleitung
Die intestinale epitheliale Barriere des Gastrointestinaltraktes ist Bereich einer Schleimhautoberfläche bei 400 m 2 in dem erwachsenen Menschen geschätzt. Folglich wird es ständig ausgesetzt von Mikroben, eingenommene Drogen, Nährstoffe und bakterielle Toxine in Frage zu stellen. Der Host muss nicht nur zwischen tolerierbaren kommensalen Bakterien und potentielle Pathogene unterscheiden, aber müssen diese Arten und ihre sezernierten Moleküle vor der Kreuzung die Epithelbarriere, während zur gleichen Zeit ermöglicht die Aufnahme von Nährstoffen zu vermeiden. Somit ist die Rolle des Darmepithels als selektive Barriere zu der luminalen Inhalte 1 zu wirken. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch das angeborene epithelialen Abwehrsystem an der Schleimhaut, die eine reaktions biologischen System wirkt über 2 konstitutiver und induzierbarer Mechanismen aus.
Verlust von epithelialen Barrierefunktion ist eine Pathologie, die charakteristisch für eine Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen ist. In vivoPrüfung der epithelialen Barrierefunktion kann durch orale Gabe von Tracer-Molekül und anschließende Serumanalyse 3 bewertet werden. Allerdings bietet diese Technik keinen Hinweis auf den Ort der Schrankenstörung. In-vitro- und Ex-vivo-Bewertung der transepithelialen Widerstand mit Transwell-Systeme 3 und Ussing-Kammern 4,5 bzw. werden als Surrogatmarker der epithelialen Barrierefunktion häufig verwendet, aber nicht über die beitragenden Krankheit Physiologie von Tiermodellen 6. In diesem Protokoll beschreiben wir eine ex vivo Gewebepräparationsmodell, das direkte und lokale Bewertung der Darm-Integrität ermöglicht und die verwendet werden können Schleimhautbarrierefunktion in mehreren Ebenen zu beurteilen. Wichtig ist, kann diese Technik zu Tiermodellen von Krankheiten angewendet werden, oder pharmakologisch manipuliert werden kann, in der Tiefe Abfrage von Schleimhaut-Barriere Dysfunktion zu ermöglichen.
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Protokoll
Alle tierischen Arbeit in diesem Protokoll wird bei strikter Einhaltung University of Newcastle Tierethikkommission genehmigten Verfahren durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte
- Pre-warmen Medien 199 (TC199) oder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medien bis 37 ° C. Pre-Oxygenat das Medium durch mit 95% O 2/5% CO 2 sprudeln. Überprüfen Sie, ob das Medium einen endgültigen pH-Wert von 7,3 hat.
- Bereiten Faden durch Schneiden zwei 5 cm Abschnitte für jeden Sack. Schleife die Nähte in eine unverschlossene Knoten.
2. Dissection und Vorbereitung des Gastrointestinaltraktes
- Ziehen Sie feste Nahrung 12 Stunden vor der Euthanasie. Falls gewünscht, legen Tiere auf Nährgel Ergänzungen während dieser Zeit.
- Euthanize Mäusen durch Natriumpentobarbiton Überdosierung ([200 mg / Kg], intraperitoneale Injektion), gefolgt durch zervikale Dislokation nach Ethik protoSpalten und 70% Ethanol auf den Bauch und Brustkorb sprühen.
- Mit einer Schere, einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches machen und das Bauchfell aus.
- Gehen Sie zu trennen und das Entfernen des Magen-Darm-Trakt, indem der obere Dünndarm aus dem Magen in die Magenpförtner Schneiden und den Dickdarm in den analen Rand schneiden. Verwenden einer Pinzette vorsichtig auf die Gekröse entfernen. Setzen Sie den Darmtrakt in vorgewärmten, sauerstoffreiches Medium.
- Identifizieren Sie den Abschnitt des Darms, der für Durchlässigkeit (Abbildung 1) geprüft und schneiden Sie diesen Abschnitt frei von dem Rest des Verdauungstraktes.
- Um die Konsistenz zwischen den Tieren zu halten, messen Abschnitte von Duodenum und Jejunum in Bezug auf den Magen, und messen Abschnitte des Dickdarms und Ileum gegenüber dem Blinddarm.
- Wenn Gewebesegmente auszuwählen, beachten Sie das Vorhandensein von Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe wie Peyer-Plaques. Diese können als kleine Anspielung identifiziert werdenules auf der Serosa-Seite des Lumens.
- Unter Verwendung einer 1 ml Spritze, spülen sanft die luminalen Inhalte des Darmsegments in eine Petrischale mit vorgewärmtem PBS (37 ° C). Diese fäkal Inhalt kann bei entsorgt oder gelagert werden -80 ° C für zukünftige Analyse wie gewünscht.
3. Herstellung von Darm Sacs
- Bereiten einer 1 ml Spritze mit einer 300 ul Volumen der Testverbindung oder Molekül. Zur mukosalen Integrität, einer 1 mg / ml Lösung von FITC-Dextran M.Wt. 4400 verwendet werden. Sonden im Bereich von 4,400-70,000 Da in der Größe kann für eine erhöhte Empfindlichkeit verwendet werden. passen sicher ein kleines Tier Gefäßkatheter auf die Spritze.
- Maßnahme 5 cm von der Öffnung des Darm Segment und das Segment binden fest an dieser Stelle mit einer Naht-Schleife geschlossen. Sanft legen Sie eine vorgebunden Naht-Schleife um die Öffnung des Darms und die abgestumpften Katheter einsetzen. Ziehen Sie die Schlinge geschlossen, um die Darmsegment zu sichernund Loslassen der 300 ul-Volumen aus der Spritze in den Darm, so dass die gesamte Lösung eingespritzt wird.
- Sie vorsichtig den Katheter zu entfernen, während gleichzeitig die Naht Schlinge ziehen Schließung des Darmsack zu sichern. Schneiden Sie das Darmsack lose aus dem Darm und in einen 50 ml konischen Röhrchen gefüllt mit 20 ml sauerstoffreiches Medium, vorgewärmt auf 37 ° C.
4. Messung der Durchlässigkeit
- Platz konische Röhrchen, die die Darmsäcken in einem beheizten Wasserbad enthält, auf 37 ° C. Bei 0, 30, 60, 90 und 120 min Zeitpunkten, nehmen 100 ul Probe aus dem konischen Rohr und in ein 96-Well-Platte, das Volumen mit 100 ul frisches Medium in jedem Fall zu ersetzen.
- Nachdem die letzte Probe entnommen wird, aufgeschnitten Säcke an der Stelle der Naht und über die gesamte Länge des Segments, die Schleimhautoberfläche freigelegt wird.
- Messen Sie die Länge und Breite jedes Darmsegment. wenn Desirot, einfrieren Schnapp die Segmente und bei -80 ° C für Protein oder biochemischen Analyse oder alternativ Geschäft in RNA-Stabilisierung Lösung für molekulare Tests.
- Eine Standardkurve von log-Verdünnungen für FITC-markierte Moleküle von 1 bis 1 x 10 -6 bis hin.
- Messen Proben und Standards für FITC auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät, FITC Anregungs- / Emissions: 495 nm / 519 nm.
5. Berechnung der Scheindurchlässigkeit für jeden einzelnen Darm-Sac
- Konvertieren Zeiteinheiten zu sek.
- Für jeden Zeitpunkt berechnen die kumulative Konzentration, Q
Q t = (C t * V r) + (Q t Summe * V s), wo:
Q t = Kumulative Konzentration zum Zeitpunkt t
C t = Konzentration zum Zeitpunkt t
V r = Volumen auf der Empfängerseite
Q t Summe = Summe aller bisherigen Q t
Vs =Volumen abgetastet - Plot Q gegen die Zeit (T) und die Berechnung der Steigung: & dgr; Q / & dgr; t
- Berechnen Sie die scheinbare Durchlässigkeit (P app)
P app = (& dgr; Q / & dgr; t) / (A * Co), wo:
A = Fläche des Gewebes
C 0 = Anfangskonzentration
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Ergebnisse
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um regionale Veränderungen in Darmbarrierefunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen untersuchen. Durch Messung des Flusses eines parazellulären Sonde über der Schleimhautoberfläche in unterschiedlichen Bereichen des Gastrointestinaltraktes 7, die Integrität der epithelialen tight junctions beurteilt werden. Außerdem kann durch die Art der parazellulären Sonde von unterschiedlicher Größe (Abbildung 2) o...
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Diskussion
Hier haben wir die Isolierung und Herstellung von Darmsäcken detailliert Schleimhautbarrierefunktion ex vivo zu beurteilen. Darmsack Vorbereitungen sind in der pharmazeutischen Forschung genutzt, die Prüfung der Aufnahme von Wirkstoffkandidaten über den Darm in erster Linie ist. Allerdings ist dieser Test gleichermaßen gut für die Untersuchung von Darmerkrankungen geeignet. Darmdurchlässigkeit kann stark von Region und standortspezifische Bewertung der Durchlässigkeit ermöglicht ein besseres Verständnis für die...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 und einen Zuschuss des Hunter Medical Research Institute finanziert, der von Sparke Helmore/NBN Triathlon und dem Nachlass des verstorbenen Leslie Kenneth McFarlane gesponsert wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dekantel Nicht resorbierbares Seidennaht | Braintree | Scientific SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | Kein Phenolrot, da es die Fluoreszenz beeinträchtigt |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | Kein Phenolrot, da es die Fluoreszenz beeinträchtigt |
| N-Acetylcystein Sigma | Aldrich | Verwendung bei 10 mM in Medien | |
| Gefäßkatheter für Kleintiere: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4.400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20.000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70.000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
