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Methodenartikel

Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch

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DOI:

10.3791/53253

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16. April 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Alberta, 2Department of Mechanical Engineering, York University, 3Department of Civil and Environmental Engineering, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protokolle für die mikrobiologisch induzierte Calcitfällung (MICP) mit dem Bakterium Sporosarcina pasteurii werden hier vorgestellt. Das gefällte Calciumcarbonat wurde mittels optischer Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) charakterisiert. Es wird auch gezeigt, dass die Exposition gegenüber MICP die Druckfestigkeit des Schwamms erhöht.

Zusammenfassung

Die besondere Bakterium untersuchten hier (S. pasteurii) ist einzigartig in seiner Fähigkeit, unter den richtigen Bedingungen, die Hydrolyse von Harnstoff (Ureolyse) zu induzieren in natürlich Umgebungen durch Sekretion eines Enzyms Urease auftritt. Dieser Prozess der Ureolyse, durch eine Kette von chemischen Reaktionen, führt zur Bildung von Calciumcarbonat ausfällt. Dies wird als Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung (MICP) bekannt. Die richtigen Kulturprotokolle für MICP werden hier detailliert beschrieben. Schließlich wurden Experimente Visualisierung unter verschiedenen Modi Mikroskopie verschiedene Aspekte des Fällungsverfahren zu verstehen. Techniken wie optische Mikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurden die Endprodukt chemisch zu charakterisieren, verwendet. die Fähigkeit dieser Präzipitate weiter auf Poren in einem natürlichen porösen Medium verstopfen wurde, in dem Schwamm durch ein Experiment zeigte, qualitativeStäbe wurden mit einem Porennetzwerk mit einer Reihe von Längenskalen zu imitieren verwendet. Ein Schwamm bar eingetaucht in das Kulturmedium die Bakterienzellen enthält, härtet aufgrund der Verstopfung seiner Poren aus dem kontinuierlichen Verfahren der chemischen Fällung führt. Diese gehärteten Schwamm bar eine überlegene Festigkeit, wenn sie mit einem Steuer sponge bar verglichen, die unter der Wirkung eines aufgebrachten externen Last zusammengedrückt wird und komprimiert, während die ausgehärtete bar in der Lage, das gleiche Gewicht mit wenig Verformung zu unterstützen.

Einleitung

Sporosarcina pasteurii ist ein gram-positives Bakterium der Lage , in stark alkalischen Umgebungen (pH ~ 10) 1 , um zu überleben und ist einer der bakteriellen Spezies , die ein Erreger eines Phänomen kann Mikrobiologisch Induced Calcite Precipitation (MICP) 2-4 genannt. MICP ist ein Verfahren , bei dem die Ausfällung von Calciumcarbonat durch bestimmte Mikroben unter geeigneten Umweltbedingungen induziert wird. S. pasteurii hat Bedeutung in den letzten Jahren angenommen aufgrund seiner Identifizierung als mögliche Mittel für bedeutende Mengen MICP unter bestimmten Bedingungen zu induzieren. Diese Möglichkeit ergibt sich aus der Tatsache , dass S. pasteurii hat die einzigartige Fähigkeit , reichliche Mengen des Enzyms Urease absondern. Dieses Enzym wirkt als Katalysator, um einen beschleunigten Lyse von Harnstoff (ein natürlich vorkommendes biochemische Verbindung mit der weit verbreiteten und reichliche Versorgung) in Gegenwart von Wassermolekülen zu fördern. Durch eine Kaskade von Reaktionen, diesen Prozess ultimatively führt zur Erzeugung von Carbo negativ geladen. Diese Ionen, die wiederum reagieren mit positiven Metallionen, wie Calcium, um schließlich Niederschläge von Calciumcarbonat (Calcit) bilden; daher die Bezeichnung MICP 5-9.

Der Prozess des MICP ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt und 10,11 sucht. In den letzten Jahren hat sich MICP für ein breites Spektrum an technischen und umwelttechnische Anwendungen einschließlich Bottom-up - grün Bau 12, Verstärkung der Großstrukturen 13,14 und Kohlenstoffbindung und -speicherung 15,16 sucht worden.

B. et 17 Cunnigham. al entwickelt, um eine hohe Druck moderate Strömung Reaktortemperatur einen Berea-Sandsteinkern enthält. Der Reaktor wurde mit den Bakterien inokuliert S. fridgidimarina und unter Bedingungen von Hochdruck - superkritischem Kohlendioxid Injektion einer massiven Ansammlung von Biomasse in der Pore volUME wurde beobachtet, die in der Permeabilität zu mehr als 95% Reduktion geführt. 18 Jonkers und Schlangen untersuchten die Wirkung von bestimmten speziellen Bakterienstämme auf die Selbstheilungsprozess in Beton. Externe Wasser transportiert in das Porennetzwerk durch die Oberflächenporen eintritt, wird erwartet, dass die ruhenden Bakterien zu aktivieren, die wiederum strukturelle Festigkeit über MICP helfen. Tobler 19 et al. die ureolytischen Aktivität von S. haben im Vergleich pasteurii mit einem einheimischen Grundwasser ureolytischen Mikrokosmos unter Bedingungen groß angelegte MCIP Begünstigung und fand heraus , dass S. pasteurii hat eine konsistente Fähigkeit Calcitausfällung zu verbessern , selbst wenn die indigenen Gemeinschaften vor Urease - Aktivität fehlte. Mortensen 20 et.al haben die Auswirkungen von externen Faktoren wie Bodentyp, Konzentration an Ammoniumchlorid, Salzgehalt, Sauerstoffkonzentration und die Lyse von Zellen auf MICP sucht. Ihre Demonstration, dass die biologische Behandlungsverfahren ist sehr robust bzw.ect zu einer großen Variation im Parameterraum belegt die Eignung dieses Verfahrens für verschiedene Sanierungs Anwendungen in großem Maßstab eine richtige Anreicherungsprozess bereitgestellt, um die Bakterien zu verstärken vorgenommen. Phillips 21 et. al ausgelegt Experimente die Änderungen der Durchlässigkeit und Festigkeit einer Sandsäule und ein Sandsteinkern zu studieren , nachdem sie mit S. injiziert wird pasteurii Kulturen. Sie fanden heraus, dass, während die Durchlässigkeit verringert 2-4 mal während die Bruchfestigkeit dreimal erhöht.

S. pasteurii und seine Rolle in MICP sind Themen der aktiven Forschung und mehrere Probleme auf den Mechanismus der chemischen Fällung beziehen , sind noch nicht vollständig verstanden. Vor diesem Hintergrund ist es sehr wichtig , eine Reihe konsistenter standardisierte Protokolle zu haben , um genau Kultur ein entsprechend angereichert Lager von S. pasteurii MICP zu erreichen. Hier beschreiben wir ein strenges Protokoll, das die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet. Diese manuscript beschreibt die detaillierten Protokolle für S. Kultivierung pasteurii und in geeigneter Weise die Kulturmedium bereichern Fällung zu induzieren. Das Verfahren wird durch die verschiedenen mikroskopischen Techniken wie optische und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht. Der Schwerpunkt des Manuskripts ist auf den Prozess der MICP. Verfahren wie SEM und SIMS, gut etablierte Standardprotokolle sind, werden nicht gesondert beschrieben.

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Protokoll

HINWEIS: Führen Sie die experimentellen Protokolle in der folgenden Reihenfolge beschrieben. Die Bakterienkultur - Protokoll in Abschnitt 1 (siehe auch Abbildung 1) diskutiert wird. Abschnitt 2 beschreibt das Protokoll zur Anreicherung des Kulturmediums mit externen Additiven. Abschnitt 3 beschreibt die Protokolle für die Multi-Mode-Mikroskopie. Gewichte aller einzelnen Komponenten kann unter Verwendung einer Analysenwaage gemessen werden. Volumen jeder Lösung kann unter Verwendung eines volumetrischen Zylinder gemessen werden.

HINWEIS: - 2. Wenden Sie sich an institutionelle Sicherheit Büro für Details Proper Biosicherheit Protokolle müssen für die Abschnitte 1 folgen.

1. Bakterienkultur

  1. Kultur Bacteria - Agarplattenmedium Vorbereitung
    1. Montieren Sie Geräte und Zutaten wie Petrischalen, Kolben, Tris-Base, HCl, Agar, Millipore-Wasser, pH-Meter etc.Sterilize alle Behälter durch Autoklavieren bei 121 ° C vor dem Gebrauch.
    2. Vorbereitung 1 l 0,13 M wässrige Lösung von Tris-Puffer von 15,75 g Tris-Base mit 1 l Millipore Wasser vermischt. Um den pH-Wert der ursprünglichen Lösung (pH 10,4) in 2.800 & mgr; l HCl (50% Konzentration) zu senken. Überprüfen Sie kontinuierlich mit einem pH-Meter mit pH-Wert einzustellen = 9.
    3. Teilen Sie die 1 l Pufferlösung in zwei Teile wie folgt:
      1. Nehmen Sie 800 ml dieser Lösung. Teilen Sie es gleich in zwei Teile von je 400 ml. Man löst 8 g (NH 4) 2 SO 4 zu einer Lösung und 16 g Hefeextrakt zu der anderen Lösung.
      2. Nehmen Sie die restlichen (200 ml) Lösung und teilen Sie es wieder in zwei Teile von je 100 ml. Mix 2 g (NH 4) 2 SO 4 zu eins. Hinzufügen, 4 g Hefeextrakt und 4 g Agar zum anderen.
    4. Autoclave die 4 Lösungen getrennt nach der jeweiligen Kolben in Al-Folie wickeln und kleben Autoklaven Bänder.
      HINWEIS: Wenn ein Benchtop-Autoklav-Einheit verwendet wird, sollte das Volumen auf 500 ml eingestellt werden (Temperatur und Druck automatmatisch in Abhängigkeit von Volumen angegeben).
    5. Nachdem sie aus dem Autoklaven nehmen, stellen Sie die zwei 400 ml-Lösungen beiseite für Schritt 1.3.1 (unten). Mischen Sie die zwei 100 ml-Lösungen eine 200 ml Lösung. Die Mischung wurde in 10 bis 12 Petrischalen.
  2. Kultur Bacteria - Näh - Probenvorbereitung
    1. Entfernen Sie die Bakterien Lager aus dem Gefrierschrank (-80 ° C) und lassen Sie es zu tauen. richtig, legen Sie die bakterielle Lager und die Agar-Platte in einer Biosicherheits Haube Nach dem Auftauen.
    2. Wählen Sie die Mikropipette aus kleinsten Dimension (0,5 bis 10 & mgr; l ist eine gute Wahl) , um die Spitze mit dem Sporosarcina pasteurii Lager zu verseuchen. Streak eine Agar-Platte mit der Mikropipettenspitze. Legen Sie die Strähnen-Agar-Platte in einem nicht-Schüttelinkubator bei 31 ° C für 48 Stunden.
    3. Nach 48 Stunden, um die Platte aus dem Inkubator entfernen und visuell auf die Existenz von Einzelkolonien zu untersuchen. Wenn es keine einzelne Kolonien sind, legen Sie sie dann in ter Inkubator für weitere 24 Stunden.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang, bis einzelne Kolonien festgestellt werden. Nicht mehr als 7 Tagen nach der Studie.
      HINWEIS: Wenn einzelne Kolonien nicht einmal nach einer Woche erscheinen, dann wird der Schluss gezogen, dass die Schritte nicht ordnungsgemäß und der gesamte Prozess muss wiederholt werden Schritt 1 gefolgt.
  3. Kultur Bakterien - Schlussprobenvorbereitung
    1. Mischen Sie die zwei 400 ml - Lösungen (Tris - Puffer + (NH 4) 2 SO 4 und Tris - Puffer + Hefeextrakt (1.5.1) zusammen eine 800 ml Lösung zu erhalten. Übertragen 125 ml dieser Lösung in einem Kolben.
    2. Durchführen einer Sichtprüfung der Oberfläche der Agarplatte Regionen mit hoher Konzentration von Einzelkolonien zu identifizieren. Sanft schubsen und mit einer Mikropipette Spitze einer der Kolonien brechen.
    3. Tauchen Sie die gleiche Mikropipettenspitze in den 125-ml-Kolben und rühren Sie es gründlich, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen für eine robuste Multiplikation, um sicherzustellen, übertragen bekommen. Der Kolben wird in einem Schüttelinkubator bei 150 Umdrehungen pro Minute, 30 ° C für 2 - 3 Tage. Nach 2 - 3 Tage, wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen.
  4. Kultur Bakterien - Schluss Cell Count
    1. Führen Sie serielle Verdünnung des nicht verdünnten Kulturlösung PBS unter Verwendung einer Verdünnung von mindestens zehn Millionen (10 -7) zu erreichen zählbaren einzelne Kolonien zu gewährleisten , erscheinen. Zeichne sieben parallele äquidistante Linien auf einer der Agar-Platten.
      1. Tun Sie dies durch fette Linien auf der Unterseite der Petrischale, prominent genug Zeichnung von oben sichtbar sein. Tropfen-3 kleine Tropfen von nicht-verdünnte Lösung in einem Segment. 1 ml der unverdünnten Lösung auf 9 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) mit einer Verdünnung von 1:10 zu erhalten.
    2. Nehmen Sie eine kleine Teilmenge (~ 0,1 ml) dieser neu verdünnte Lösung mit einer Pipette und Drop 3 weitere kleine Tropfen auf den nächsten Abschnitt. Übertragung der neu verdünnten Lösung in einen neuen Kolben und weiter verdünnt zehnmal (10x) durchZugabe von PBS. Dadurch verringert sich die Verdünnung auf 10 -2 oder 1: 100.
      1. Verwenden Sie diese 1: 100-Lösung in den nächsten Abschnitt. Wiederholen Sie diesen Vorgang er mit kleinen Volumina der frisch verdünnten Lösungen verarbeiten , indem nacheinander an neue Kolben übertragen und kontinuierlich verdünnt das Zehnfache (10x) im Tandem mit PBS mehr und mehr verdünnte Proben von 10 -3 oder 1 zu erhalten: 1000 den ganzen Weg bis zu 10 -7 oder 1.10 Millionen in das letzte Segment.
    3. Führen Colony-Forming Unit (CFU) Plattenzahl die Anzahl der Zellen in der Agar-Platte zu zählen, nachdem die Platte für 1 Inkubation - 2 Tage bei 31 ° C. Dies ergibt ein quantitatives Maß für die Bakterienzahl in der unverdünnten Probe.
      HINWEIS: Die CFU-Wert gemessen wird, basierend auf der Fähigkeit des Systems, Anlass zu Kolonien unter den spezifischen Bedingungen des Nährmediums zu geben, die Temperatur und die Zeit unter der Annahme, dass jede Kolonie getrennt ist und durch eine einzige lebensfähige mikrobielle Zelle gegründet.
    4. Dichtungdie Petrischalen mit selbstdichtenden Film und speichern verbleibenden Elemente in einem Kühlschrank für die zukünftige Verwendung.

2. Protokoll zur Anreicherung von Nährstoffen Precipitation zu beschleunigen

  1. Transfer 9 ml der hergestellten Kulturflüssigkeit (Zellen + Medium) in mehrere sterilisierten Zentrifugenröhrchen, die jeweils 10 ml Volumen.
  2. Bereiten Sie eine 100 ml-Stammlösung der externen Anreicherung bestehend aus vier Komponenten in den folgenden Konzentrationen in frischem Medium: Harnstoff: 2 g / l, Ammoniumchlorid: 1 g / l, Natriumbicarbonat: 212 mg / l, Calciumchlorid: 280 mg / L. messen Sie sorgfältig alle Zutaten einer Analysenwaage mit und im Autoklaven (121 ° C, 15 psi, 15 min) alle, aber Harnstoff mit frischem Medium in einem Becherglas und Ort mischen.
    1. Nach Autoklaven, mischen, um die erforderliche Menge an Harnstoff (2 mg) mit 1 ml frischem Medium und durch eine Spritze mit 0,22 um Spritzenfilter ausgestattet, um den Prozess der Anreicherung abzuschließen.
    2. 1ml dieser Anreicherungsmedium mit Additiven zu den 9 ml der Flüssigkeit hergestellten Kultur enthält Zentrifugenröhrchen sterilisiert (Zellen + Medium) (siehe Schritt 2.1).
      HINWEIS: all dieser Komponenten, Harnstoff bei erhöhten Temperaturen abbaubar, nicht in einem Autoklaven sterilisiert werden. Daher wird, nachdem die anderen Bestandteile autoklaviert wurden (121 ° C, 15 psi, 15 min) wird Harnstoff zuletzt zugegeben durch einen 0,22 & mgr; m Spritzenfilter.
  3. Vortex jedes Rohr eine mechanische Vortexer gründlich mit. Legen Sie die angereicherten Flüssigkeiten (Zellen + Medium + Additive) in einem nicht-Schüttelinkubator bei 30 ° C. Überwachen Sie alle Einheiten regelmäßig für die Initiierung der Fällung. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, beginnen mikroskopische Beobachtungen einmal Einsetzen der Präzipitation mit dem bloßen Auge festgestellt wird. Dies ist in der Regel zwischen 30 bis 36 Stunden nach dem Beginn der Versuche.

3. Protokoll für Multi-Mode-Mikroskopie

  1. Übertragen ein kleines Volumen (ca. 1 ml) der Flüssigkeit zu einem Hoch magnificatIonenmikroskopie-chambered Abdeckglas System ersten Beobachtungen mit Hellfeld-Modus auszuführen. Um damit zu beginnen, starten alle Beobachtungen mit der geringsten Vergrößerung (4X). das bietet eine breite Bereich der Abdeckung und damit globale Informationen über die Verteilung von Niederschlägen.
  2. Wählen Sie bestimmte Bereiche mit erheblichen Mengen von Ausfällungen und vergrößern (20X, 40X, 60X) durch schrittweise die Vergrößerung zu erhöhen.
    HINWEIS: Da es unmöglich ist, um richtig die Zellen aus dem extrazellulären polymeren Substanz (EPS) unter Hellfeld (aufgrund sehr nahe Brechungsindizes) zu lösen, schalten Sie Phasenkontrast-Modus bei Bedarf. In diesem Modus sind nur die Umrisse der Zellmembranen (eine andere Phase als die bulk Zelle ist) sichtbar ist, wodurch optische Differenzierung ermöglicht.
  3. Schließlich färben einige Kammern mit Live / Dead-Färbung, die selektiv die Live-Komponenten als grüne Farbstoffe, während die toten Komponenten in roten Färbung. Siehe Standardprotokolle 28 </ Sup>.
  4. Schalten Sie Fluoreszenzmodus richtig zwischen den roten und grünen Bereichen unterscheiden. Red (Red Filterwürfel mit Anregungswellenlänge von 540 bis 580 nm dichroitische Spiegel von 595 nm und Sperrfilter von 600 bis 660 nm) und Green (GFP Langpassgrünfilterwürfel mit Anregungswellenlänge von 440 bis 480 nm dichroitische Spiegel 505 nm und Sperrfilter von 510 nm) Filterwürfel verwendet Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zu erleichtern.
  5. Sobald alle Multi-Mode-Daten wurden gesammelt, wählen Sie die besten Bilder und manuell Overlay (individuelle Hellfeld, Phasenkontrast und Fluoreszenz-Bilder), um den bestmöglichen Kontrast und Klarheit zu erhalten.
  6. Führen Sie SEM auf den getrockneten festen Proben Kristallstrukturen zu verstehen. Dies ist ein gut etabliertes und Standardverfahren. 22 Führen XPS chemischen Signaturen von funktionellen Gruppen (Carbonate) zu identifizieren. Dies ist ein gut etabliertes und Standardverfahren als auch. 23

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Ergebnisse

S. pasteurii ein alkali 24 sein kann relativ harten Bedingungen überleben. Wenn das oben erwähnte Kulturprotokoll folgt, und S. pasteurii ist innerhalb einer Kammer gezüchtet, die Bakterien führt zur Ausfällung von Calciumcarbonat über die Zeit (2A), Fig . 2 (b) zeigt eine Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahme der bakteriellen Zellpopulation innerhalb des Kulturmediums. Einzelne Zellen können klar unters...

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Diskussion

Kritische Schritte: Dieses Manuskript beschreibt detailliert die Protokolle für die Kultivierung einer tragfähigen Probe von S. pasteurii. Sobald die Kultur bereit gemacht worden ist, muss es in geeigneter Weise angereichert werden. Dies ist ein wichtiger Schritt , entscheidend für den Erfolg des Experiments , weil ein Fehler die richtige chemische Umgebung zu schaffen , führt entweder zu sehr langen Zeitskalen von Ausfällen oder einem vollständigen Fehlen derselben. S. pasteurii ist s...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den Partnern in der Helmholtz-Alberta Initiative, der Helmholtz-Gemeinschaft und der University of Alberta für die Unterstützung, die sich aus der Teilnahme an dieser Zusammenarbeit ergibt. Die Forschungsförderung erfolgt durch den Impuls- und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft, die beteiligten Helmholtz-Zentren sowie durch die Regierung von Alberta über das ecoTrust-Programm von Alberta Environment.

Dr. Tanushree Ghosh ist dankbar für ihre kritischen Beiträge in einer Reihe von entscheidenden Phasen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PetrischaleFisher ScientificFB0875712Petrischalen werden als Agarplatte verwendet
Pyrex KolbenFisher ScientificS63268Corning Erlenmeyer
Tris-BasePromegaH5133wird zur Herstellung von Tris-Buffer
Salzsäureverwendet Sigma-AldrichH98921,0 N, Bioreagenz, geeignet für Zellkulturen
Agar PulverSigma-AldrichA1296Mikrobiologie getestet, Pflanzenzellkultur getestet, Zellkultur getestet, Pulver
AmmoniumsulfatSigma-AldrichA4418für die Molekularbiologie
HefeextraktpulverSigma-Aldrich51475
MesszylinderCole-ParmerCP08559GCCole-Parmer Klasse A Messzylinder mit Cal Cert,TC; 1.000 ml,1/Pk
AnalysenwaageOHAUSAX124Ezur Messung des Gewichts von Reagenzien
AutoklavBrinkmann58619000
AutoklavenbandVWR52428864
AluminiumfolieSigma-AldrichZ185140zur Versiegelung des Kolbens vor dem Einfüllen in den Autoklaven
BakterienschaftCedarlan11859-80 Grad C-Bestand an S. pasteurii, ATCC-Nr. wird gegen Kat. Nein.
Mline Einkanal-Mechanikpipetten mit variablem VolumenBiohit725010Vermarktet von VWR unter der Katalognummer 14005976
MikropipettenspitzeFisher Scientific212772BWird zum Kratzen von Agarplatten
verwendet Inkubator Binder80079098Mikrobiologie-Inkubator, Schüttelinkubator der BF-Serie
VWR14004300VWR Signature Tischschütteln Inkubatoren
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichP7059
BD Falcon Express Pipettierhilfe PipettiergerätBD Biosciences357590Vermarktet von VWR unter der Katalognummer
53106220 ParafilmSigma-AldrichP7793Zur Versiegelung von Agarplatten
HarnstoffSigma-AldrichU1250Anreicherung für Nährmedium
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS8875Anreicherung für Nährmedium
CalciumchloridSigma-AldrichC1016Anreicherung für Nährmedium

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Urease EnzymHarnstoffhydrolyseLichtmikroskopieRasterelektronenmikroskopieR ntgenphotoelektronenspektroskopiePorenverstopfungBakterienkulturPhasenkontrastbildgebung
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