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Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

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DOI:

10.3791/53268

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13. November 2015

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1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine neuartige Technik, die den Nachweis der intrazellulären Genexpression nach Endozytose von fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln direkt in lebenden Zellen ermöglicht. Die Methode erfordert keine Manipulation der Zellen und ist in Bezug auf das Zielgen oder die Zielspezies nicht eingeschränkt.

Zusammenfassung

Die Reprogrammierung von somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) wurde erfolgreich bei verschiedenen Säugetierarten durchgeführt, darunter Maus, Ratte, Mensch, Schwein und andere. Die Verifizierung von iPS-Klonen beruht hauptsächlich auf dem Nachweis der endogenen Expression verschiedener Pluripotenzgene. Diese Gene stellen meist Transkriptionsfaktoren dar, die sich im Zellkern befinden. Traditionell wird der Nachweis ihrer endogenen Expression durch immunhistochemische Färbung nach Fixierung der Zellen erbracht. Dieser Ansatz erfordert die Replikation von Kulturen jedes Klons in diesem frühen Stadium, um validierte Klone für weitere Experimente zu erhalten. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen Ansatz mit genspezifischen Nanopartikeln, der es ermöglicht, die intrazelluläre Genexpression direkt in lebenden Zellen durch Fluoreszenz zu bewerten. Die Nanopartikel bestehen aus einem zentralen Goldpartikel, das an einen Fängerstrang gekoppelt ist, der eine Sequenz trägt, die zur Ziel-mRNA komplementär ist, sowie einem abgeschreckten Reporterstrang. Diese Nanopartikel werden aktiv endozytiert und die Ziel-mRNA verdrängt den Reporterstrang, der dann zu fluoreszieren beginnt. Daher kann die spezifische Expression von Zielgenen direkt unter dem Mikroskop nachgewiesen werden. Darüber hinaus ermöglicht die emittierte Fluoreszenz die Identifizierung, Isolierung und Anreicherung von Zellen, die ein bestimmtes Gen exprimieren, durch Durchflusszytometrie. Diese Methode kann direkt auf lebende Zellen in Kultur angewendet werden, ohne dass die Zielzellen manipuliert werden müssen.

Einleitung

Im Jahr 2006 wurde ein neuer Ansatz beschrieben somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand neu zu programmieren. Vorabsiebung einer Anordnung von potentiellen Reprogrammierungsfaktoren murine Fibroblasten konnten sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die durch retrovirale Transduktion und die Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren erfolgreich umgewandelt werden (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Anschließend wurde diese Technik effektiv mit somatischen Zellen von verschiedenen Säugetierspezies, einschließlich Menschen, 2, 3 Affen, Ratten, 4, 5 Hunde, Schafe und Schweine 6 7 reproduziert worden. Darüber hinaus modifiziert Protokolle Weglassen oder Austausch des potentiell onkogenen Transkriptionsfaktor c-myc veröffentlicht wurden 8, 9.

Unabhängig von der Anfangs Umprogrammierung Ansatz die wahre Pluripotenz der wachsenden Kolonien muss bestätigt werden, eine mühsame und zeitraubende Aufgabe. Ein Hauptnachteilder Mehrheit dieser Analysen ist, dass sie nicht an lebenden Zellen durchgeführt werden. Etabliert Pluripotenz Faktoren wie OCT4, SOX2, NANOG oder REX1 repräsentieren Transkriptionsfaktoren im Zellkern befindet und deren Nachweis erfordert Fixierung der Zellen vor der für die RT-PCR-Analyse 10 Immunhistochemie oder Zelllyse. - 12 Danach werden diese Zellen für die Zukunft verloren Experimente Replika-Kulturen jeder Kolonie erforderlich ist.

Somit ist eine Technologie zur Pluripotenz an lebenden Zellen analysieren, sehr wünschenswert. Verschiedene Ansätze können in der Tat direkt an lebenden Zellen unter Verwendung von Antikörpern, die gegen membranbasierten Antigene durchgeführt werden (z. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluoreszierende Farbstoffe berichtet an alkalische Phosphatase 13 oder kleine Moleküle, die spezifisch zu markieren embryonale Stammzellen zu erkennen (ES) und iPS-Zellen 14. Allerdings könnten die Antikörper dennoch negativ auf die Zellen und jede Method auf eine einzige Pluripotenz Marker beschränkt. Schließlich Fluoreszenz Molecular Beacons, Dual-Antisense-Oligonukleotide mit Haarnadelstrukturen, die Live-Färbung von Zellen zu ermöglichen, wurden beschrieben, 15. Obwohl dieser Ansatz für viele Gene angewendet werden, erfordert die Technik Nukleofektion einer Einzelzellsuspension, die nicht für wachsende iPS Kolonien.

Ein paar Jahre her Gen-spezifischen Nanopartikel wurden beschrieben, um Survivin Expression in menschlichen SKBR3 Brustkrebszellen 16 zu analysieren. Diese Handschrift beschreibt ein neues innovatives Konzept für die Erfassung Pluripotenzmarker in Live-ES und iPS-Zellen durch die Verwendung von Gold-Nanopartikel-Konjugate. Diese Nanopartikel bestehen aus einer zentralen Goldpartikel mit einem gekoppelten Abfangstrang Durchführung der komplementären RNA-Sequenz und ein Cy3-markiertem Reporterstrang. Das Fluoreszenzsignal des Reporterstrang wird von der zentralen Goldpartikel abgeschreckt. Darüber hinaus empfiehltNanopartikel dienen als negative und positive Kontrollen, bzw. (Abbildung 1). Für eine Anwendung, die Nanopartikel sind einfach zu dem Kulturmedium (Abbildung 2) aufgenommen und in die Zellen über Endozytose (Abbildung 3). Wenn die Ziel-RNA exprimiert wird, verdrängt es das Reporterstrang, der dann ein Fluoreszenzsignal emittiert. Dieses Verfahren erfordert keine Manipulation der Zielzelle und die Expression des Zielgens kann optisch unter einem Fluoreszenzmikroskop direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Ferner kann die Technik auf jeden gewünschten Ziel-Gens zwischen den Arten bei iPS Zellen angewendet werden, und somit kann in vielen verschiedenen Forschungsgebieten verwendet werden. Schließlich durchflusszytometrischen Analysen ermöglichen die Identifikation und Anreicherung von Cy3-positiven Zellen.

Protokoll

1. Herstellung von Medien, Reagenzien und Zellkulturbedingungen

  1. Menschliche HEK 293 embryonale Nierenzellen
    1. Kultur HEK-293-Zellen (CRL-1573 ATCC) in DMEM / Ham F-12-Medium mit 5% FCS, L-Glutamin (2 mM) und Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 ug / ml) ergänzt.
    2. Um den Durchgang der Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fügen 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Transfer Zellen in eine 15-ml-Tube, Zentrifuge für 5 min bei 1200 UpM (300 × g) und übertragen Sie etwa 5x10 5 Zellen in ein frisches T25 Kulturflasche.
  2. Murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs)
    1. 1 ml einer 0,1% igen Gelatinelösung, um einzelne 6-Vertiefungen und Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde. Flüssigkeitsaufnahme und lagern bei RT bis zur Verwendung.
    2. Kultur MEFs in DMEM, ergänzt mit 10% FCS, L-Glutamin (2 mM), L-Glucose (4,5 g / l), Natriumpyruvat (1 mM) und Penicillin (100 U /ml) / Streptomycin (100 ug / ml) auf Gelatine-beschichteten 6-Well-Platten.
    3. Verteilen MEFs in 6-Well-Platten und lassen Sie sie bis zur Konfluenz wachsen. Hinzufügen Mitomycin (5 ug / ml) für 2,5 h auf Zellen arretieren. Absaugen Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit kompletten MEF Medium und 3 ml MEF Medium zu jedem 6-well. Diese Zellen dienen als Feeder-Schicht für Maus und Schwein iPS-Zellen.
  3. Kultur von Maus-ES und iPS-Zellen
    1. Maus-ES-Kulturmedium herzustellen, zu ergänzen DMEM-Medium mit 15% FCS, L-Glutamin (2 mM), L-Glucose (4,5 g / l), MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (1X), β-Mercaptoethanol (0,1 mM) und Leukämie-Hemmfaktor (1,000 U / ml).
    2. Spülen Sie 6-Wells mit Wachstum verhaftet MEFs einmal mit serumfreiem DMEM, 2 ml Maus-ES-Mediums und Maus-iPS-Zellen (20% der Zellen einer konfluenten Schale). Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM und 2 ml frischem Maus-ES-Medium.
    3. Um den Durchgang der Zellen, waschen Sie jedes Well einmal mit serumfreiem DMEM, fügen 00,25% Trypsin / EDTA und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Übertragungszellen in einen 15-ml-Röhrchen, Zentrifuge 5 min bei 1200 rpm (300 x g), Die Zellen in 500 & mgr; l Maus-ES-Medium und Zugabe von 100 ul der Suspension auf 2 ml Maus-ES-Medium in eine frische 6 Vertiefungen mit einer MEF Feeder-Schicht.
  4. Kultur von Schweine iPS-Zellen
    1. Schweine iPS Medium herzustellen, ergänzen DMEM / Ham-F-12-Medium mit 20% KO Serum, L-Glutamin (2 mM), MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (1x), β-Mercaptoethanol (0,1 mm), und Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 ug / ml). Man filtriert durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C für 2 bis 3 Wochen. Bei der ersten Verwendung, fügen bFGF (10 ng / ml Endkonzentration).
    2. Spülen Sie 6-Wells mit Wachstum verhaftet MEFs einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml Schweine iPS mittleren und Schweine-iPS-Zellen (10% der Zellen einer konfluenten Schale). Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml frisches Schweinefleisch iPS Medium.
    3. Zur Vorbereitung Dissoziationspuffer hinzuzufügen 2,5% Trypsin, Collagenase IV (10 mg / ml), K.-o.-Serum (20%) und CaCl 2 (1 mM), um Ca 2+ -freier PBS. Wasche die Zellen zweimal mit PBS und Inkubation mit Dissoziationspuffer für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Übertragungszellen in einen 15-ml-Röhrchen, Zentrifuge 5 min bei 1200 rpm (300 x g).
    4. Resuspendieren Schweine iPS-Zellen in 500 ul frischem Schweinefleisch iPS Medium und 50 & mgr; l der Suspension auf 1,5 ml Schweine iPS-Medium in einem frischen 6 Vertiefungen mit einer MEF Feeder-Schicht. Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml frisches Schweinefleisch iPS Medium.
  5. Feeder-freie Kultur des menschlichen iPS-Zellen
    1. Auftauen Originalflasche, die die Basalmembran der Zubereitung bei 4 ° C und verdünnt mit eiskaltem Serum-freiem DMEM / Ham-F-12 auf 8 mg / ml, aliquoten und bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    2. Tauwetter ein Aliquot der Basisment Membranpräparation bei 4 ° C und mit eiskaltem Serum-freiem DMEM / Ham-F12 (90 ug / ml) zu verdünnen. Pipette 1 ml dieser Lösung wird in 3 cm Kulturschalen und gut mischen, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Siegel Gerichte mit Parafilm und bei 4 ° C bis zu einer Woche. Vor der Verwendung für die Zellkultur inkubiert Geschirr für 30 min bei 37 ° C oder 3 Stunden bei Raumtemperatur, um eine Polymerisation der Basalmembran Herstellung ermöglichen.
    3. Saugen Sie Medium aus Gerichten mit der Basalmembran Zubereitung beschichtet und waschen zweimal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12. 1,5 ml E8 Medium in die Kulturschale und Human iPS (10% der Zellen einer konfluenten Schale). Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml frisches Medium E8.
    4. Um den Durchgang der Zellen, spülen Geschirr zweimal mit PBS und 1 ml PBS / 0,5 mM EDTA. Das Geschirr Inkubation für 5 min bei RT. Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Hinweis: Wenn die Kolonien beginnen, runden und appear, um Löcher, die sie für die Übertragung bereit sind zu haben.
    5. Saugen Sie die Flüssigkeit, fügen Sie 1,5 ml E8 Medium und nehmen Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren. Übertragungszellen in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge 5 min bei 1200 rpm (300 x g), resuspendieren in 500 & mgr; E8 Medium und 50 ul der Suspension zu 1,5 ml E8 Medium in einem frischen Kulturschale mit der Basalmembran Zubereitung beschichtet .

2. Design von Target-Sequenzen über Artgrenzen Borders

  1. Auswählen des Referenz Menschen, Mäusen und Schweinen cDNA-Sequenzen der Zielgene (GAPDH, NANOG, GDF3) und führen eine CLUSTAL Multisequenz-Alignment-Analyse.
    Hinweis: Dadurch werden die homologen Sequenzen zwischen den Arten anzugeben.
    1. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für mehrere Ausrichtung: Lückenstrafe (fest) 10, Lückenstrafe (unterschiedlichen) 5, Übergangsgewichtung 0, Spalttrennung Strafe Bereich 8% Identität für die Verzögerung 40, um eine maximale Anzahl von Iterationen durchzuführen 3.
  2. Senden gewünschten Zielsequenzen an den Hersteller (siehe Tabelle der Materialien) für die Sonden Konstruktion und Fertigung.
    Hinweis: Der Hersteller bestätigt dann die Kompatibilität der gewünschten mit der Technologie-Sequenz. Falls gewünscht Sequenz nicht kompatibel ist, wird der Hersteller alternativer Sequenzen vor.
    1. Sicherzustellen, dass die homologen Regionen, die verwendet werden können als potentielle Abfangstrang Sequenzen eine Länge von 27 bp.
      Anmerkung: Es ist ratsam, mehrere Nanoteilchen mit unterschiedlichen Abfangstränge für eine ausgewählte Zielgens zu bestellen als nur der Real zellulären Experiment wird ein definitiver Beweis der Funktionsfähigkeit einer einzelnen Sequenz zu ergeben. Daher wurden zwei verschiedene Sequenzen für GAPDH und GDF3 ausgewertet, während drei verschiedene Nanopartikel wurden getestet, um NANOG Ausdruck auszuwerten. Ihre Lage und die genauen Sequenzen wurden an anderer Stelle 17 erschienen. Der Hersteller kommerziell produziert die NanOpGegenstände mit gewünschten Sequenzen und stellt sie in lyophilisierter Format.

3. Rekonstitution der Nanopartikel und Zusatz Zellkulturen

  1. Speichern lyophilisierten Nanopartikel nach Eingang bei 4 ° C im Dunkeln.
  2. Rekonstituieren Nanopartikel durch Zugabe von 50 & mgr; l doppelt destilliertes Wasser, das eine Endkonzentration von 100 nM ergibt. Nach der Rekonstitution store Nanopartikel bei RT im Dunkeln. Anmerkung: Unter dieser Bedingung sie für mindestens ein Jahr stabil sind. Lagerung der rekonstituierten Proben bei 4 ° C kann sich negativ auf die Stabilität.
  3. Pre-Verdünnung des Nanopartikels Stammlösung mit PBS auf eine Konzentration von 2 (HEK 293-Zellen) oder 8 nM (iPS und ES-Zellen) am Tag der Anwendung. Anmerkung: Diese Konzentration ist 20-fach höher als die Endkonzentration in der Kulturschale. In ES-Zellen und iPS-Zellen, 400 pM von Nanopartikeln induziert ein Fluoreszenzsignal unter dem Mikroskop leicht nachweisbar. Für HEK 293 Zellen, acONZENTRATION von 100 pM ist ausreichend.
  4. Pipette 12,5 ul vorverdünnt Nanopartikel zu einer 24-Well enthält 237,5 ul vollständigen Zellkulturmedium. Für Brunnen in verschiedenen Größen, passen die Volumina. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel zu gewährleisten. Die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre über Nacht inkubieren (O / N) bei 37 ° C und 5% CO 2.
  5. Am nächsten Tag analysiert Zellkulturen zur genspezifischen Cy3-Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 546 nm (Emission 575 - 640 nm) unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der benötigte, um eine ausreichend starke Fluoreszenz zu erhalten, können auf dem Zelltyp und dem Zielgen abhängen Periode. In diesen Experimenten wurde diese zwischen 16 und 20 Stunden nach der Anwendung der Sonde gesehen.

4. Bezeichnung des Cy3 Positive Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie

  1. Wachsen HEK 293 oder Maus-ES-Zellen unter Verwendung der Bedingungen in Abschnitt 1.1 oder 1.3 angegeben, respectively. Einen Tag vor der FACS-Analyse hinzuzufügen GAPDH-spezifischen Nanopartikel in unterschiedlichen Konzentrationen an HEK 293-Zellen (siehe 6A) und bei 400 pM bis ES-Zellen murinen. Die Zellen O / N in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Analyse von Zellkulturen für die genspezifische Cy3 induzierte Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop.
  3. Trennen HEK 293 Zellen, wie unter Punkt 1.1.2 angegeben. Zentrifuge, übertragen in 200 ul eiskaltem PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA (FACS-Puffer) in ein 1,5-ml-Tube und resuspendieren. Halten Zellen Dunkeln auf Eis, bis Durchflusszytometrieanalyse.
  4. Trennen murine ES-Zellen, wie unter Punkt 1.3.3 angegeben. Zentrifuge, Transfer in ein 1,5-ml-Tube und resuspendieren in 200 ul eiskaltem PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Halten Zellen Dunkeln auf Eis, bis Durchflusszytometrieanalyse.
  5. Drücken Sie die Zellen durch ein 30 um-Filter, um die Zellaggregation zu verhindern und fügen Propidiumiodid (2 ug / ml Endkonzentration) 2 minvor der FACS-Analyse, um tote Zellen auszuschließen.
  6. Um Cy3-positiven Zellen ersten Hierarchie Tore auf dem FSC-A / SSC-eine Teilmenge eingestellt zu analysieren, die FSC-H / FSC-W-Untergruppe und die SSC-H / SSC-W Teilmenge. Verwenden Sie die Vorwärts- und die Seitenstreuung, um Zelltrümmer und Zellen, die nicht zerstreut sind auszuschließen. Ausschließen toten Zellen durch ihre Propidiumiodidfärbung Anzeige von PE gegen PE-Texas Red. Führen Sie die abschließenden Sortier Tor auf Cy3-PE-positiven Zellen (Abbildung 4).

Ergebnisse

In einem ersten Versuch überprüft und fest der intrazellulären Nachweis spezifischer Genexpression in lebenden Zellen unter Verwendung von Nanopartikeln haben wir beschlossen, Pilotversuche mit einer konstitutiv exprimiert house-keeping-Gen (GAPDH) in der menschlichen HEK 293 Zellen durchzuführen. Die Konzentration der Nanopartikel in diesen Experimenten verwendet wurde entsprechend der Empfehlung des Herstellers gewählt. Die Zugabe eines GAPDH-spezifischen Sonde an das Kulturmedium in einer 100 pM Endkonzentration induziert eine klare Cy3-Fluoreszenz dieser Zellen, die sichtbar unter einem Fluoreszenzmikroskop nach O / N Inkubation (5A) war. Zwei Kontrollen wurden in diesen Experimenten eingeschlossen, um das Ergebnis zu untermauern. Eine Steuer besteht aus einem sogenannten "scramble" Nanopartikel wo der Reporterstrang keinen entsprechenden Sequenz in Säuger- oder eukaryontische Zellen. Der "Wettlauf" Nanopartikel bestimmt die unspezifische Hintergrund fluorescence aufgrund möglicher Sonde Zersetzung oder unvollständige Löschung der Fluoreszenz. Die Zugabe des Scramble-Sonde ergab eine nur geringe Fluoreszenzsignal, was vernachlässigbar ist (5B). Ein fest fluoreszierende "Aufnahme" control hilft, die Fähigkeit der Zellen, um die Nanopartikel durch Endozytose, die zwischen verschiedenen Zelltypen variieren können integrieren bestimmen. Diese positive Kontrolle Partikel produziert ein helles Fluoreszenzsignal in HEK 293 Zellen (5C). Somit wird die Machbarkeit der Technologie, um eine spezifische Fluoreszenzsignal eines intrazellulären Gen mit einem vernachlässigbaren Hintergrundsignal aufgezeichnet wurde bestätigt. Es muss erwähnt werden, dass die Differenz zwischen dem Hintergrundsignal und die spezifische Fluoreszenz mit der Zeit abnimmt. Die Hintergrund erhöht sich durch Zersetzung oder unvollständige Abschrecken zu sondieren, während die spezifische Fluoreszenz verblasst allmählich (5D). Die gleichen GAPDH-spezifischen Nanopartikelwurde in primären Fibroblastenkulturen von Maus, Schwein und Schaf Ursprungs 17 getestet. Diese Zellen erzeugen eine viel höhere Hintergrundsignal als HEK 293-Zellen, während die Ziel-spezifischen Fluoreszenz ziemlich schwach ist, möglicherweise aufgrund der relativ niedrigen proliferative Kapazität dieser Kulturen.

Diese Pilotexperimente veranlasste uns, diese Technologie zum Nachweis von Pluripotenz Genexpression in iPS von verschiedenen Spezies ableiten, verwenden. Hierzu NANOG und GDF3 analysiert wurden, die beide dafür bekannt, in pluripotenten Zellen 18 ausgedrückt werden. Auf den ersten iPS-Zellen aus Schwanzspitze Fibroblasten eines Nkx2.5 Herz Enhancer transgene Mauslinie 19 abgeleitet wurden untersucht. Für beide Gene ein starkes Fluoreszenzsignal erhalten wurde (6A) und einer vernachlässigbaren Cy3-Fluoreszenz des Scramble-Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Ergebnisse wurden für Mensch und Schwein iPS-Zellen (Abbildung 6 erhaltenB und C). Wichtig ist, dass das Fluoreszenzsignal in der IPS Kolonien beschränkt und nicht die als Feeder-Schicht für Maus und Schwein iPS (siehe Pfeile in Figur 6A und C) verwendeten Fibroblasten etikettieren. Die Analyse NANOG Genexpression zeigte auch, daß nicht jede Sequenz in silico vorhergesagten "gut" ist schließlich zweckmäßig. Eines der drei Ausführungen eines NANOG spezifischen Nanopartikel induziert fast kein Fluoreszenzsignal vergleichbar mit der von der Verschlüsselungssteuer trotz einer 100% Sequenzübereinstimmung in murinen iPS-Zellen (6D). Ein ähnliches Ergebnis wurde auf iPS-Zellen von Mensch und Schwein Ursprungs gewonnen mit dieser Sonde (Daten nicht gezeigt). So können Nanopartikel verwendet werden, um Pluripotenz Genexpression über Artgrenzen Grenzen erkennen, während die Funktionalität jedes einzelnen gestaltet Sonde muss im Voraus beurteilt werden kann.

Die vielversprechenden Ergebnisse der in situKennzeichnung von lebenden Zellen in Zellkulturschalen veranlasste uns, die Genexpression quantitativ mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zu diesem Zweck wurden GAPDH -spezifischen Nanopartikeln an abgestuften Konzentrationen zugesetzt, um 293 Monoschichten, um die Markierungseffizienz innerhalb der Zielzellpopulation zu vergleichen HEK. Wie durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt eine erweiterte Cy3-induzierte Fluoreszenz wurde mit der geringsten Konzentration, verglichen mit Zellen, die die Nanopartikel nicht erhalten gesehen. Ansteigende Konzentrationen der Nanopartikel induziert eine deutlich konzentrationsabhängigen Fluoreszenz von HEK 293-Zellen in situ (7A). Aussetzen dieser Zellen zu einer durchflusszytometrischen Analyse bestätigte die konzentrationsabhängige Markierungseffizienz. Die Frequenz des Cy3-positiven Zellen deutlich erhöht (mehr als das Siebenfache), wenn die höchste Konzentration von Nanopartikeln aufgebracht werden (7B). In weiteren Experimenten ES-Zellen aus dem Nkx2.5 HerzEnhancer transgene Mauslinie 19 wurden verwendet, um die Expression von Genen Pluripotenz durch Durchflusszytometrie analysiert. Pilotversuche mit 400 pM der positiven Aufnahme Kontrolle ergab eindeutig Cy3 positive Live-ES-Kolonien unter dem Mikroskop und Durchflusszytometrie erfasst fast 40% der Cy3-positiven Zellen (7C). Dagegen vergleichbare unbehandelte Zellen etwa 0,1% der Zellen, die mit dem Scramble-positiv gefärbt behandelt wurden (Daten nicht gezeigt). Ebenso ist der Zusatz von speziellen für GAPDH Nanog und GdF3 Nanopartikel induziert einen deutlichen Fluoreszenzsignals in einzelne Kolonien in der Zellkulturschale. Die Frequenz des Cy3-positive Zellen für GAPDH, wie durch Durchflusszytometrie bestimmt war vergleichbar mit jener für beide Pluripotenz Gene (7C) zu sehen. Dieses Ergebnis ist zu erwarten, wie Nanog und GdF3 sollen auch der konstitutiv in pluripotenten ES-Zellen exprimiert werden. Somit können diese Daten eindeutig indihin, dass Zellen, die ein bestimmtes Gen exprimieren, können durch durchflusszytometrische Analysen identifiziert werden, qualitativ und durch ihre relative Menge.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Struktur der Nanopartikel. (A) Struktur eines genspezifischen Nanopartikels. (B) Scramble Nanopartikel (Negativkontrolle). (C) Uptake Nanopartikel (positive Kontrolle). Von Lahm et al. 17 angepasst ist, mit Genehmigung von Wiley nachgedruckt.

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Abbildung 2: Anwendung von Nanopartikeln zu Zellkulturen Ein richtig verdünnte Lösung von Nanopartikeln wird einfach in das Kulturmedium pipettiert.. Nach O / N Inkubation genspezifischen fluoreszierenden Zellen unter af sichtbaren luorescent Mikroskop.

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Abb. 3: Aktive Aufnahme von Nanopartikeln durch Zellen über Endozytose (A) Zellen aktiv zu verschlingen die Nanopartikel durch Endozytose (B) Ziel-mRNA bindet an die Capture-Strang und verdrängt die fluoreszierenden Reporter..

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Abbildung 4: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie. (A) Strategie für die HEK 293 Zellen. (B) Strategie für die Maus-ES-Zellen. Die Daten wurden unter Verwendung von Vorrichtung 1 zum HEK 293-Zellen oder Vorrichtung 2 für Maus-ES-Zellen gewonnen und wurden anschließend durch ein Software-Tool (siehe Tabelle der Materialien) analysiert.

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Fig. 5: Analyse von GAPDH -Ausdruck in HEK 293 Zellen A GAPDH-spezifischen Nanopartikel wurde zu den Zellen bei 100 uM (Endkonzentration) (B zugegeben und die Fluoreszenz wurde nach O / N Inkubation aufgezeichnet (A) GAPDH-spezifischen Nanopartikel.. ) Scramble (Negativkontrolle). (C) Uptake (positive Kontrolle). (D) Kinetik der Jagt und Aufnahme Kontrolle. Fluoreszenz wurde in den angegebenen Zeitpunkten nach der Zugabe des GAPDH-spezifischen Nanopartikel bestimmt. Skalenbalken stellen 50 & mgr; M.

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Abb. 6: Analyse von Pluripotenz Genexpression in iPS-Zellen von verschiedenen Arten Nanopartikel spezifisch für NANOG oder GDF3 wurden zu den Zellen bei 400 pM hinzugefügt (final concentration) und Fluoreszenz wurde nach O / N Inkubation A) Murine iPS-Zellen B) Menschliche iPS-Zellen erfasst. (. (. (C) Porcine iPS-Zellen. Pfeile in (A) und (C) zu benennen, nicht markierten Fibroblasten-Feeder-Schicht-Zellen. (D) Fluoreszenz-in-Maus-iPS-Zellen nach der Zugabe des NANOG-design SF3 Nanopartikel. Skalenbalken stellen 50 & mgr; M.

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Abbildung 7: Nanopartikel-markierter lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert werden. (A) Die mikroskopische Ansicht des Cy3 positive HEK 293-Zellen nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von Nanopartikeln. (B) Die Häufigkeit der Cy3-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. (C) Live-Färbung von Maus-ES-Zellkolonien und die Bestimmung der Häufigkeit von Cy3 positive Zellen. Nanopartikel wurden hinzugefügtbei einer Endkonzentration von 400 pM. Skalenbalken stellen 50 & mgr; M.

Diskussion

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nanoteilchen, welche die sichere Auswertung der intrazellulären Genexpression direkt in lebenden Zellen aus verschiedenen Säugetierarten mit diversen histogenetischen Herkunft unter einem Fluoreszenzmikroskop ermöglichen. Dieser Ansatz hat eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren. Zunächst der Forscher nicht in Bezug auf entweder das Zielgen oder Zelltyp beschränkt. Alle Antikörper-basierten Nachweisverfahren sind auf ein einzelnes Epitop beschränkt. Obwohl fluoreszierende molekulare Signale können auch für ein breites Spektrum von Genen entwickelt werden, erfordert dieses Verfahren die Dissoziation der Zellen und anschließende Nukleofektion 15. Im Gegensatz dazu wird die Anwendung der genspezifischen Nanopartikel keine Manipulation der Zielzelle, die die Nanopartikel aktiv von Endozytose verschlingt erforderlich. Während der anschließenden Passage der Goldteilchen nach verlassen der Zellen, und die Kultur kann in downstrea verwendet werdenm Experimenten.

Dennoch hat auch die Technologie immer noch einige Einschränkungen. Einige Marker sind offensichtlich nicht nachweisbar aufgrund ihrer Kohlenhydrat Natur wie SSEA-1 oder TRA-1-81 20. Derzeit ist eine große Anordnung von Nanopartikeln im Handel erhältlich. Diese Teilchen wurden für ihre Funktionalität in zellulären Experimenten vorgetestet worden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, kundenspezifische Sonden, die über Artgrenzen Grenzen verwendet werden können, zu entwickeln. Wenn nach einem solchen Annäherung oder beim Entwerfen einer Sonde für ein neues Ziel-Gen hat man sich bewusst sein, dass die Funktionalität eines in silico vorhergesagten Sonde muss sorgfältig in vitro untersucht werden können. Die NANOG-SF3 Sonde, die eine 100% Homologie zu der Sequenzhomologie zeigten überhaupt nicht arbeiten, während NANOG-SF1 mit einem fehlgepaarten Basen im murinen und Schweine-Sequenz erzeugt einen schönen Fluoreszenzsignal. Eine andere Frage bezieht sich auf die effiziente Aufnahme der Nanopartikel. Die Partikel gebendie Zellen durch Endozytose ein Verfahren, das durch die Größe der Nanopartikel 21 beeinflusst, wird der Zelltyp und der Differenzierungsstatus 22 und die zelluläre Fähigkeit zum phago- zuführen und Makropinozytose 23. Die optimale Konzentration, eine befriedigende Fluoreszenzsignal zu erhalten, muss für jede einzelne Anwendung oder Zelllinie getestet werden. Zu diesem Zweck sollte das erste Experiment immer die Anwendung der Aufnahmesteuerung, die Kompatibilität der Sonden innerhalb der Zelltypen und Kulturbedingungen, bevor sie zu Ziel-spezifischen Nachweis von Genexpression zu bewerten.

Ein kritischer Punkt, um zuverlässige Ergebnisse bei der Anwendung dieses Protokolls auf eine neue Zelllinie oder Zellpopulation ist die Einbeziehung von geeigneten Kontrollen zu erhalten. Die immer fluoreszierende Aufnahme Kontrolle zeigt einen Hinweis, welche Konzentrationen von Nanopartikeln wird eine ausreichende Fluoreszenzsignal in der Zielzellpopulation zu induzieren. Die Fluoreszenz zu bewerten müssend am nächsten Tag wie das Signal wird mit der Zeit 17 verblassen. Gleichzeitig die Verschlüsselungssteuerung ohne ein Gegenstück in der eukaryontischen Genom an einer gleichen Konzentration aufgetragen muß eine vernachlässigbare Hintergrundsignal hervorzurufen. Als dritte Steuer ist es ratsam, ein Nanopartikel spezifisch für ein Housekeeping-Gen (zB GAPDH, β-Actin) zu verwenden. Diese Nanopartikel dienen als positive Kontrolle, dass der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Gen-Expression in den ausgewählten Zielzellpopulation zu detektieren. Wenn diese Kontrollen drehen zufrieden kann man erwarten, zuverlässige spezifische Fluoreszenzsignale unter Verwendung spezifisch für andere Zielgene Nanopartikeln erhalten. Die Konzentration der verwendeten Nanopartikel können ebenfalls kritisch sein, da sie gezeigt haben, herunterregulieren die Zielsequenz 24. Dieser Effekt erfordert jedoch viel höhere Konzentrationen (5 nM) als die in den hier beschriebenen Experimenten (400 pM) dargestellt verwendeten Konzentrationen. Bei dieser Konzentration die nanoflares nicht beeinträchtigen Zielgen-mRNA oder Proteinniveaus und hohen Konzentrationen von 2 nM die Proliferation von HEK293 und murine ES-Zellen 17 nicht beeinträchtigen. Darüber hinaus fand eine ganze Genom-Expressionsanalyse zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Genexpression 25. Daher bei Konzentrationen bis zu 1 nM die nanoflares sollte nicht zeigen alle wichtigen Nebenwirkungen.

Eine sehr vielversprechende Anwendung dieser Technologie ist die Möglichkeit, eine gegebene Zellpopulation, welche von einem spezifischen Gen markiert ist etikettieren. In jüngerer Zeit wurden genspezifische Nanopartikel erfolgreich verwendet worden, um selektiv färben Live ventrikulären Myozyten 26, Subpopulationen von Melanomzellen 27, Monozyten 28 und Kleinhirnzellkulturen 29. Solche fluoreszenzmarkierten Zellpopulationen können sortiert und mittels Durchflusszytometrie als lebende Zellen gereinigt werden. In der Onkologie ist es vorstellbar, Live-metastatischen Tumorzellen in Tiermodellen zu isolierenauf der Basis ihrer Expression von CEA, für die Suche nach potentiellen Metastasen fördernde Gene oder Zielstrukturen wertvollsten. Wir haben kürzlich gezeigt, dass tatsächlich umprogrammiert murine iPS Kolonien können in situ mit Nanog -spezifischen Nanopartikel auf der Basis der detektierten Fluoreszenzintensität 17 identifiziert werden. Daher könnte die Identifikation der wirklich neu programmiert iPS Kolonien auf Hochdurchsatz-Plattformen, die Roboter-Fluoreszenzdetektion und Kommissionierung Geräte verwenden, um die vielversprechendsten Kolonien zu identifizieren durchgeführt werden. Diese Technologie scheint geeignet zu sein, in vielen Forschungsbereichen, um spezifische zelluläre Subpopulationen wählen und es scheint möglich, die Nanopartikel in Hochdurchsatz-Plattformen gelten. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll einen neuartigen Ansatz unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nanopartikel, die den Nachweis von intrazellulären Genexpression direkt in lebenden Zellen ermöglicht. Diese Technologie kann ein wertvolles Instrument, um zu reinigen, ausbauen und weitere Zeichen seinize seltenen Zellpopulationen in vielen Forschungsbereichen.

Offenlegungen

HL hat die Nanopartikel aus EMD Millipore Corporation erhalten kostenlos. Alle anderen Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Lynette Henkel für ihre hervorragende Unterstützung bei der Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse. Wir danken Dr. Don Weldon und Dr. Victor Koong (Temecula, CA) für die kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft, KR-3770-7/1 und KR-3770-9/1 (M. K.), der Deutschen Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 der Deutschen Stiftung für Herzforschung und der Deutschen Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), und das Deutsche Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A und DZHK B 14-013SE (M. K.).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM/Ham's F12 Medium mit stabilem GlutaminBiochrome GmbHFG4815
Fötales KälberserumLife TechnologiesSV30160.03
Penicillin/Streptomycin (100x)MilliporeA2213
Natriumpyruvat (100x)Life Technologies11360-039
DMEM hoher Glukosegehalt mit stabilem GlutaminBiochrome GmbHFG0435
Mitomycin CRoche10 107 409 001verhindert die Zellteilung von MEFs
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (100x)Life Technologies11140-050
b-MercaptoethanolSigmaM3148
Leukämie-Hemmfaktor (107 U/ml)MilliporeESG1107Wachstumsfaktor für murine ES- und iPS-Zellen, verhindert die Differenzierung
0,25% Trypsin/EDTA (1x)Life Technologies25200-056löst adhärente Zellkulturen
Knockout-SerumInvitrogen10828-028Supplement für menschliche und schweinische iPS-Zellkulturen
bFGFPeprotech100-18BWachstumsfaktor für menschliche und schweinische iPS-Zellen
Kollagenase IVWorthingtonLS004188Dissoziation von Schweine-iPS-Zellen
MatrigelCorning354277wirksame Oberfläche für die Feeder-freie Kultivierung humaner iPS-Zellen, die im Manuskript als Basalpräparationsmembran bezeichnet
E8 MediumStem Cell Technologies05940definiertes Medium für die feederfreie Kultivierung von humanen iPS-Zellen auf Matrigel
EDTA 0,5 MInvitrogen15575-038
SmartFlare SondenEMD Millipore Corporationkundenspezifischer Nachweis der intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen, die im Manuskript als Nanopartikel bezeichnet
FluoreszenzmikroskopZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 InkubatorThermo Scientific51026282
Gelatine (aus Schweinehaut)SigmaG6144verbessert die Bindung von MEFs an die Oberfläche
Propidiumiodid (1 mg/ml)SigmaP4864markiert tote Zellen in durchflusszytometrischen Analysen
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544in Abbildung 4 als Gerät 1 bezeichnet
NaviosBeckman Coulter775213in Abbildung 4 als Gerät 2 bezeichnet
FloJo vX 10.0.7r2TreestarSoftware zur Analyse von Durchflusszytometriedaten
wird werden

Referenzen

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Genexpressionsnachweisfluoreszierende NanopartikelLebendzellanalyseDurchflusszytometrieFluoreszenzmikroskopieNanopartikelsyntheseZiel mRNA NachweisPluripotenzmarkerZellkulturinkubationFluoreszenzquantifizierung

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