Summary
Este manuscrito descreve uma técnica de modelagem de infarto capsular. Aqui utilizamos uma técnica photothrombotic modificado com baixa intensidade de luz após o mapeamento de destino pré-cirurgia. Usando esta técnica, criamos um modelo de enfarte capsular circunscrito com comprometimento motor persistente.
Introduction
Até recentemente, a "massa cinzenta acidente vascular cerebral (GMS) modelos" têm sido utilizados exclusivamente para entender a fisiopatologia do derrame e para orientar o desenvolvimento de novos tratamentos. No entanto, tem havido um aumento da prevalência de acidente vascular cerebral que afeta a matéria branca subcortical em indivíduos idosos, o que constitui 15 - 25% de todos os acidentes vasculares cerebrais 1,2. Numerosos estudos têm sido realizados sobre acidente vascular cerebral utilizando modelos GMS, ao passo que há poucos estudos que usaram modelos (WMS) acidente vascular cerebral substância branca. A substância branca em roedores é substancialmente menor do que a substância branca em seres humanos ou primatas. Por conseguinte, é mais difícil de aceder selectivamente destruir e as regiões alvo na matéria branca 3. Além disso, não há ferramentas eficazes têm sido desenvolvidos até à data para destruir selectivamente a extensão prevista da matéria branca alvo. Por conseguinte, tem havido falta de modelos adequados para o estudo de acidentes vasculares cerebrais de substância branca.
st animalmodelos Roke são muitas vezes utilizados para monitorar o progresso da recuperação motora para o desenvolvimento de novos reabilitação e métodos terapêuticos. É ideal para utilizar um modelo animal que apresenta um défice neurológico longo prazo concordantes com as alterações anatómicas demonstradas em acidente vascular cerebral humano 4,5. A este respeito, a rápida recuperação do déficit motor e amplo envolvimento do cérebro após a lesão do infarto pode não ser realista na busca de pesquisa acidente vascular cerebral. Anteriores modelos capsular de enfarte têm sido feitos pela oclusão da carótida interna ou artérias coroideias anterior e difusão de endotelina-1 (ET-1) no interior da cápsula interna 6-9. No entanto, exige a oclusão da artéria dissecção cuidadosa das artérias, mas produz uma vasta área de lesão do enfarte, incluindo a cápsula interna, sem déficits comportamentais persistentes. Além disso, a ET-1 não era difusa para destruir completamente a parte posterior da cápsula interna e, consequentemente, menos marcada ou persistir Behdéficit avioral.
Um modelo de enfarte do photothrombotic tem sido amplamente utilizada para gerar vários tipos de lesões de enfarte do córtex e estruturas subcorticais 10. A técnica incluem a administração intravenosa, seguida de iluminação focal, o que leva a agregação de plaquetas nos vasos pequenos e geração de lesões enfarte 10. Técnica Photothrombotic tem sido amplamente utilizada para criar lesões GMS, enquanto que raramente tem sido utilizado para gerar lesões WMS 5,11. Para esta técnica, uma combinação de corante e luz de irradiação Rosa de Bengala foi demonstrado ser útil na destruição da estrutura de alvo, fazendo com que os défices funcionais correspondentes. O elemento-chave da técnica photothrombotic é irradiação de luz, uma vez que determina o tamanho das lesões de enfarte. resultados de irradiação de luz em diferentes efeitos sobre a matéria cinzenta e matéria branca, porque a dispersão da luz é mais do que 4 vezes maior em ma brancotter em comparação com a matéria cinzenta 12; Por conseguinte, se a intensidade de luz tem uma suficientemente baixa irradiação (<1140 mW / mm 2), pode-se limitar a extensão para a qual lesão photothrombotic afectar a extensão para a substância branca (isto é., Cápsula interna). Por exemplo, a luz de energia mais elevada pode induzir enfartes, tanto na substância cinzenta e branca, mas a luz de energia mais baixo pode induzir fototrombose apenas na substância branca. Além disso, a penetração da energia luminosa foi muito limitada. Aproximadamente 99% da energia da luz foi perdido para além de 1 mm a partir da fonte de luz 13. Portanto, espera-se que o alvo com exactidão, a luz de menor energia induz fototrombose apenas na matéria branca, com uma interferência mínima da matéria cinzenta vizinha.
Aqui, nós descrevemos um novo método para criar lesões na área de enfarte do membro anterior da cápsula interna em roedores. Nós descrevemos o método de identificação da área do membro anterior na ca internapsule, a tecnologia de irradiação de luz, incluindo o ajustamento e a entrega de luz, e a geração de uma lesão do enfarte. Descrevemos também testes comportamentais utilizados para avaliar a integridade da modelagem capsular.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de Gwangju Instituto de Ciência e Tecnologia (GIST), e todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na GIST.
1. etapas de pré-lesão de
- Identificação da Área Membro Anterior na cápsula interna usando AAV-GFP
- Casa e lidar com ratos Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 semanas) em conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e eletrodos usando um esterilizador apropriado (vapor ou esterilizador Plasma). Use esterilizador a vapor a 121 ° C como configuração de 30 min para a esterilização e 30 minutos para secar.
- Anestesiar os animais com uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) através de uma injecção intramuscular. Verifique a profundidade da anestesia por beliscar pata. Manter a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C por meio de uma almofada de aquecimento sobo corpo do animal.
- Colocar o animal em um quadro estereotáxico usando uma barra de ouvido e suporte de boca.
- Limpar e desinfectar o local da cirurgia com álcool a 70% e solução de povidona iodo. Se infiltrar 2% de cloridrato de lidocaína sob o couro cabeludo na área do crânio incisão destina-se a reduzir a dor intra-operatório.
- Aplicar veterinário pomada oftálmica para evitar a secagem dos olhos. Coloque uma cortina estéril sobre o animal aos locais operatórias. Manter todos os procedimentos em condições estéreis.
- Realizar uma incisão na linha média do crânio de 2 cm utilizando um bisturi e retrair a pele bilateralmente com afastadores de arame. Seque o crânio com cotonetes e 30% de peróxido de hidrogênio.
- Faça um furo usando uma broca parte da mão sobre a área do membro anterior do córtex motor (AP: 2,5 a partir de bregma, ML: ± 2.5 da linha média) e limpar o trato com micro-currette para o vírus de injecção.
- Descongelar o AAV-GFP (2 x 10 12 moléculas de vírus / ml) em gelo e carga 1 ul davírus em uma seringa de 10 ul. Coloque a seringa no quadro estereotáxico.
- Mover a agulha para o orifício pré-fabricados e baixar a agulha 1 mm de profundidade dentro da dura-máter.
- Injectar o vírus lentamente (0,1 ul / min) usando uma microbomba alta precisão e deixar a agulha no lugar por um período adicional de 10 minutos para permitir que o vírus se difundem para fora.
- Depois de limpar o local da cirurgia com irrigação salina, garantir o ferimento com sutura 3-0 nylon; libertar o rato a partir da moldura estereotáxica e transferi-lo para uma câmara de recuperação. Administrar cetoprofeno (2 mg / kg) através de uma injecção intramuscular para o controlo da dor pós-operatória.
- Manter a temperatura do corpo (37 ° C) com a almofada de aquecimento e administrar antibióticos de segunda geração cefens-classe (0,1%, 1 ml) por meio de uma injecção intramuscular e 2% de cloridrato de lidocaína por meio de injecção subcutânea, conforme necessário. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manterdecúbito esternal. Única casa o animal até a recuperação completa.
- Após 2-3 semanas de recuperação, anestesiar profundamente o rato com uma overdose de cloridrato de cetamina (300 mg / kg) através de uma injecção intramuscular na capa. Confirmar a morte de animais por falta de toe beliscar resposta, pulso e respiração. Coloque o supino rato no capô.
- Abrir a cavidade abdominal através de uma 'incisão em forma de Y'para abrir a cavidade torácica. Prender firmemente a aorta descendente, com uma pinça hemostática e romper o átrio direito do coração de rato para a drenagem de sangue. Iniciar a perfusão para o ventrículo esquerdo do coração com frio de paraformaldeído a 1% durante 5 min (10 mL / min), seguido por paraformaldeído a 4% durante 30 min (10 mL / min).
- Retire a cabeça de rato a partir da carcaça usando um par de tesouras. Faça uma incisão na linha média do pescoço até o nariz e remover os músculos do pescoço usando tesoura ou rongeur modo que o crânio é exposta. Gentilmente dissecar os ossos do crânio e duras para fora do cérebro.
- Extrai-se a colocar o cérebro e cérebro de rato num tubo cónico de 50 ml cheio com paraformaldeído a 4% durante a noite. No dia seguinte, lava-se a cérebro com 1x PBS 3 vezes e coloca-se numa solução de sacarose a 30%.
- Após o cérebro completamente afunda para o fundo da solução de sacarose a 30%, colocar o cérebro no cryomold com composto OCT, a -20 ° C em Criótomo. Corte o cérebro no plano coronal com uma espessura de 40 um e um intervalo de 200 | im.
- Realizar a coloração imuno-histoquímica GFP utilizando o método slide 14. Aplicar o anticorpo primário (1: 200 de anti-Proteína Fluorescente Verde, fracção IgG de coelho) com fatias de cérebro durante a noite a 4 ° C. Em 2 ° dia, lava-se com 1% Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBST) solução de Tween-20 e 3 vezes aplicar o anticorpo secundário (1: 500 de IgG de cabra anti-coelho (H + L)) durante 1 h. Lave o slide com 1% PBST 3 vezes. Coloque a tampa de vidro sobre a fatia do cérebro.
- Usando um microscópio de fluorescência (comprimento de onda de excitação470 nm, comprimento de onda de emissão de 525 nm, Ampliação 5X), observar o AAV-GFP axónios transduzidas na cápsula interna. Comparar os locais de axónios transduzidas com o atlas de cérebro de rato 15 para determinar as coordenadas estereotáxicas dos axónios transduzidas
- Ajuste da intensidade de luz adequada para capsular infarto Modeling pré-lesão de
- Construção da Interface Neural Optical
- Corte um comprimento adequado (4 cm) de uma agulha espinhal calibre 27 com um estilete dentro de usar uma broca de corte.
Nota: O corte pode comprimir e esmagar a ponta da agulha espinhal; remover o estilete e polir a ponta de agulha espinhal para remover a porção esmagado da agulha espinhal e manter o calibre interno da agulha espinhal. - Tira um comprimento apropriado (10 cm) do invólucro da fibra óptica (125 um com um núcleo de 62,5 mm) de cabo de remendo um lado.
- Insira o fi óptica unjackedber para o tubo metálico (diâmetro externo: 3,8 milímetros, diâmetro interno: 3,3 milímetros e o comprimento: 17 mm), que é então apertado em torno da fibra. O tubo de metal é útil para preencher o espaço entre a fibra óptica e o cubo da agulha espinhal. Prender o inferior 02/01 do tubo de metal com uma prensa de duas vezes.
- Aplicar o epóxi curáveis por calor sobre a fibra óptica e inserir a fibra óptica para dentro da agulha espinhal. Aplicar um epóxi adicional para o espaço vazio no centro. Curar o epoxi durante 20 min a 100 ° C para a fixação estável.
- Clivar a fibra óptica, que se projecta para fora da agulha espinhal e polir a fibra óptica na ponta da agulha espinhal usando polimento de diamante (polimento) folhas.
- Ligue a parte do conector FC / PC do cabo de remendo para o acoplador do sistema de laser verde e medir a intensidade da luz da ponta da fibra óptica usando potência óptica digital e medidor de energia.
- Corte um comprimento adequado (4 cm) de uma agulha espinhal calibre 27 com um estilete dentro de usar uma broca de corte.
- Construção da Interface Neural Optical
2. PhotothromBotic infarto a lesão na cápsula interna
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e eletrodos usando um esterilizador apropriado (vapor ou esterilizador Plasma). Use esterilizador a vapor a 121 ° C como configuração de 30 min para a esterilização e 30 minutos para secar.
- Anestesiar o animal (~ 400 g, 11 - 13 semanas) com uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) através de uma injecção intramuscular. Verifique a profundidade da anestesia por beliscar pata. Manter a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C por meio de uma almofada de aquecimento sob o corpo do animal.
- Colocar o animal em um quadro estereotáxico usando uma barra de ouvido e suporte de boca.
- Limpar e desinfectar o local da cirurgia com álcool a 70% e solução de povidona iodo. Se infiltrar 2% de cloridrato de lidocaína sob o couro cabeludo na área do crânio incisão destina-se a reduzir a dor intra-operatório. Aplicar veterinário pomada oftálmica para evitar a secagem dos olhos.
- Aplique uma cortina estéril sobre a umaimal e expor os locais operatórias. Manter todos os procedimentos em condições estéreis.
- Realizar uma incisão na linha média do crânio de 2 cm e retrair a pele bilateralmente com afastadores de arame. Seque o crânio com swaps de algodão e peróxido de hidrogênio.
- Ajuste a altura do grampo do nariz até o bregma e lambda são alinhados no mesmo nível. Passo crítico: Este alinhamento é crítico para abordar correctamente uma estrutura mais profunda, tal como na realização de uma lesão do enfarte na cápsula interna na experiência principal.
- Fazer um furo (diâmetro: 2 mm; AP: -2,04 partir bregma; ML: ± 3.0 a partir da linha média) usando uma broca para induzir fototrombose.
- Polonês e limpar a ponta da fibra óptica da interface óptica. Fixar a ONI para o quadro estereotáxico sem dobrar. Verifique a ponta da ONI e eliminá-lo de forma clara, antes e após a inserção da interface óptica.
- Medir a intensidade do laser a partir da ponta da fibra óptica antes da inserção do Optical interface para o local alvo do cérebro de rato. Ajustar a intensidade do laser de 3,5 mW, tal como foi confirmado por medidas de pré-cirurgia, na ponta da fibra óptica.
- Inserir o ONI dentro da área alvo da cápsula interna (-7,8 mm confirmados a partir do passo de pré-cirurgia) através do orifício de broca.
- Manter a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C durante fototrombose. A temperatura do corpo mais baixa pode não produzir o grau esperado de infarto. Injectar Rosa de Bengala (2 ml / kg) através da veia da cauda.
- Ligue a 532 nm laser verde para 90 seg 1 min após a injeção Rose Bengal. Após a irradiação, remova cuidadosamente a ONI do cérebro. Depois de limpar o local da operação, garantir a ferida garantir a ferida com sutura 3-0 nylon; libertar o rato a partir da moldura estereotáxica e transferi-lo para uma câmara de recuperação.
- Para o grupo de operação simulada (SOG), realizar um procedimento de tomada de lesão idênticos, exceto para a injeção de solução salina (0,2 ml / 100 g) em vez de Rose-Bengal.
- Manter a temperatura do corpo (37 ° C) com a almofada de aquecimento após a cirurgia e administração de antibióticos de cefalosporina de segunda geração (, 0,1%, 1 ml) por meio de uma injecção intramuscular. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva animais pós-cirúrgicos para a gaiola ocupados por outros animais até que esteja totalmente recuperado.
NOTA: experiência preliminar foi realizada nos mesmos procedimentos para encontrar a intensidade de luz óptima de 1 mW a 5 mW e o procedimento pode ser exigido para adquirir o grau satisfatório de lesão em condições diferentes.
3. Avaliação da capsular infarto a lesão
- Testes comportamentais e Agrupamento animal
- Execute pellet única atingindo tarefas como descrito por Whishaw et al. 14 para avaliar o déficit motor do membro anterior a cada dia durante 1 semana após a modelagem acidente vascular cerebral. Realizar uma única tarefa pellet chegar(SPRT) em animais com restrição de alimentos (90% do controle de peso corporal) usando Plexiglas claras (30 x 15 x 35 cm de altura) com uma fenda de 1 cm de largura e uma prateleira de alimentos na frente do meio da parede anterior.
- Colocar um pellet na prateleira de alimentos obliquamente contralateral ao membro anterior preferida. Administrar 20 pelotas por sessão durante 3 semanas.
NOTA: Um número bem sucedida de SPRTs é definido como um alcance no qual o animal apreende uma pelota de alimentos e coloca-lo na boca, sem deixá-la cair. - Calcular a pontuação como uma percentagem de sucesso atinge, o qual é definido pela seguinte fórmula:
NOTA: Nós dividir os animais em 3 grupos: o grupo de operação simulada (SOG), grupo de recuperação moderada (MRG), e um grupo de recuperação pobres (PRG). Se uma pontuação SPRT pós-AVC> 50%, classificamos os ratos como a MRG, o que indica a presença de uma lesão substancial, mas a destruição não completa do target. Se a pontuação SPRT pós-AVC é <50% em comparação com o resultado SPRT pré-acidente vascular cerebral, podemos classificar o grupo como PRG, o que indica a lesão completa no alvo.
- Confirmação neuro-histológicos de infarto a lesão
- Realização de perfusão cardíaca com paraformaldeído a 4%, como descrito anteriormente. Após o cérebro afunda completamente na solução de sacarose a 30%, realizar corte coronal com uma espessura de 10 um e um intervalo de 200 um utilizando um micrótomo ou Criótomo 4.
- Mancha com H & E, Nissl, Luxol fast blue-PAS, neurofilamento proteína-G ou coloração proteína ácida fibrilar glial e observar os achados histológicos para determinar a intensidade da luz ideal que pode cobrir toda a largura da cápsula interna na área alvo para observar coloração 4,17.
- Utilizando o software ImageJ, medir o volume da área de enfarte photothrombotic da cápsula interna sobre as lâminas do cérebro.
- Para medir o volume da área de enfarte, inicie o software "ImageJ". Para abrir os arquivos a serem empilhados, selecione "Imagem para Stacks '(' Imagem '→' Stacks '→' Image to Stacks '). Editar nome do arquivo e selecione "Definir a escala" ( "Analisar" → "Definir a escala ') para editar escala.
- Em 'Plugins', selecione "Meça Stacks 'para calcular o volume ou área de imagens. Insira o intervalo de distância de 2 imagens em 'Slice Espaçamento'. Faça um desenho do ROI (Região de Interesse) de todas as imagens e clicar em 'Medida'.
NOTA: O software "ImageJ" calcula automaticamente a área eo volume de cada imagem e volume total deles.
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Representative Results
O método aqui apresentado destina-se a criar um enfarte capsular circunscrito com um déficit motor. Portanto, é crítico para determinar correctamente o alvo no interior da cápsula interna na etapa de pré-cirurgia. O mapeamento somatotopic de fibras piramidais na cápsula interna não foi resolvido até o momento. Para identificar corretamente o alvo dentro da cápsula interna, a área do membro anterior devem ser delimitadas. Uma injecção de AAV-GFP para a área do membro anterior do córtex motor pode rastrear os axónios das fibras piramidais na cápsula interna (Figura 1). Outros marcadores neuronais, tais como biotinilado amina dextrano (BDA), pode ser utilizado para o mesmo finalidade. As coordenadas estereotáxicas do alvo no interior da cápsula interna pode ser elucidado por traçando as projecções axonais que se originam a partir da área do membro anterior do córtex motor para a cápsula interna.
Figura 1. A identificação da área Membro Anterior na cápsula interna 2 semanas após a injecção das fibras axonais do AAV-GFP. Transduzidas com GFP que se originou a partir da área do membro anterior do córtex motor são mostrados no núcleo ventrolateral do tálamo (setas) e a porção caudal da cápsula interna (seta). A linha a ponteado indica o contorno da cápsula interna, e os números referem-se às distâncias da bregma. Hippo, hipocampo; CPU, putâmen caudado; VL, núcleo ventrolateral; IC, cápsula interna. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A intensidade de luz óptima pode ser diferente, dependendo da estirpe e do peso corporal do animal e os tipos e de diâmetros fibras ópticas. Portanto, a intensidade de luz ideal deve ser determinada separadamente antes da principal experimento enfarte a lesão. Utilizando o procedimento photothrombotic, a intensidade da luz pode ser aumentada gradualmente até que a extensão da lesão abrange toda a largura da cápsula interna, sem destruir as estruturas de matéria cinzenta vizinhos (Figura 2). A intensidade de luz óptima pode ser verificada através da comparação da medida histológica da lesão do enfarte e locais.
Figura 2. Extensão do infarto lesões Através intensidade variável da luz laser a partir de 2 mW a 5 mW 2 semanas após a lesão Photothrombotic. A intensidade de luz ideal é considerado ser entre 3 MW e 4 mW neste cenário experimental. As setas indicam a lesão do enfarte./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nós preferimos usar o ONI em que a fibra óptica está contida em um tubo de metal fina (agulha espinhal). A fibra óptica pode produzir o mínimo de dispersão de luz a partir do lado da fibra, que é susceptível de gerar danos neurais adicional ao longo do trato de fibra óptica. Invólucro da fibra óptica também é vantajosa para impedir a dobragem da fibra óptica em alvos mais profundas, bem como para fixar a ONI à armação estereotáxica (Figura 3).
Figura 3. A construção da interface óptica-neural (ONI). (A) de corte da agulha espinhal. (B) de decapagem da fibra óptica. (C & d) O tubo de metal de ancoragem é inserido através dafibra óptica descascado e apertada para fixar a fibra óptica para o cubo da agulha espinhal. (E) A fibra óptica adicionou-epoxi é introduzido na agulha espinhal. (F) A epoxi é endurecido a 100 ° C durante 20 min. (G) A fibra óptica é clivado na ponta da agulha espinhal. (H) A fibra óptica é polido. (i) A intensidade da luz é medida a partir da ponta da fibra óptica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O procedimento photothrombotic irá produzir lesões reprodutíveis e locais com ~ 70% de sucesso no comprometimento motor. Lesão do enfarte capsular típica engloba a dimensão ventrodorsal de fibras capsulares (Figura 4a). Para além disso, a lesão do enfarte estende-se ao longo do eixo ântero-posterior da cápsula interna devido ao aumento da dispersão de luz no interior da fibra capsular. (Figura 4B) O aparelho óptico localizado por baixo da cápsula interna é constituída por fibras de substância branca; Assim, é frequentemente danificada por irradiação de um aumento da intensidade da luz. Cortes seriados e coloração são necessários para confirmar todo o volume e extensão de infarto. O volume do enfarte foi de 0,63 ± 0,37 mm3. Para avaliar a destruição da fibra capsular, neurofilamento e Luxol manchas de azul rápido-PAS são úteis.
Figura 4. Aspecto microscópico de capsular Enfarte 3 semanas após Fototrombose. Aparência microscópica de infarto capsular 3 semanas após fototrombose. A) fatia do cérebro de secção coronal no cérebro do rato. Arrowhead indicar a extensão de agulha contendo fibra óptica no tálamo e até cápsula interna. B) coloração de Nissl série do coronal fatias de cérebro showi ng toda a extensão da lesão do enfarte na cápsula interna. As setas indicam a lesão do infarto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O sucesso da modelação pode ser avaliada por meio de testes comportamentais usando um único pelete atingir tarefa. O desempenho comportamental após 1 semana após a lesão de enfarte é um bom guia para confirmar a lesão precisas, que acompanha a deterioração persistente e marcante de SPRT apesar da formação da pelota única diária atingindo (Figura 5). Uma vez que o déficit motor é mostrado no PRG, o déficit neurológico persiste durante 3 período de observação mês. grupo operado-Sham não mostrou a diminuição significativa do desempenho SPRT após a operação.
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Figura 5. Mudanças no único Pellet atingir escores após capsular Infart 4,20. Os grupos experimentais (PRG e MRG) apresentaram diminuição da pontuação imediatamente após a lesão de infarto em comparação com o grupo de operação simulada (SOG) significativamente. O MRG apresenta uma recuperação gradual da performances SPRT, enquanto o PRG apresenta comprometimento motor persistente ao longo do tempo. Op, photothrombotic a lesão do infarto; PRG, má grupo de recuperação; MRG, grupo de recuperação moderada. A significância estatística foi determinada utilizando análise de medida repetida de variâncias. + SOG contra MRG; * SOG contra PRG. Os dados são médias ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo do infarto capsular aqui apresentado demonstra uma lesão-alvo com comprometimento motor acentuado e persistente na função de membro anterior. Modelos anteriores de AVC capsular subcortical demonstraram um grau insuficiente de comprometimento motor e uma 6,8,9 processo de recuperação rápida. Neste sentido, este modelo se assemelha os casos clínicos capsular de enfarte que exibem insuficiência funcional a longo prazo.
Os passos mais críticos no desenvolvimento de um modelo capsular enfarte circunscrito são: 1) para identificar corretamente a representação somatotopic da parte do corpo a intenção de desativar a função dentro da cápsula interna; 2) para identificar a intensidade óptima do laser verde, o que pode destruir toda a largura da cápsula interna com a invasão mínima de estruturas vizinhas de matéria cinzenta; e 3) para colocar com precisão a fibra óptica na estrutura alvo. Embora as técnicas apresentadas pode induzir circunscreverd modelo de enfarte capsular com uma taxa de replicação elevada (> 70%), pequenas diferenças na localização e no grau de destruição da integridade, cobrindo toda a largura da cápsula interna pode ser responsável por diferentes deficiências motoras.
O trato córtico está situado na metade anterior do membro posterior na cápsula interna em humanos, apesar da controvérsia da organização somatotopic 15. Em contraste, não houve nenhuma classificação equivalente ou elucidação pormenorizada da organização somatotópica da cápsula interna em roedores. A falta de conhecimento sobre a organização somatotopic muitas vezes leva a alvos incorretos de lesão de enfarte dentro da cápsula interna com diferentes resultados motores entre os modelos capsular de infarto. No entanto, foram identificados os axónios transduzidas com GFP na parte caudal da cápsula interna, que provavelmente representam o caminho das fibras motoras membro anterior. Além disso, o momento de ferimento desta área demonstred um déficit acentuado e persistente de habilidade atingindo membro anterior. Portanto, recomendamos a porção caudal da cápsula interna para a lesão estereotáxica para melhorar a validade do modelo capsular enfarte.
Pré-ajuste da intensidade da luz é obrigatória para produzir uma extensão uniforme da lesão do enfarte em modelos de acidente vascular cerebral devido a estirpe animal, o peso corporal, a fonte luminosa e os tipos de ONI podem gerar diferentes tamanhos de enfarte. Portanto, experimentos preliminares com diferentes intensidades de luz em animais experimentais com a mesma estirpe e peso corporal deve ser efectuado até que a lesão do infarto satisfatória é conseguida com a intensidade da luz mínima.
intensidade de luz forte que pode destruir toda a largura da fibra capsular (antero-posterior e extensão dorsoventral) que corresponde a área do membro anterior com o mínimo de danos para as estruturas vizinhas é considerada a intensidade de luz óptima. o forelimb área da cápsula interna é delimitada pelo tálamo superiormente e inferiormente o trato óptico. Portanto, a profundidade de inserção ONI deve ser preciso para destruir toda a extensão da IC no sentido dorsoventral, com preservação simultânea das estruturas vizinhas superiores e inferiores. posicionamento impreciso da ONI resulta numa destruição incompleta do IC, o que leva a uma recuperação rápida do défice motor como um resultado da plasticidade sináptica das restantes fibras piramidais na cápsula interna. Em exames histológicos de série, o factor mais confusão na indução de um déficit motor foi o posicionamento incorrecto da ONI, o que leva à falha para destruir toda a largura da PLIC 4,16. Portanto, atenção especial deve ser dada para atingir o alvo correto. Recentemente, Blasi et ai. Relatou que duradoura défice puro-motor pode ser produzida fazendo uma lesão do enfarte em cápsula interna posteriorusando endotelina-1 (ET-1) 17. No entanto, a ET-1 pode destruir a estrutura matéria cinzenta vizinha pela difusão de ET-1.
teste comportamental é um padrão de referência imediatamente disponíveis no laboratório para avaliar a formação da lesão do enfarte na cápsula interna. No entanto, recomenda avaliação de desempenho motor de uma semana após a lesão do infarto dividir os animais em grupos de recuperação moderada e fraca. recuperação moderada foi definida como um aumento na pontuação de desempenho em> 50% em comparação com o resultado antes de a lesão, enquanto má recuperação foi definida como a recuperação de <50%. Entre os testes comportamentais motoras membro anterior, o pellet única atingindo tarefa é um dos testes mais sensíveis para ambas as medições quantitativas e qualitativas da performance motora induzida por AVC 14. A tarefa mede quantitativamente o sucesso atingindo, ao mesmo tempo fornecendo uma análise do uso do membro anterior, como agarrar e recuperar um alimentosedimentar. A análise qualitativa do movimento atingindo também é útil para diferenciar a qualidade de recuperação de acidente vascular cerebral, distinguindo recuperação funcional genuína ou compensação 20. Aqui, nós descrevemos brevemente a medição quantitativa do SPRT; No entanto, análise qualitativa utilizando filmagens e pontuação baseada em uma análise frame-by-frame é recomendado para análise detalhada.
As técnicas aqui apresentadas não necessita de ser limitada para a indução de modelagem capsular enfarte circunscrito. A técnica pode ser aplicada para a indução de uma lesão do enfarte em outras áreas de matéria branca, tais como o corpo caloso, comissura anterior e fibras de ligação entre estruturas neurais. A combinação da técnica pequena ONI e photothrombotic com base nas propriedades ópticas de substância branca é susceptível de destruir as estruturas pretendidas com o mínimo de danos para as estruturas vizinhas. Por exemplo, infartos lacunares pode ser facilmente produzird alvejando as estruturas subcorticais relacionados com as funções motoras, cognitivas e de memória. Quando a estrutura alvo é grande, várias inserções do ONI e diferentes trajectórias de segmentação e em ângulo pode ser obrigado a produzir o grau desejado de lesões.
Existem várias limitações desta técnica. A técnica é suficiente para demonstrar a consequência da lesão de enfarte na PLIC e posterior recuperação. No entanto, este modelo não reflete o espectro completo de WMS humanos, porque a destruição photothrombotic da matéria branca difere ligeiramente do WMS humanos. Consequentemente, os achados de imagem neurobiológicas ou RM podem apresentar características diferentes na fase inicial da lesão de photothrombotic. Portanto, este modelo deve ser adequadamente utilizado para a troca vantagens e desvantagens do modelo. Tecnicamente, nem todas as cirurgias podem produzir o déficit motor acentuada e permanente neste modelo porque requer procedimentos muito precisos. Specifically, mãos pessoal qualificado são necessários para produzir a alta reprodutibilidade na geração deste modelo.
Em conclusão, a utilização combinada de uma técnica photothrombotic, optimização da intensidade da luz, e direccionamento correcto é uma técnica útil para a produção de um modelo de enfarte capsular circunscrito. Este modelo será útil não só para estudar WMS no comportamental, o circuito, e os níveis celulares, mas também para avaliar a utilidade de novas intervenções terapêuticas e de reabilitação.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto de Medicina Engenharia de Sistemas (Imse) & GIST-Caltech Fundo Collaborative (K04592) de GIST e pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da NRF da Coreia financiado pelo Ministério da Ciência, das TIC e do Ordenamento do futuro (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
