Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Zusammenfassung

Relativ ruhig unterstützen somatische Stammzellen lebenslang die Zellerneuerung in den meisten adulten Geweben. Neurale Stammzellen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren sind zwei spezifische neurogenen Nischen eingeschränkt: die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und der ventrikulären-Subventrikularzone; in den Wänden der seitlichen (V-SVZ auch subependymale Zone oder SEZ bezeichnet) Ventrikel. Die Entwicklung von In-vivo-Gentransfer-Strategien für die adulte Stammzellpopulationen (dh diejenigen des Säugetiergehirns), die sich in langfristige Expression des gewünschten Transgene in den Stammzellen und deren abgeleiteten Nachkommen ist ein wichtiges Instrument in der aktuellen biomedizinischen und biotechnologischen Forschung. Hier wird eine direkte in vivo-Verfahren für die stabile genetische Veränderung von erwachsenen Maus V-SVZ Zellen präsentiert, die den Vorteil des Zellzyklus-unabhängig Infektion durch LVs und dem hoch spezialisierte Zellarchitektur des V-SVZ Nische findet. Insbesondere beinhalten die aktuelle Protokolls die Injektion von Leer LVs (Kontrolle) oder LVs kodiert bestimmten Transgen-Expressionskassetten entweder in die V-SVZ selbst, für den in-vivo-Targeting von allen Arten von Zellen in der Nische oder in die lateralen Ventrikel Lumen zum Targeting von ependymalen Zellen, die nur. Expressionskassetten werden dann in das Genom der transduzierten Zellen und fluoreszierende Proteine ​​integriert, die ebenfalls von dem LVs kodiert, erlauben die Detektion der transduzierten Zellen für die Analyse der Zelle autonom und nicht autonomen, Nische abhängige Effekte in den markierten Zellen und ihre Nachkommen.

Einleitung

Die Maus-ventrikulären-Subventrikularzone (V-SVZ), in den Wänden des lateralen Ventrikel des Striatum zugewandt ist, ist eine sehr aktive Keimbereich, in dem ein kontinuierlicher Prozess der Vorläuferzellreplikation und Differenzierung ergibt sich die anhaltende Produktion von Riechkolben (OB ) Inter und Corpus callosum Oligodendrozyten ^1. Die lebenslange Erzeugung dieser Zellen wird durch die Anwesenheit in diesem Bereich von neuralen Stammzellen (NSC; auch als B1-Zellen) unterstützt werden, die die astrozytären Antigen glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Stammzellmarker wie Nestin, Id1 auszudrücken und Sox2 ^2. GFAP-exprimierenden B1 Zel....

Protokoll

Ethikerklärung: Dieses Protokoll folgt die Tierpflege-Richtlinien von der Universität von Valencia in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinie 2010/63 / EU.

1. Erzeugung von LV für In-vivo-Studien-Kennzeichnung (siehe 1A)

ACHTUNG: Die hier beschriebene Verfahrensweise ist Biosicherheitsstufe 2, also alle die folgenden Verfahren in einem Biohazard Haube zuführen. Stellen Sie sicher, dass die Mitarbeiter in der Forschung entsprechend qualifiziert sind und in allen Verfahren geschult. Persönliche Schutzausrüstung tragen, einschließlich Kleid, Doppelhandschuhe und geeignete Schutzbrille. Schließlich dekontaminieren gründ....

Ergebnisse

LV-vermittelte Gen-Delivery-System kann für die Langzeit-in vivo Transduktion von Zellen in der adulten Maus V-SVZ verwendet werden, so dass ihre Verfolgung und genetische Veränderung während der Proliferation, Migration und Differenzierung. Die Infektion und die Expression sind hochwirksame und zahlreiche Zellen ergeben, die leicht zu unterscheiden und auch nicht-infizierten Zellen durch die Expression des Reporter aufgenommen werden können. Wir haben bisher transduzierten Zellen mit GFP fluoreszierenden Repor.......

Diskussion

LVs bieten wichtige Vorteile gegenüber anderen viralen Systemen für die genetische Veränderung von erwachsenen NSC ^16,18. Stereotaktische Lieferung von Lentiviren in die V-SVZ Nische stellt ein effizientes Verfahren zur Markierung und Spuren selten B1-NSC Aufteilen der Grenzen der anderen üblicherweise verwendeten Methoden wie BrdU zu überwinden, die nach mehreren Zellteilungen verdünnt wird, oder Retrovirus, das Zellen, die nur Ziel dass zum Zeitpunkt der Anwendung wuchern. LVs zusammen mit Adenoviren können.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Teil 1: Erzeugung von LV für die In-vivo-Verabreichung.
Ausrüstung:
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultrazentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultrazentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultrazentrifugen-Röhrchen	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Ultrazentrifugen-Adapter	Beckman Coulter	358156
6-Well-Platte	SPL	PLC-30006
24-Well-Platte	SPL	PLC-30024
10-cm-Schale	SPL	PLC-20101	100 x 20
FACS Röhrchen	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Becher steriler FACS-Filter	BD	340626 30	µ m
Nitrozellulosefilter	Millipore	SCGPU05RE	0,22 μ M
Durchflusszytometer	BD	LSR Fortessa	Blauer Laser 488 nm
Steritop Filter	Biofil	FPE-204-500	0,22 &Mikro;
mReagenzien:
	Addgen	#12251	Kernverpackung Plasmid
pRSV.REV Plasmid	Addgen	#12253	Kernverpackung Plasmid
pMD2G Plasmid	Addgene	#12259	Hüllplasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre Plasmid	Addgen	#12252	Transfervektor-Plasmid
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium	Biowest	L0101-500	für HeLa-Zellkulturen
Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	Für 293T Zellkultur
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,  DNAse/RNAse-frei, 0,2 &Mikro; m sterilfiltriert
2x HBS			0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM wasserfreies Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (vorzugsweise nicht MilliQ). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH-Lösung (Calbiochem, 567530) auf 7,0 ein.
Fötales Rinderserum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stammlösung in einer 100x-Konzentration, zur Herstellung von HeLa und 293T-Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10x.
Glutamin	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stammlösung bei 200 mM, zur Herstellung von HeLa und 293T Kulturmedium in einer Endkonzentration von 6 mM.
Natriumpyruvat	Life technologies	11360-039	Stammlösung bei 100 mM, zur Herstellung von HeLa und 293T Kulturmedium in einer Endkonzentration von 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Wird zur Herstellung von 293 T Nährmedium in einer Endkonzentration von 1 % verwendet.
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stammlösung enthält 5.000 Einheiten/ml Penicillin und 5 mg/ml Streptomycin. Wird zur Herstellung von HeLa und 293T-Nährmedium in einer Endkonzentration von 1 % verwendet.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	Mit Phenolrot, enthält 2,5 g Schweinetrypsin und 0,2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, 10x, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen. Stammlösung zur Herstellung von 1x PBS in Wasser in Zellkulturqualität.
Polybren (Hexadimethrinbromid)	Sigma-Aldrich	H9268	Pulver. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung mit 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyd EM-Qualität 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Katalognummer	Comments
Teil 2: Sterotaktische Injektion von LV in die SEZ selbst oder den lateralen Ventrikel.<
strong>Ausrüstung:
Vernier stereotaktisches Instrument	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham-Maus und Adapter für Neugeborenen-Ratten	NeuroLab, Leica	39462950
Spritzenhalter	KD Scientific	KDS-311-CE
33 Gauge Spritze	Hamilton	P/N      84851/00	#85RN
Bohrmaschine	Fine Science Tool	98096
Wärmedecke	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, Typ C_AL01
Rasierer	Jata	MP373N	Modell: beauty, 3 V, 300 mA, Typ HT-03.
Reagenzien:
Medetomidin	Esteve	DOMTOR	Kommerzielle Lösung in einer Dosis von 1 mg/ml.
Ketamin	Merial	Imalgene 500	Handelsfähige Lösung in einer Dosierung von 50 mg/ml
Medetomidina/Ketamin-Gemisch			Bereiten Sie ein Arbeitsgemisch aus Medetomidin in einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml Verdünnung und Ketamin in einer Endkonzentration von 15 mg/ml in Kochsalzlösung vor. Verwenden Sie als Anästhesie, indem Sie ein Volumen injizieren, um eine Endkonzentration von 0,5-1 mg Medetomidina pro kg Körpergewicht und 50-75 mg Ketamin pro kg Körpergewicht zu erhalten
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stammlösung bei 10 mg/ml. Wird als Analgesie bei 1 mg/ml in Kochsalzlösung verwendet.
Atipamezol	Esteve	Antisedan	Stammlösung bei 5 mg/ml, verwendet in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml in Kochsalzlösung zum Verlassen der Anästhesie.
0,9%ige Kochsalzlösung	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topischer Hautkleber
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Chirurgischer Marker	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Gleitgel für die Augenheilkunde		SICCAFLUID	0,5 g/Dosis, Carbomer 974P
Povidon-Jod	Betadine	694109,6	10% Povidon-Jod
Name	Unternehmen<	strong>Katalognummer	Kommentare
Teil 3: Histologische Analyse.
Ausrüstung:
Automatische Schlauchpumpe	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S Sparantrieb mit variabler Drehzahl, 1,6-100 U/min, 230 V
Pumpenkopf	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load-Pumpenkopf für Präzisionsschläuche; PSF-Gehäuse, CRS-Rotor
Silikonschlauch	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Kopfhautvenen-Set	Vygon V-grün	70246.05T	25 G, 30 cm Tubuslänge
Vibratome	Leica	VT1000
Konfokalmikroskop	Olympus	FluoView FV10i
Heizplatte	Tehtnica	SHP-10
Reagenzien:
Phosphatpuffer (PB)			0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) und 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, pH-Wert auf 7,2-7,4
einstellen Paraformaldehyd (PFA)	Panreac	141451.1211	Jedes Mal frisch zubereiten. Heizen dH2O bis zu 55– 60°; C mit einer Heizplatte, die in einen Abzug gestellt wird, und unter Rühren PFA-Pulver einfüllen, um eine 8%ige Lösung zu erhalten. Die Lösung ist trübweiß, da sich PFA nicht leicht auflöst. Fügen Sie 1N NaOH Tropfen für Tropfen hinzu, bis die Lösung klar ist. Kühlen Sie ab, filtern Sie durch Whatman-Papier und fügen Sie ein äquivalentes Volumen von 0,2 M PB hinzu.
Kochsalzlösung			0,9% NaCl in dH2O
Sekundenkleber	LOCTITE	767547
Natriumazid	Panreac	122712.1608
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normales Ziegenserum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Reinigungsmittelmittel
Anti-GFP-Kaninchen-Antikörper	ROCKLAND	600-401-215	Verwendung in einer Verdünnung von 1:500
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper	Molekulare Sonden	A-21206	Verwendung in einer Verdünnung von 1:750
6-Diamindino-2-phenylindol-dihydrochlorid-hydrat (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluoreszierende Kernfärbung. Bei 2 mg/ml in ddH2O verwenden. Im Dunkeln bei 4 °C aufbewahren.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Eindeckmedium für fluoreszierende Präparationen

pMDLg/pRRE-Plasmid.