Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Zusammenfassung

Die adaptive Immunität wird durch dynamische 'immunologische Synapsen' gesteuert, die zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen gebildet werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung von Endothelzellen sowohl als wenig untersuchte physiologische APCs als auch als eine neuartige Art von "planarem zellulärem APC-Modell".

Zusammenfassung

Adaptiven Immunität wird von dynamischen Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen ("APCs") reguliert die so genannte "immunologischen Synapsen. Innerhalb dieser intimen Zell-Zell-Schnittstellen diskreten subzellulärer Cluster von MHC / Ag-TCR, F-Actin, Adhäsion und Signalmoleküle bilden und umgestalten schnell. Diese Dynamik werden gedacht, um kritische Determinanten der sowohl die Effizienz und die Qualität der Immunantwort, die sich entwickeln und damit der Schutz gegen pathologische Immunität. Aktuelle Verständnis der immunologischen Synapsen mit physiologischer APCs wird durch die Unzulänglichkeit der erhältliche Bildauflösung beschränkt. Obwohl künstlichen Substrat-Modelle (zB planaren Lipid-Doppelschichten) bieten hervorragende Auflösung und waren äußerst wertvolle Instrumente, sie sind von Natur aus nicht-physiologischen und vereinfacht. Vaskulären und lymphatischen Endothelzellen haben sich als wichtige peripheren Gewebe (oder Stroma) Abteil "semi-Beruf entstandenal APCs ". Diese APCs (die meisten der molekularen Maschinerie der professionellen APCs Express) haben die einzigartige Eigenschaft von nahezu planaren Zelloberfläche bilden und sind (mit fluoreszierenden Proteins Reportern zB) leicht transfizierbar. Hier ein grundlegendes Konzept für Endothelzellen als neuartige und physiologische 'planaren Zell APC-Modell "für eine verbesserte Bildverarbeitung und Abfrage der Grundantigenen Signalprozesse zu implementieren beschrieben.

Einleitung

T-Lymphozyten sind ein Zweig des adaptiven Immunsystems gekennzeichnet durch die Fähigkeit, Peptidantigen (Ag) effizient zu erkennen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) gebundenen Moleküle durch ihre T-Zell-Rezeptoren (TCRs) ^1. Naive Lymphozyten konstitutiv migrieren und scannen Berufs Ag-präsentierende Zellen "(APC; zB dendritische Zellen) innerhalb von Lymphknoten, während Memory / Effektor-T-Zellen benötigen, um eine extrem breite Palette von APCs und potentiellen Zielzellen im peripheren Gewebe effektiv zu überwachen.

Im min nach dem erstmaligen Ansatz des verwandten Ag auf einer APC, Lymphozyten zu verhaften ihre Migration und beginnen, eine spezialisierte intime Zell-Zell-Schnittstelle genannt 'immunologischen Synapse' zu bilden (IS). Anhaltende (dh 30-60 min) Kontakte sind erforderlich, um zu verstärken und zu erhalten Signalisierungs ^2-7. Schwellen Studien identifizieren, die innerhalb der IS, ist es die kontinuierliche und schnelle Bildung remodeling diskreter subzellulären Signalisierungsmikrocluster (dh enthaltend MHC / Ag-TCR, F-Actin, Adhäsion und Signalmolekülen), die die Stärke und Qualität der resultierenden Immunantworten ^2-7 zu bestimmen. Allerdings sind dynamische Details und regulatorischen Mechanismus dieses Prozesses unvollständig verstanden ^8,9. Dies ergibt sich im Wesentlichen aus technischen Herausforderungen mit unregelmäßigen Topologien von APC Oberflächen und schlecht kontrollierte Ausrichtung der Zell-Zell-Interaktion Flugzeuge, Fragen, die zutiefst begrenzen die erforderliche Raumzeit-Bildgebung assoziiert nähert ^8-10 (Abbildung 1a).

Abbildung 1. Ein Physiologische Planar Handy APC-Modell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics. Die Abbildung zeigt, traditionellen Bildgebung von immunologischen Synapse zwischen einer T-Zelle und einer professio nal APC (A) und T-Zell-und ein traditionelles planaren Lipid-Doppelschicht APC-Modell (B) im Vergleich zu diesem Roman Endothelzellen planar APC-Modell (C). Professionelle APCs bereitzustellen physiologischen immunologischen Synapsen bieten aber schlecht orientierte Zell-Zell-Schnittstelle (dh in Bezug auf die optimale xy Abbildungsebene; Auflösung ~ 0,2 & mgr; m), die dramatisch beeinträchtigt räumliche (z Abbildungsebene Auflösung ~ 1 & mgr; m) und zeitliche (dh aufgrund der Notwendigkeit, immer wieder zu scannen durch alle z Abbildungsebenen) Auflösung der Bildgebung. Doppelschicht-Modelle haben eine planare Topologie, die eine optimale Raumzeit-Bildauflösung bietet, werden aber auch in stark vereinfachter, nicht-physiologischen und starr. Diese Endothelzellen-Modell vereint die planare Topologie der Lipid-Doppelschichten mit dem physiologischen Substrat eines klassischen APC, um eine optimale räumliche und zeitliche Bildauflösung in einer physiologischen Umgebung zu liefern.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Frühere Arbeiten haben zum Teil diese Hindernisse durch Entwicklung planaren Substrat Modellen (dh Lipiddoppelschichten und Antikörper-beschichteten Oberflächen), welche optimale Raum-Zeit-Auflösung (dh bereitzustellen umgangen über Fixierung des T-Zell-Aktivierungsfläche in einem einzigen Plan, die parallel zu der optimalen xy Bildgebung Ebene) ^11-15 (1B). Diese Modelle haben wichtige Einblicke in die subzelluläre / ​​Molekulardynamik, die Antigen-Signalisierung in T-Zellen, einschließlich der Entdeckung der dynamischen Aktin / TCR Signalisierung Mikro-Clustern ^7,11-14 Kontrolle erleichtert. Allerdings sind solche Modelle von Natur aus stark vereinfacht, sowie starre (Ausschluss der Entwicklung / Untersuchung der 3-dimensionale topologische Merkmale) (1B). Daher bleibt es unsicher, wie man solche Feststellungen phy beziehensiologic Zell-Zell-Immunüberwachung.

Obwohl noch under werden vaskulären und lymphatischen Endothelzellen als großen Schwellen (dh mehr in den Zahlen als alle professionellen APCs, die von ~ 1.000-fach) Peripheriefach 'semi-professionellen "APCs ^16-18. Diese Zellen exprimieren MHC-I- MHC-II- und einer Vielzahl von Co-Stimulator Moleküle (zB CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, nicht aber CD80 und CD86) und sind strategisch an der Blut-Gewebe-Grenzfläche, wo sie dienen spezialisierte Sentinel-Funktionen ^16-18 positioniert. Frühere Studien zeigten, dass Endothelzellen wirksam neu zu stimulieren Effektor / Memory, aber nicht naiv, T-Zellen ^19-25. Somit sind Endothelzellen wahrscheinlich einzigartig APC Rollen in Effektorphase adaptive Immunantworten in den peripheren Geweben, wie etwa lokale Einfluss auf T-Zellaktivierung, Differenzierung, Speicher und Toleranz ^16,17,26 spielen. Crimatisch, wenn sie in vitro gezüchtet, Endothelzellen bilden praktisch planaren Zelloberflächen und leicht transfektierbare (beispielsweise mit fluoreszierenden Reporterproteine). Diese Eigenschaften sind ideal für hohe Raum-Zeit-auflösende Bildgebung der topologischen Dynamik während der Zell-Zell-Wechselwirkungen ^19,27. So Endothelzellen als physiologische 'planaren Zell APC-Modell ausgesprochen geeignet für die Untersuchung der subzellulären / molekulare Umbaumechanismen, die Antigen-Erkennung zu fahren und zu regulieren Antworten (1C) ^19,20 dienen könnte.

Vorher festgelegten komplementären Bildgebungstechniken (einschließlich Transfektion der Endothelzellen mit fluoreszierenden Protein Trägern der Plasmamembran und Cytosol) zur Untersuchung der Details der Leukozyten-Endothel-Interaktion während der Adhäsion und transendotheliale Migration ^27, zeigte, daß Leukozyten die Oberfläche des Endothels Sonde aktiv durch dynamische Insertion eind Einfahren der Submikron-Maßstab, Actin-reiche zylindrischen Vorsprünge (~ 200-1000 nm Durchmesser und Tiefe) bezeichnet invadosome artigen Vorsprüngen (dh "ILPs ') ^27,28. Diese bildgebenden Ansätze wurden weitere mit der Erstellung von Protokollen erweitert, um die Vorteile der endothelialen APC-Funktion, um die ersten Methoden zur hohen Raum-Zeit-auflösende Bildgebung des T-Zell-endothelialen immunologischen Synapse wie berichtet ^19,20 entwickeln und weiter zu beschreiben hier. Eine zentrale Erkenntnis aus diesem neuartigen planaren Zell APC-Modell abgeleitet ist, dass T-Zell-ILPs funktionieren sowohl bei der Förderung der anfänglichen Ag Nachweis und bei der Aufrechterhaltung nachfolgende Signalisierung. Tatsächlich Arrays von mehreren ILPs (die stabilisiert und als Reaktion auf aufgelaufene Calciumfluss initial wurden) zeigen die Anreicherung in TCR und Molekülen andeutend aktives Melde wie PKC-Q, ZAP-70, Phosphotyrosin und HS1. Daher ILPs scheinen eine dreidimensionale physiologischen äquivalent der TCR-Signalgebung Mikro darstellenCluster in planare Doppelschicht-Modellen gesehen. Dieser Ansatz, so zeigt sensibel / Berichte molekularen und architektonischen (und stillschweigende biomechanischen) Dynamik sonst nicht nachweisbar.

Das hier beschriebene Verfahren ist nützlich, um die Lücke zwischen professionellen APC und künstliche APC-Substrat-Modelle, um unsere Fähigkeit, grundlegende Mechanismen der adaptiven Immunantwort zu verhören zu verbessern. Während hier der Schwerpunkt auf der Aktivierung von ^CD4 + Th1-Typ-Effektor / Speicherzelle kann dieser Ansatz leicht modifiziert werden, um eine breite Palette von T-Zell-Typen und Ags zu studieren, wie unten diskutiert.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente mit primären menschlichen T-Zellen und im Handel erhältlich primären humanen Endothelzellen (dermal oder Lungenmikrovaskulären ECs) .Any Forschungsprotokoll am Menschen muß durch eine Ethikkommission genehmigt werden und eine schriftliche Einverständniserklärung muss von zur Verfügung gestellt werden durchgeführt Jede Blutspende. Experimente durchgeführt, unter Verwendung dieses Protokolls wurden von der IRB der Diakonisse Beth Israel Medical Center bestätigt.

1. Vorbereiten Menschen ^CD4 + Th1 Effektor / Memory T-Zellen

1. Bewerben Stauschlauch an den Arm des Spenders, wischen Vene mit Alkohol, und Nadel. Langsam ziehen 15 ml Blut in EDTA Vacutainer Verwendung als Antikoagulans. Wenn das Blut gezogen worden ist, lösen die Blutsperre, bevor Sie die Nadel. Druck, mit steriler Gaze gewickelt, wenn die Nadel entfernt wird unmittelbar gelten.
2. Übertragen Sie Blut in ein 50 ml Röhrchen. Hinzufügen RPMI-1640 bei Raumtemperatur zu einem 1: 1-Verdünnung (Endvolumen 30 ml). Die verdünnte sorgfältig überlagernd Blut auf zwei 50 ml-Röhrchen mit 15 ml vorgefilterten Lymphozyten Isolationsmedium, wie beispielsweise Ficoll-Paque bei RT.
3. Zentrifugieren Sie die Steigung bei RT für 30 min bei 1200 × g in einer Schwingbecherrotor. Während der Zentrifugation vorbereiten T-Zell-Medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin / Streptomycin).
4. Nach dem Entfernen der 50-ml-Röhrchen aus der Zentrifuge beachten vier Schichten: ein Pellet aus roten Blutzellen in der Unterseite, die Paque, eine Schicht von Zellen, die weiße Blutzellen (einschließlich Lymphozyten) und des Plasmas enthält. Die weißen Blutzellschicht mit einer Pasteurpipette und Transfer in einem 50 ml Falcon-Röhrchen vorsichtig entfernen.
5. Durch Zugabe von RPMI-1460 RT (bis zu 20 ml) und Zentrifugieren bei RT für 5 min bei 1.200 x g wasche die weißen Blutzellschicht. Resuspendieren der weißen Blutzellen in 1 ml der T-Zellmedium. In 5 ul der 1 ml Zellsuspension auf 250 & mgr; T-Zell-Medium in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben und vorsichtig mischen nach oben und unten mit einer Pipette.
6. In 25 ul verdünnted Zellsuspension in 25 ul 0,4% Trypanblau. Zugabe von 10 ul des Gemisches auf jeder Seite einer Standard Hämozytometer.
7. Zeigen Hämozytometer auf einem Low-Power-Lichtmikroskop. Unter Verwendung eines 10X-Objektiv zählen die Anzahl der lebenden Zellen, die das Trypanblau ausgeschlossen sind und in der Mitte Platz von beiden Seiten des Hämozytometer vorhanden sind.
8. Um die Zellkonzentration zu berechnen, multiplizieren den Durchschnitt der 2 Plätze 100 (Verdünnungsfaktor) und dann mehrfach um 10 ^4, die Anzahl der Zellen / ml zu erhalten.
9. Einstellen der Endkonzentration von 0,5 x ¹⁰ 6 Zellen / ml in T-Zellmedium. Hinzufügen einer Endkonzentration von 1 ug / ml jeder der bakteriellen Superanti Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) und das toxische Schocksyndrom Toxin 1 (TSST) zu den Zellen. Kultur für 72 Stunden (37 ° C und 5% _CO 2), um die CD4 ⁺ T-Zellpopulation zu erweitern.
10. Pellet-T-Zellen (1.200 xg, 5 min) und resuspendieren in 0,5 ^× 10 6 Zellen / ml in T-Zellmedium mit demZugabe von humanem IL-15 (20 ng / ml). Transfer-Lymphozyten zu einer T150-Kolben. Weiterhin geteilte Zellen zeigen / in voller mittel IL-15 alle 24-48 h nach Bedarf (basierend auf Medien Farbe, dh, wenn Medien dreht sich von rosa bis hellgelb) danach. Pflegen Sie die resultierenden Lymphozyten-Population für die bis zu 15 Tage.
    HINWEIS: Mit dem Design, wird dieses Protokoll zu aktivieren und zu erweitern gezielt Teilmenge von ^CD4 + T-Zellen, die SEB und TSST reaktiv sind und dann fahren sie in Richtung einer Th1-ähnlichen Effektor / Memory-Phänotyp. Andere weiße Blutzellen nicht überleben und wachsen unter diesen Bedingungen, so daß für Schritt 1.10 die Zellen mindestens 95% CD4 ⁺ CD45RO ^{+ -T-Zellen 19} ist, wie sich leicht durch Durchflusszytometrie beurteilt werden. Falls gewünscht, kann eine weitere Reinigung leicht durch kommerziell erhältliche Antikörper / magnetische perlenbasierte positive oder negative Selektionssätze erzielt werden.

2. Starten primären humanen Endothelzellkultur

1. Beschichten einer T25-Flasche mit Fibronectin (FN) 20 ug / ml in PBS unter sterilen Bedingungen. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 30-60 min. Entfernen Sie FN und mit 5 ml Vollmedium (Endothelial Basal Medium (EBM-2) Medium mit Endothelial Growth Medium (EGM-2) SingleQuots ergänzt). Pre-Inkubat in 37   ° C Zellkulturbrutschrank für mindestens 30 min.
2. Auftauen eine Phiole gefroren menschlichen Lunge oder dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HLMVECs oder HDMVECs) in einem 37 ° C Wasserbad unter gelegentlichem vorsichtigem Rühren für ca. 2-3 min. Unmittelbar Zellen zu übertragen, um T25-Kolben mit vorgewärmten Medien. Vorsichtig schwenken und in Brutschrank bei 37 ° C.
3. Ändern Sie die Medien nach ~ 4-6 Stunden. Weiter zur Medien etwa alle 48 Stunden (oder, wenn Medien wird leicht gelb), bis Platte erreicht ~ 90-95% Konfluenz zu ändern.

3. Allgemeine Splitting und Expansion von Endothelzellen

1. Wachsen Zellen, um ~ 90-95 Konfluenz. Dies kann 2-5 Tage dauern. Zum Spalten,entfernen Medien und mit PBS spülen. Entfernen PBS und ersetzen Sie mit Mindestvolumen von frischem 1x Trypsin (0,5 ml für T25 oder 1,5 ml für T75). Vorsichtig schwenken, um alle Oberflächen mit Trypsin zu decken. Bei 37 ° C für ca. 5 min. Überwachen Sie die Ablösung der Zellen von der Platte mit einem Low-Power-Lichtmikroskop.
2. Beim Großteil der Zellen erscheinen abgerundet oder freistehend, fügen 5 Volumen (dh gegenüber dem Trypsin Volumen aufgenommen) vorgewärmtes komplette EGM-2-Medium und sanft Pipette über die Oberfläche des Kolbens, um alle Zellen zu lösen.
3. Zählen Endothelzellen mit einem Hämozytometer nach 1.6-1.7 beschrieben. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (5 min, 1200 x g). Entfernen Sie den Überstand. Passen Konzentration auf 0,5 Mio. Zellen pro ml durch Zugabe von vorgewärmten komplette EGM-2 MV Medien.
4. Übertragen Aliquots der Zellen an die entsprechende FN-beschichteten Schalen oder Flaschen für die Wartung. Vorsichtig schwenken und in den Inkubator. Ändern Sie die Medien innerhalb von 6-12 h der Plattierung. Medien shoULD etwa alle 48 Stunden danach verändert werden.

4. Endothelzellen Transfektion

HINWEIS: Primäre Endothelzellen sind refraktär Transfektion durch häufigste chemische und Elektroporation Methoden. Das unten beschriebene Kern Transfektion basierende Verfahren ermöglicht bei relativ hohen Transfektionseffizienz (~ 50-70%). Eine wirksame alternative Methode ist die Verwendung einer Infektion durch geeignete virale Vektoren (siehe Kommentare in der Material Tabelle).

1. Vorbereitung T25 oder T75-Kolben (je nach Bedarf) von HLMVECs oder HDMVECs auf eine Enddichte von 90-95% confluency.Coat mit Fibronectin (FN) 20 ug / ml in PBS in sterilen Bedingungen entweder Mikroskop Kulturplatten, wie Delta-T-Platten (für Schritt 5) oder 12 mm kreisförmigen Deckgläser in einer Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte (für Schritt 6 platziert) mit, wie oben (2.1) beschrieben.
2. 1 ml komplettes EGM-2 Nährmedien in Kultur Mikroskop platesor 0,5 ml zu jeder 24-Well-Platten und äquilibriereneinem befeuchteten 37 ° C / 5% CO _{2 -Inkubator.}
3. Ernte und zählen Endothelzellen wie in den Schritten 3.1-3.3.Centrifuge das erforderliche Volumen von Zellen (0,5 Millionen Zellen pro Probe) bei 1.200 xg für 5 Minuten bei RT. Zellpellet vorsichtig in 100 ul RT Kern Transfektionslösung pro Probe.
4. Kombinieren Sie 100 ul der Zellsuspension mit 1-5 & mgr; g DNA. Übertragen Sie Zell / DNA-Suspension in zertifizierten Küvette; Probe muss den Boden der Küvette luftblasenfrei abdecken.
   HINWEIS: Die Konstrukte Targeting YFP oder DsRed an die Zellmembran (über die N-terminalen 20 Aminosäuren von Neuromodulin, die ein Signal für posttranslationale Palmitoylierung enthält) wurden allein (alone membran YFP oder membran DsRed allein) oder in Mischung mit einem Co-transfiziert zytoplasmatische Volumenmarker (zB Membran-YFP und DsRed löslich). Viele Permutationen von fluoreszierenden Protein-Marker kann verwendet werden.
5. Schließen Sie die Küvette mit dem Deckel. Setzen Sie die Küvette mitZell / DNA-Suspension in den Küvettenhalter des Elektroporator und gelten Elektroporation Programm S-005. Nehmen die Küvette aus dem Halter, sobald das Programm beendet ist.
6. In ~ 500 ul des voräquilibriert Kulturmedien in die Küvette und entfernen Sie vorsichtig die Zellsuspension aus der Küvette mit den Kunststofftransferpipetten im Nuklear Transfektion Kit bereitgestellt.
7. Für Experimente mit Mikroskop Kulturplatten zu partitionieren die Zellsuspension von einer Reaktions gleichmäßig zwischen zwei Schalen mit vorgewärmten Medien (Schritte von 4,2 bis 4,3). Für Experimente mit 24 gut / Platte, Partition einer Reaktions gleichmäßig zwischen 3 Brunnen.
8. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 ° C / _5% CO 2 Inkubator und ändern Medien 4-6 h, und wieder bei 12 bis 16 h nach der Transfektion.

5. Live Cell Imaging and Analysis

1. Vorbereiten Endothel
   1. Tag 0: Co-Transfektion von primären HLMVECs mit Membran-YFP und DsRed lösliche über eine nucleofection-Technologie, wie in Schritt 4 und Platte beschrieben, auf Live-Cell-Imaging-Kulturplatten.
   2. Tag 1: Medium durch frisches Medium, das IFN-γ (100 ng / ml) an MHC-II-Expression zu induzieren Ersetzen. Am Tag 2. Stimulieren transfizierten Zellen durch Zugabe von 20 ng / ml TNF-α an die vorhandenen Medien.
   3. Am Tag 3, Inkubation das Endothel mit 1 ug / ml jeder der bakteriellen Superantigene Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) und toxischen Schock-Syndrom-Toxin 1 (TSST) bei 37 ° C für 30-60 min unmittelbar vor den Experimenten. Lassen Sie diesen Schritt für "Ag" Kontrollbedingungen.
2. Vorbereiten Lymphozyten
   1. Parallel zu Schritt 5.1.3 bereiten Puffer A (Phenolrot-frei HBSS) mit 20 mM Hepes, pH 7,4 und 0,5% v / v Humanserumalbumin und 37 vorgewärmt, ° C. Nehmen Sie eine Probe von kultivierten Lymphozyten und zu bestimmen, die Dichte durch Zählung mit einem Hämozytometer (Schritt 1,12 bis 1,17).
   2. Zentrifuge 2 Millionen Zellen pro Probe nach 1,200 × g für 5 min bei RT in einem 15 ml konischen Röhrchen. Aspirat Medien und vorsichtig resuspendieren Zellpellet in 2 ml Puffer A, so dass keine Zellklumpen bleiben.
   3. Entfernen Sie ein frisches Aliquot von Fura-2 Calcium-Farbstoff und resuspendieren in DMSO, um eine Stammkonzentration von 1 mM zu machen.
   4. Add 2 ul Fura-2-Stammlösung zu dem T-Zellsuspension (2 & mgr; M Endkonzentration) Das Röhrchen und unmittelbar durch Umschütteln des Rohres an eine gleichmäßige Dispersion des Farbstoffs sicherzustellen. Bei 37 ° C für 30 min.
   5. Zentrifuge nach Schritt 5.2.2. Saugen Sie Buffer-A und vorsichtig, aber gründlich resuspendieren Lymphozyten in 20-40 ml frisches Buffer-A.
3. Live-Cell-Imaging-Setup und Akquisition
   HINWEIS: Eine Vielzahl von Systemen kann für Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung am aufrechten und inversen Lichtmikroskopen eingesetzt werden. Grundlegende Anforderungen umfassen eine Fluoreszenzlichtquelle und Filter, eine CCD-Kamera, motorisierte Filterschalt und Fensterläden, einen beheizten Bühne (oder Microscope-montierbar beheizten Kammer) und Software für die automatisierte Bildaufnahme. Für dieses Protokoll mit hoher numerischer Apertur, hoher Vergrößerung (dh 40X, 63X) Ölimmersionsobjektive sind erforderlich, um die notwendige räumliche Auflösung zu erreichen. Besondere Sorgfalt ist bei der Auswahl der geeigneten Fluoreszenzquelle und Linsen für Fura-2-basierte Kalzium-Imaging, da nicht alle mit den erforderlichen 340/380 nm Anregungswellenlängen sind kompatibel gemacht werden. Ein alternativer Ansatz (kompatibel mit Standard-grünen und roten Fluoreszenzfiltersätze) können mit nicht ratiomentic Calcium-sensitiven Farbstoffen verwendet werden (zB Fluo-4, Rhod-3), die allerdings nicht genau zu quantifizieren, Calcium-Fluss und nur eine relative bieten / quantitative Auslesen.
   1. Schalten Sie Mikroskopsystem (PC für den Betrieb, Mikroskop, CCD-Kamera, Filterrad und Xenon-Lampe).
   2. Öffnen Sie die Software bezeichnet.
   3. Set up Mikroskop / Software für die automatische Mehrkanal-Zeitraffer-Bildgebung. Gehören sequentielle Akquisition der adDifferenzweg Interferenzkontrast (DIC), Standard-grüne Fluoreszenz, Standard rot fluoreszieren und Standard 340 und 380 nm Anregungs Fura-2 Bildern. Stellen Sie das Intervall für den Erwerb für 10-30 sec und einer Gesamtdauer von ~ 20-60 min.
      1. Stellen Sie Belichtungszeiten für Fura-2-Bildgebung.
         1. Add frischen Ziel Öl und montieren ein Mikroskop Schale mit nur 0,5 ml Puffer-A auf die Heizstufe Adapter und schalten Sie sofort auf, um bis 37 ins Gleichgewicht ° C (dauert ~ 2-3 min).
         2. In Ruhe Fura2 belasteten Lymphozyten an den montiert Mikroskop Gericht Kammer unter Verwendung einer 20 ul-Pipette.
         3. Schalten Sie Hellfeldabbildung. Wählen Sie den Lichtweg zu den Okularen. Verwenden Sie den Grobtriebknopf auf objektive in Kontakt mit Boden der miscoscope Gericht zu bringen. Verwenden Sie das Okular und der Feinfokusknopf, um auf die T-Zellen am Boden der Schale angesiedelt konzentrieren.
         4. Verwenden Sie die XY-Stufe steuert, um ein Feld mit mindestens 10 Zellen auswählen. Vermeidenüberfüllten Feldern und Zellklumpen, da diese Bildartefakte erstellen.
         5. Wechsel von Hellfeld-Lichtquelle Leuchtstofflampe. Schalten von Okular-Bildgebung zur CCD-Kamera. Stellen Erfassungsparameter (zB Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und Binning). Verwendung der Software acquire ruht Fura2-340 und Fura2-380 Bilder (beginnend mit gleicher Belichtungszeit für jeden, in der Regel im Bereich von ~ 200-1000 ms).
         6. Verwenden Sie die in Schritt 5.4.1, um die Fura2-340 / Fura2-380 für jeden Lymphozyten berechnen beschriebenen Methoden. Führen wiederholten Iterationen der Einstellung der Fura2-340 und Fura2-380 Belichtungszeiten, Erfassen von Bildern und Berechnen von Verhältnissen, bis die Durchschnittswerte sind in der Nähe 1.
      2. Stellen Sie Belichtungszeiten für mem-YFP und DsRed.
         1. Ersetzen Sie das Mikroskop Gericht in Schritt 5.3.3.1 mit einem miscroscope Gericht verwendet transfiziert, aktiviert und der SAG behandelt (oder unbehandelt, Kontrolle) HLMVECs oder HDMVECs aus Zellkulturbrutschrank (Schritte 4.5.1). Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette schnell Medien zu entfernen, spülen einmal durch Zugabe von ~ 1 ml vorgewärmten Puffer-A. Saugen Sie und fügen Sie 0,5 ml Puffer-A.
         2. Identifizieren Sie Bereiche, in denen hell fluoreszierende positive Transfektanten Endothelzellen vorhanden sind und scheinen gesund mit gut ausgebildeten interzellulären Verbindungen.
         3. Passen Erfassungsparameter (zB Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und Binning) für mem-YFP und DsRed. Achten Sie darauf, dass mittlere Fluoreszenzsignalintensität in jedem Kanal liegt zwischen 25% und 75% der Dynamikbereich des Detektors.
   4. Führen Sie Live-Cell-Imaging-Experiment.
      1. Verwenden Sie automatisierte Software zur Bildaufnahme beginnen und erfassen mehrere Intervalle der Bilder auf die Grundlinie zu etablieren.
      2. Während der Erfassung anzuwenden ~ 5 ul konzentrierter Fura-2-beladenen Lymphocyten (aus Stufe 5.2) auf der Mitte der Bildgebungsfeldmikroskop Schale durch Einführen der Spitze einer kleinen Volumen (P-5oder P-20) der Pipette in den Medien in der Nähe der Mitte der Objektiv und Auswerfen langsam.
      3. Als Lymphozyten in das Bildfeld zu regeln, Feineinstellungen in den Fokus, um sicherzustellen, dass die T-Zell-Endothel Zellschnittstelle (immunologischen Synapsen) sind in der Brennebene gehalten. Mit 40 und 63X Ziel, ~ 10-20 Zellen pro Feld sind optimal. Wenn weniger Zellen in der Bildfeld wiederholen Sie Schritt 5.3.4.2 beobachtet.
      4. Nachdem der gewünschte Beobachtungsintervall von Experiment traten weiterhin Bildgebung und sofort pipettieren Ionomycin direkt in den miscoscope Schale (unter Verwendung der Technik, wie in 5.3.4.2) zu einer Endkonzentration von 2 & mgr; M, um eine maximale Calciumfluss / Fura-2 Signalisierungssignal zu induzieren (dh , ein Mittel zur Kalibrierung finden Sie unter Analysis 5.4.).
      5. Als Alternative zu den gewünschten Beobachtungsintervall des Versuchs 5.3.4.4after wird konkurrierten, sofort saugen Sie den Buffer-A und ersetzen Sie es mit 0,5 ml Fixierungslösung (3,7% Formaldehyd in PBS) für 5 min beiRT, gefolgt von dreimaligem Spülen mit PBS. Dann fahren Sie mit Schritt 6.
4. Die Analyse der Bildgebung lebender Zellen
   HINWEIS: Nach der Speicherung von Dateien übernommen werden, können sie direkt analysiert oder mit einer Vielzahl von Off-line-Bildanalyse-Software-Anwendungen zur Analyse exportiert werden. ImageJ ist ein besonders wertvolles, sehr vielseitiges Paket, das frei verfügbar und kompatibel mit fast jedem Erfassungssoftware-Paket ist. Die Konstruktion der in den Schritten 5.1-5.3 beschriebenen Abbildungsexperimente mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung Dynamik der Wechselwirkungen zwischen Lymphocyten und Endothelzellen APC in Abwesenheit und Gegenwart von kognaten SAg ergeben. Nahezu grenzenlose Analysen möglich sind, wenn es um Bilddaten von zellulären morphometrische / Signaldynamik. Die in diesem Protokoll beschriebenen spezifischen Ziele sind koordinativ quantifizieren Lymphozytenmigration und Signalgebung (dh die Kinetik und die Höhe der intrazellulären Calcium-Flux) sowie dynamischeal ändert in der immunologischen Synapse Architektur mit Schwerpunkt auf spezifischen Merkmalen (dh ILPs / Podo-Drucke). Die folgenden sind Beispiele für separaten Standard-und Nicht-Standard (dh, die speziell für diesen Experimenten / Fragen entwickelt) analysiert.
   1. Messen Sie Lymphozyten Calciumfluss
      1. Wählen Sie die anfängliche Fura2-340 ₍₃₄₀ nm _EX-510 nm EM) und Fura2-380 ₍₃₈₀ nm _EX-510 nm EM) Bilder, die vor der Zugabe der Lymphozyten erworben wurden. Verwenden Sie diese als Hintergrundbildern und subtrahieren sie von der alle Bilder in der Zeitreihe für den jeweiligen Kanal digital.
      2. Für jeden Zeitpunkt zu erstellen einen digitalen Verhältnis Bild des Hintergrunds-subtrahiert Fura2-340 und den Hintergrund-subtrahierten Fura2-380 Bilder (dh ₃₄₀ nm _EX-510 nm EM-Hintergrund / ₃₈₀ nm _EX-510 nm EM-Hintergrund).
      3. Wählen Sie die entsprechende Software-Zeichenwerkzeug. Klicken Sie auf den Bildschirm, um einen kreisförmigen Bereich von i zu ziehennterest (ROI) um jede Lymphozyten. Diese werden ein Pixel gemittelten Verhältniswert für jede Lymphozyten und Zeitrahmen zu erzeugen.
      4. Zeichnen Sie die berechnete Verhältnis als eine Funktion der Zeit unter Verwendung eines geeigneten Software-Anwendung (zB Tabellenkalkulation). Berechnen gemittelt Calciumfluss für das Experiment durch Summieren der Verhältniswerte aller Lymphozyten pro Feld und Dividieren dieses Wertes durch die Gesamtzahl der Lymphozyten für jeden Zeitpunkt
   2. Zuführen lympocyte Migrations Tracking-Analyse.
      1. Analysieren Zelle T-Zell-Migration unter Verwendung eines geeigneten Zell Tracking-Software-Anwendung (zB ImageJ) mit Hilfe des DIC-Kanal von jedem Video. Mit ImageJ Handy-Tracking-Plugin, identifizieren in jedem Rahmen des Schwerpunkts jeder Zelle manuell durch Anklicken in jeder Vollbildverfahren.
      2. Mit den daraus resultierenden Serien xy-Koordinaten (dh Spuren der Migrationspfade), um die mittlere Geschwindigkeit (Gesamtabstand migriert / Gesamtintervall o berechnenf Imaging) und die Tortuosität (Gesamtabstand migriert / die lineare End-zu-End-Abstand zwischen dem Zellenposition in der ersten und letzten Bild).
      3. Cross-Korrelation dieser Parameter mit den Calcium-Fluss (5.4.1) Dynamik auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
   3. Beurteilen Sie die Podo-print / ILP-Dichte innerhalb des IS
      1. Zählen Gesamtzahl der ILP in jedem T-Zelle gebildeten definierten Intervallen (zB 5 Minuten nach der Zugabe von T-Zellen). Diese können diskrete Mikrometermaßstab fluoreszierende Membran-YFP Ringe, die co-lokalisieren mit dunklen Ringen in zytoplasmatischen DsRed auf der endothelialen APC an einer Stelle Lymphozytenadhäsion identifiziert werden.
      2. Kreuzkorrelation der resultierenden 'ILP Indizes' mit Calciumflusses (5.4.1) Dynamik auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
   4. Messen Sie den Podo-print / ILP Lebenszeiten.
      1. Für jede Podo-print / ILP in einem bestimmten IS berechnet seinen Lebzeiten als der letzte Zeitpunkt, zu dem ein ILP zu sehen war - dem Zeitpunkt, wenn das Podo-print / ILP first erschienen. Durchschnittliche ILP Lebenszeiten sowohl pro IS.
      2. Quer korrelieren diese Lebensdauern mit Calciumflusses (5.4.1) Dynamik auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
   5. Beurteilen Sie die zeitliche Beziehung zwischen Erstausbildung ILP Bildung und Calciumfluss.
      1. Für jede Lymphozyten identifizieren den Zeitpunkt (Frame), bei dem Calcium ersten steigt über der Grundlinie ^19.
      2. Für jede Lymphozyten identifizieren den Zeitpunkt, zu dem die erste Podo-print / ILP angezeigt.
      3. Für jede Lymphozyten-Berechnung ein "Offset-Zeit 'durch Subtraktion der Anfangscalciumfluss Zeitpunkt von der des ursprünglichen Podo-print / ILP. Der Mittelwert der Werte für alle Lymphozyten in einem Feld. Positive Werte zeigen die ILP Bildung vorausgeht Calciumfluss während negative Zahlen zeigen das Gegenteil.
         HINWEIS: Diese Experimente können leicht unter physiologisch relevanten laminare Scherströmung mit im Handel erhältlichen Parallelwandströmung Bildgebung Kammern durchgeführt werden, wie beschrieben, ¹9.

6. Fest Cell Imaging und Analyse

1. Fixendpunkt T-Zell-Endothel ist die Bildung und Färbung
   1. Vorbereitung T-Zellen, wie in 1 beschrieben, vorbereitet Endothelzellen (- / + SAg), wie in Schritt 5.1 (Transfektion, wird Schritt 5.1.1 optional). Nehmen Sie eine Probe von kultivierten Lymphozyten und zu bestimmen, die Dichte durch Zählung mit einem Hämozytometer (Abschnitt 1).
   2. Übertragen einer Lymphozytenkulturvolumens in Höhe von mindestens 3 x 10 ⁵ Lymphozyten / Probe in ein 15 ml konisches Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 3 min. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Lymphozytenpellet in Puffer A (Schritt 5.2.1) Konzentration von 6 x 10 ⁵ Lymphozyten / ml.
   3. Entfernen Sie die Endothelzellen aus dem Zellkulturbrutschrank und (fortfahren einer Probe zu einem Zeitpunkt) sukzessive absaugen Medien und ersetzen mit 0,5 ml Lymphozytensuspension (3 x 10 ⁵ Lymphozyten / Probe), und ersetzen Sie bis 37 ° C incubator.
   4. Nach entsprechender Inkubationszeit, oben erwähnt, absaugen Medium aus den Vertiefungen ein und gebe ausreichend Fixationslösung (3,7% Formaldehyd in PBS), um die Probe vollständig zu bedecken (zB in 24-Well-Platte ~ 300-500 ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten.
   5. Spülen Probe 3-mal mit PBS. Durch Zugabe von primären Antikörper für 60 min bei RT Fleck (siehe Liste). Wenn der primäre Antikörper an ein intrazelluläres Protein gerichtet ist, muss eine zusätzliche Permeabilisierung Schritt durch Zugabe von ausreichend Permeabilisierung Lösung (0,01% Triton X-100 in PBS), um die Probe für 1 min bei RT vollständig bedecken geführt werden. Spülen Probe 3-mal mit PBS. In geeignete Sekundärantikörper (in einigen Fällen gleichzeitig fluoreszierende Phalloidin) für 60 min bei RT.
   6. Montieren Sie den kreisförmigen Deckglas auf einem Bildträger. Fixendpunkt T-Zell-Endothel ist die Bildung und Färbung. Um Abbildungs ​​Stelle beginnen die Abbildungsschieber enthaltenden Proben auf dem Mikroskoptisch und wählen Sie das 63X ÖlObjektiv. Bewerben frischen Immersionsöl.
2. Verwenden Sie das Hellfeld-Bildaufnahmemodus und Augenlinsen, um die Brennebene zu lokalisieren. Wechseln Sie zu Epifluoreszenz und prüfen Probe über den Augenlinsen. Wählen Sie ein Feld von Interesse. Wechseln Sie in den Laser-Scanning-Modus.
3. Verwendung der Fast-Scan-Modus und arbeiten im weitesten Bereich können einzeln Laserleistung und die Verstärkung jedes Kanals einzustellen, um das Signal, so dass im Idealfall erreicht der bestimmten Signalintensität zu optimieren mindestens ca. 25% und nicht mehr als 75% des dynamischen Bereichs der Detektoren.
4. Manuellen Fokus steuert, schnell durch die Z-Achse zu scannen und identifizieren die oberen und unteren Grenzen der Unterteilung (in der Regel sämtliche Informationen innerhalb einer Dicke von ~ 15 & mgr; m enthalten sein). Wählen Sie die Z-Achsen-Schnittdicke im Bereich von ~ 0,2 bis 1,0 & mgr; m.
5. Schließlich Zoom / beschneiden Sie das Bildfeld auf den spezifischen Bereich von Interesse und Verhalten Scan. Zusätzlich dazu, dass sehr helle und spezifische Fluoreszenz signal in der Probe, den Erwerb hochauflösende 3D-Bildgebung erfordert Iterationen des Scannens und der Anpassungen an Erfassungsparameter. Das Ziel ist, eine maximale xy und z-Achsen-Auflösung, ohne nennenswerte Photobleaching erhalten.
6. Qualitative Analyse der Topologie der Topologie des 3D wird durch Leiten digitaler 3D-Rekonstruktion der resultierenden optischen Sektionen durch eine geeignete Anwendungssoftware (zB Bild J). Durch ähnliche Anwendungen quantitativ zu erfassen Fluoreszenzsignalverteilung (zB Pearson-Co-Lokalisation und korrelative Fluoreszenzintensität Zeilenanalyse und orthogonal Leser).

Ergebnisse

Eine neuartige Abbildungsansatz mit Endothelzellen und Kombinieren der Auflösung Vorteile der planaren Lipiddoppelschicht-Modell mit der physiologischen Komplexität und Verformbarkeit professionelle APCs wurde (Figur 1) entwickelt. 2 stellt Beispiele von typischen Migration, Calciumflusses und topologische Dynamik bei dieser beobachtete Ansatz. In Abwesenheit der SAG auf Endothel SAG-spezifische ^CD4 + Th1-Lymphozyten schnell verbreiten, zu pol...

Diskussion

Insgesamt ist dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung Endothelzellen als i) under physiologischen APCs und ii) als eine neue Art von "planare Zell APC-Modell". In Bezug auf die frühere, wurde es zunehmend klar, daß nicht-hämatopoetischen peripheren (oder "Stromazellen") APCs spielen kritische, nicht redundanten Rollen (dh gegenüber hämatopoetischen APCs) bei der Gestaltung der adaptiven Immunantwort ^16-18. Unter solchen 'semi-professionellen "APCs, vaskuläre...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD Vacutainer Stretch latexfreies Tourniquet	BD Biosciences	367203
BD Alkoholtupfer	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Druckknopf Blutentnahmeset	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Vor Gebrauch in RT bringen
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450	Hitzeinaktiviertes
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Trypanblau	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
Staphylokokken-Enterotoxin		BT202RED	Stammlösung 1mg/ml in PBS toxisches
Schocksyndrom Toxin 1	Toxin Technology	TT606RED	Stammlösung 1mg/ml in PBS
humanes IL-15	R& D Systems	247-IL-025	Stammlösung 50ug/ml in PBS
PBS	Life Technologies	10010-049
Fibronektin	Life Technologies	33016-015	Stammlösung 1mg/ml in H20
HMVEC-d Ad-Dermale MV Endozellen	Lonza	CC-2543	Andere humane mikrovaskuläre ECs können verwendet werden, z.B. HLMVECs
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Stammlösung 10x, verdünnt in PBS
amaxa-HMVEC-L Nukleofector Kit	Lonza	vpb1003	Erforderliches Kit für Schritt 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Stammlösung 1mg/ml in H20
TNF-alpha 10ug, human	Life Technologies	PHC3015	Stammlösung 1mg/ml in H20
Phenol Rotfrei HBSS	Life Technologies	14175-103
Hepes	Fisher Scientific	BP299-100
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C1016-100G	Stammlösung 1M in H20
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	208337	Stammlösung 1M in H20
Humanserumalbumin	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F fluoreszenzfreies Immersionsöl	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Life Technologies	F1221	Stammlösung 1mM in DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
pDsRot-Monomer (lösliches zytoplasmatisches DsRot)	Clontech	632466
pDsRot-Monomer Membran (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-Aktin	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Formaldehydlösung 37%	Fisher Scientific	BP531-500	Giftig, Abzug verwenden
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Falcon 15mL Konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50mL Konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-49A
Mit Falcon Gewebekulturen behandelte Kolben T25	Fisher Scientific	10-126-9
Mit Falcon Gewebekulturen behandelte Kolben T75	Fisher Scientific	13-680-65
Mit Corning Zellkulturen behandeltes T175	Fisher Scientific	10-126-61
Abdeckgläser aus Glas	Fisher Scientific	12-545-85	12 mm Durchmesser
Falcon Tissue Culture Plates 24-well	Fisher Scientific	08-772-1
Delta-T Platten	Bioptechs	04200415B
Wheaton Einweg-Pasteur-Pipets	Fisher Scientific	13-678-8D
1,5 ml Eppendorf Tube	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 Maus Anti-Human-BD	Biosciences	555509
HS1 Maus Anti-Human-BD	Biosciences	610541
Anti-Human-CD11a (LFA-1alpha) Gereinigt	ebioscience	BMS102
Anti-Human-CD3 Alexa Fluor® 488	ebioscience	53-0037-41
Anti-MHC Klasse II Antikörper	Abcam	ab55152
Anti-Talin 1 Antikörper	Abcam	ab71333
Anti-PKC Theta Antikörper	Abcam	ab109481
Phosphotyrosin (4G10 Platin)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Erforderlicher Elektroporator für Schritt 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison Software	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Serie 60) Biologische Sicherheitswerkbank	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 ° C, 5% CO2 Zellkultur-Inkubator	Fisher Scientific	202370
Zentrifuge 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hämozytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hämozytometer
Isotemp Wasserbad Modell 202	Fisher Scientific	15-462-2