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Methodenartikel

A Novel Mausmodell der arteriovenöse Fistel Ausfall: Der chirurgische Eingriff im Detail

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DOI:

10.3791/53294

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3. Februar 2016

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1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden University Medical Center, 3Department of Surgery, Leiden University Medical Center, 4Division of Nephrology, University of Cincinnati

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Mausmodell des Versagens von arteriovenösen Fisteln (AVF), in das eine klinisch relevante Anastomosenkonfiguration integriert ist. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Pathophysiologie zu untersuchen und mögliche therapeutische Interventionen zu testen.

Zusammenfassung

Die arteriovenöse Fistel (AVF) leidet immer noch unter einer hohen Anzahl von Ausfällen, die durch unzureichenden Umbau und Intimahyperplasie verursacht werden, von denen die genaue Pathophysiologie unbekannt bleibt. Um die Pathophysiologie zu entschlüsseln, wurde ein murines Modell des AVF-Versagens entwickelt, bei dem die Konfiguration der Anastomose der bevorzugten Situation im klinischen Umfeld ähnelt. Es wurde ein Modell beschrieben, in dem eine AVF angelegt wird, indem das venöse Ende des Astes der Vena jugularis externa mit der Seite der Halsschlagader durch unterbrochene Nähte verbunden wird. Auf histologischer Ebene beobachteten wir progressive stenotische Intimaläsionen im venösen Ausflusstrakt, die auch bei fehlgeschlagenen humanen AVFs zu beobachten sind. Obwohl dieses Verfahren aufgrund der geringen Abmessungen des Tieres technisch anspruchsvoll sein kann, konnten wir nach ausreichender Schulung eine chirurgische Erfolgsquote von 97% erzielen. Der entscheidende Vorteil eines Mausmodells ist die Verfügbarkeit von transgenen Tieren. In Anbetracht der verschiedenen vorgeschlagenen Mechanismen, die für das AVF-Versagen verantwortlich sind, kann die Deaktivierung von Genen, die eine Rolle beim vaskulären Umbau spielen könnten, uns helfen, die komplexe Pathophysiologie des AVF-Versagens zu entschlüsseln.

Einleitung

Eine funktionelle Gefäßzugangsleitung ist von entscheidender Bedeutung für Patienten mit Nierenversagen, die auf chronischer Hämodialyse hängen am Leben zu bleiben. Der Aufbau eines arteriovenöse Fistel (AVF) ist derzeit die bevorzugte Wahl für Gefäßzugang. Allerdings bilden AVF Komplikationen im Zusammenhang mit einer der Hauptursachen für Morbidität bei Patienten unter chronischer Hämodialyse. Trotz der umfangreichen wissenschaftlichen Bemühungen, keiner der neue Ansätze AVF Zugang im Zusammenhang mit Komplikationen zu reduzieren, hat zu erheblichen Verbesserung der AVF Haltbarkeit führen. Ein Teil dieser enttäuschenden Fortschritte betrifft unvollständigen Verständnis der Pathophysiologie der Hämodialyse Zugriffsfehler.

Um die Pathophysiologie der AV-Zugriffsfehler, Tiermodelle zu entwirren, die eng der menschlichen Pathologie imitieren sind von größter Bedeutung. In diesem Zusammenhang nicht nur die Tierarten, sondern auch die Anastomose, die erforderliche Anti-Gerinnungstherapie und die Dauer der Follow-up nach Überspannungsry sollte in Betracht 1 entnommen werden. Während die großen Tiere am besten geeignet für Interventionsstudien ausgerichtet sind neue therapeutische Strategien zu entwickeln, haben murine Modelle das größte Potenzial mehr Einblick in die molekularen Mechanismen zu gewinnen zugrunde liegenden AV-Zugriffsfehler aufgrund der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von Mäusen für diesen Zweck zu geringeren Kosten im Vergleich zu größeren tierischen Gebrauch verwendet werden.

Die erste Mausmodell der AVF Scheitern im Jahr 2004 von Kwei und et al. 2 beschrieben wurde in diesem Modell wurden AVFs mit der Halsschlagader und die Halsschlagader in einer Ende-zu-Ende-Weise konstruiert einen intravaskulären Katheter. Dieses Modell könnte nützlich sein, früh venösen Anpassung in AVFs zu studieren, obwohl die End-to-End-Konfiguration und das Vorhandensein eines intravaskulären Katheter, die Gültigkeit dieses Modell für den menschlichen AVFs begrenzen. Eine verbesserte AVF Modell wurde von Castier und et al vorgestellt. 3, in der das EndeDie Halsschlagader wird zur Seite der Jugularvene verbunden. AVFs bei Hämodialyse-Patienten werden jedoch gewöhnlich durch anatomizing das Ende einer Ader zur Seite einer Arterie konstruiert. Die genaue Konfiguration des AVF ist ein entscheidendes Merkmal eines Modells AV Zugang, da es die hämodynamische Profil innerhalb der Leitung 4 bestimmt. Letzteres ist ein wichtiger Faktor Dysfunktion und anschließende Entwicklung von Intimahyperplasie (IH) 5 an Endothelzellen.

Eine neuartige Mausmodell wurde vor kurzem mit einem identischen anatomischen Konfiguration entwickelt wie beim Menschen 6 verwendet wird. In diesem Modell AVF sind in C57BL / 6-Mäuse geschaffen, indem das Ende eines Zweiges der äußeren Halsschlagader auf der Seite der Arteria carotis communis mit Knopfnähten anastomosirenden. In der vorliegenden Arbeit konzentrieren wir uns auf die mikrochirurgische Verfahren dieses Modell, um die weit verbreitete Verwendung von diesem Mausmodell zu erleichtern, richtet die komplexe Pathophysiologie zu entwirrenvon Hämodialyse-Zugriffsfehler.

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Protokoll

Alle Experimente wurden vom Ausschuss für Tierschutz des Leiden University Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere und Anästhesie

  1. Betäuben die Maus (1-3 Monate alt) in einer kontinuierlichen Narkoseeinleitung Kammer mit 3-4% Isofluran gefüllt.
  2. Rasur der ventralen Seite des Nackens und der Innenteil des linken Oberschenkels mit einem elektrischen Rasierapparat und mit einem Stück Klebeband, das Haar zu entfernen.
  3. Bewerben Augensalbe auf beiden Augen.
  4. Positionieren Sie das Tier auf der Heizdecke, an dem die Nase Beatmungsmaske befestigt ist. Fixieren Sie den Kopf mit dem Nasenmaske mit Klebeband.
    1. Luft 0,3 l / min, 100% Sauerstoff 0,2 l / min: Isofluran in einer Konzentration von 1,5 bis 2,0% mit Sauerstoff angereicherte Luft Satz unter der folgenden Strom fördern. Drücken Sie die Haut zwischen den Zehen der Narkosetiefe zu beurteilen und die Konzentration von Isofluran anpassen, wenn nötig.
  5. Fixieren Sie das Tier zu derHeizdecke mit Klebeband an allen Gliedern, die bei ungefähr 37 ° C in einer Rückenlage festgelegt ist.
  6. Injizieren gelöst Buprenorphin in Natriumchlorid (NaCl) 0,9% bei einer Dosierung von 0,1 mg / kg zusammen mit 0,5 ml steriler 0,9% NaCl subkutan in der Flanke des Tieres.
  7. Übernehmen Chlorhexidin Tinktur 0,5% auf die vorbereitete Fläche.

2. Hautschnitt

  1. Positionieren Sie das Tier unter dem Mikroskop mit dem Kopf in Richtung des Chirurgen.
  2. Machen Sie einen Längsschnitt von etwa 1,5 cm in der Mittellinie der ventralen Hals ein Mikro Schere verwenden.
  3. Besorgen Sie sich die Speicheldrüsen mit einer Pinzette und verdrängen das Recht Speicheldrüse kranial, bis es teilweise außerhalb der Wunde ist.

3. Präparieren und Vorbereiten des Vein

  1. Identifizieren und unverblümt die dorsomedialen Zweig der rechten äußeren Halsschlagader vollständig von seiner perivaskulären Gewebe sezieren durch die Verbreitung nur einLängsseite und in Richtung des Blutgefäßes.
  2. Legen Sie eine Schleife (10,0 Naht) um den seziert Vene und einen Knoten anwenden, ohne sie zu sperren.

4. Entfernen der Kopfnicker

  1. Mit einer Pinzette, sezieren unverblümt die richtige Kopfnicker von seiner Umgebung durch an der Grenze zu verbreiten. Setzen Sie ein Paar offener Zange unter dem isolierten Muskeln und abzubinden es proximal und distal mit einem 6,0 Naht. Anschließend zuschneiden den Muskel ein Ausbrenner verwenden.

5. Zergliedern und Vorbereiten der Arteria carotis communis

  1. Identifizieren und sezieren die rechte Arteria carotis communis Pinzette. Legen Sie eine 6,0 Nähfaden um die Arterie in der Manipulation der Arterie zu unterstützen.
  2. Bewerben Sie sich so distal Gefäßklemmen und proximal wie möglich.
  3. Machen Sie einen Längsschnitt in der Mitte der Arterie von etwa 1 mm die spezialisierte Mikro Schere verwenden.
  4. Spülen Sie dieArterie mit einer Heparin-Lösung [100 IE / ml], bis der Behälter von Blut ist klar.
  5. Messen und die Länge des Einschnitts anpassen, wenn notwendig, die Breite der Gefäßklemme [1.1 mm] entsprechen.

6. Ligation der Vene

  1. Tragen Sie eine Gefäßklemme proximal von dem bereits vorbereitet Vene und setzen Sie einen Faden um die Vene.
  2. Sie vorsichtig Schwanz Traktion auf die Vene ein haemostat verwenden, die auf dem Faden gelegt und Ligation der Vene als distal wie möglich mit dem 10,0 Naht, die früher getätigt.
  3. Schneiden Sie die Vene eine Schere gerade proximal zu dem Ligation unter Verwendung.
  4. Anhand von Gefäß Zange öffnen sanft das Lumen der Vene und spülen Sie ihn mit einer Heparin-Lösung [100 IU / ml].

7. Schaffung von Anastomose Teil 1

  1. Verbinden Sie die Vene zur Arterie mit einem Knopfnaht (10.0) unter Verwendung von 2 Quadrat Knoten an der Zwölf-Uhr-Position durch eine Naht folgte am sechs o 'Uhr-Position. Sicherstellen, dass die Vene in die Arterie zu verbinden, ohne dass es seine eigene Achse zu drehen, um. Drehen Sie das Tier, um die chirurgische Freilegung zu verbessern.
  2. Positionieren Sie einen Faden um die Vene und gelten sanfte Seitenführung eine haemostat verwenden.
  3. Mit den gleichen Nähten, vervollständigen die Anastomose von etwa 3-4 zusätzliche Nähte in dem sichtbaren Bauchseite der Anastomose platzieren.

8. Heparingabe

  1. Drehen Heizdecke 180 ° und fokussieren Sie das Mikroskop auf der linken Oberschenkel.
  2. Identifizieren der Oberschenkelvene / Arterie / Nervenbündel durch eine Gefäßstruktur suchen, der in Längsrichtung in den medialen Teil des oberen Schenkels verläuft und durch die Haut gesehen werden. Einen Einschnitt mit dem Mikroscheren von etwa 1 cm direkt über die Oberschenkelvene in einer Längs Weise.
  3. sezieren vorsichtig das perivaskuläre Gewebe von Vena femoralis und injizieren Heparin in einer Dosis of 0,2 IU / g Körpergewicht in die Oberschenkelvene.

9. Schaffung von Anastomose Teil 2

  1. Zurück zu den Nackenbereich und entfernen Sie den Faden, der um die Vene getätigt.
  2. Legen Sie einen Faden (6,0), die später unter der Halsschlagader verläuft, über die Vene und wieder unter die Halsschlagader. (Abbildung 1 l)
  3. Entfernen Sie den venösen Gefäßklemme.
  4. Als nächstes drehen Sie den arteriovenöse Fistel 180 ° entlang der Achse der Halsschlagader im Uhrzeigersinn um die Gefäßklemmen sowohl durch gleichzeitiges Drehen Hälfte abgeschlossen und medial Traktion zu den Enden des Fadens anzuwenden.
  5. Füllen Sie das Anastomose in der gleichen Weise wie in Schritt 7.2 beschrieben wird.

10. Gefäßklemme Removal

  1. Entfernen Sie den Faden und drehen das Gefäß 180 ° gegen den Uhrzeigersinn klemmt.
  2. Entfernen Sie die distal von der proximalen Gefäßklemme gefolgt Gefäßklemme.
  3. Bewerten Sie die Durchgängigkeit der Anastomose durch sanft das venöse Ausflusstrakt mit den Gefäßzange verschließt. Im Falle einer Patent Anastomose, die Pre-verdeckenden Venenabschnitt wird in einer pulsierenden Art und Weise erweitern. Stellen Sie den richtigen Speicheldrüse mit seiner ursprünglichen anatomischen Position mit einer Pinzette.

11. Wundverschluss und Nachsorge

  1. Schließen die Haut des oberen Schenkels mit einer ununterbrochenen Naht (6.0).
  2. Schließen Sie die Haut des Halses mit einer ununterbrochenen Naht (6.0).
  3. Entfernen Sie das Tier aus der Wärmedecke und injizieren 0,5 ml NaCl 0,9% subkutan.
  4. Legen Sie das Tier in einem abgedunkelten Käfig, der mit einer Wärmelampe erhitzt wird und lassen Sie es vollständig erholen. Wenn ein Tier nicht vollständig erholen, stellen Sie sicher, dass es nicht von einer hämodynamischen Schock leidet wegen in das Operationsgebiet zu Blutungen. Achten Sie auf Anzeichen wie eine geschwollene Hals und das Austreten von Blut.
  5. Nach etwa 6 Stunden nach der ersten Injektion von BUPRenorphine injizieren eine Einzeldosis einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung von Buprenorphin subkutan in einer Dosis, die vom Hersteller empfohlen wird, um eine adäquate Analgesie für eine zusätzliche 72 Stunden zu liefern.

12. Gewebeernte

  1. Betäuben das Tier mit einem Anästhetikum-Mischung, die Midazolam (5 mg / kg), Medetomidin (0,5 mg / kg) und Fentanyl (0,05 mg / kg) intraperitoneal verabreicht.
  2. Fixieren Sie das Tier in Rückenlage durch Nadeln durch seine Pfoten und Wangen in einen nicht beheizten Silikonmatte einlegen.
  3. Einen Einschnitt von ungefähr 1,5 bis 2,0 cm über die Narbe am Hals mit dem Mikro-Schere.
  4. Präparieren Sie die AVF und legen Nahtfäden (6.0) um die proximal, distal Arterie und venösen Ausflusstrakt zur einfachen Identifizierung.
  5. Bewerten Sie die Durchgängigkeit der AVF, wie in Abschnitt 10.3 des Protokolls beschrieben.
  6. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch eine mediale Laparotomie durchführen usingen die Mikro Schere.
    1. Schnitt durch den linken und rechten ventralen Brustkorb mit einer Schere ausgehend kaudal im Medioklavikularlinie verwenden. Mit Hilfe eines Mikro Schere, durchschneiden die Membran, die in den mittleren Teil des ventralen Brustkorb befestigt und anschließend diesen Abschnitt verdrängen kranial Pinzette.
    2. Suchen Sie die minderwertige Hohlvene und durchschneiden es mit einer Mikroschere.
  7. Legen Sie eine Nadel 23 Gauge-Nadel in die linke Herzkammer und Perfusion bei einem Druck von etwa 100 mmHg mit PBS, bis die intravasale Flüssigkeit fast klar.
  8. Ohne die Nadel entfernen, perfundieren jetzt mit 4% Formalin für 10 min bei einem Druck von etwa 100 mmHg.
  9. Zuschneiden die AVF durch Durchtrennung sowohl die Arterien und Venen mit dem Mikroscheren und tauchen sie in einer 4% igen Formalinlösung O / N.

13. Gewebeeinbettung und Schnitte

  1. Verarbeiten Sie das Gewebe zu Paraffin nach der Herstellung des Protocol. Das Protokoll angewendet wie folgt zusammen:
    1. Tauchen in 70% Ethanol für 1 h bei RT. 2x wiederholen.
    2. Tauchen in 96% Ethanol für 1 h bei RT. 2x wiederholen.
    3. Tauchen in Ethanol 99,5% für 1 h bei RT. Wiederholen Sie einmal.
    4. Tauchen in Ethanol 99,5% für 1,5 h bei RT.
    5. Tauchen in Xylol 100% für 1 h bei RT. Wiederholen Sie einmal.
    6. Tauchen in Parafin 1 h bei 62 ° C. 2x wiederholen.
  2. Betten Sie die AVF in Paraffin, so dass der venöse Ausflusstrakt senkrecht zur Einbettungskassette ausgerichtet ist.
  3. Mit Hilfe eines Mikrotoms, erstellen 12 Serienschnitte, die jeweils mit einem 5 & mgr; m Dicke von 30 Abschnitten besteht. Dann jedes Serienbereich, stellen Sie einen Abschnitt auf einer einzigen Glasmontage ausgehend von Position eins bis zwölf in einer geordneten Art und Weise mit dem Bereich beginnend am nächsten an der Anastomose.

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Ergebnisse

Nach dem Anlegen der Anastomose (Abbildung 1), sollte die Durchgängigkeit von kurz Verschließen des venösen Ausflusstrakt mit einem Gefäß Zange beurteilt werden. Wenn die Anastomose Patent ist, sollte die Gefäßwege proximal zur Okklusion eindeutig in einer pulsartigen Weise erweitern. Zusätzlich wird die Durchlässigkeit unter Verwendung nahen Infrarot Fluoroskopie (NIRF) bestätigt, die effektiv als Angiographie Funktionen (Abbildung 2). Ein Ausfall in der chirurgischen Prozedur kann zu ...

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Diskussion

Die AVF gilt als die Achillesferse in der Hämodialyse-Behandlung zu sein. Leider leidet die AVF noch von einer hohen Anzahl von Versagen 8-10. Trotz intensiver Forschung über die zugrunde liegenden Mechanismen, bleibt die genaue Pathophysiologie unbekannt. Zahlreiche Mausmodellen für haben AVF Scheitern in der Literatur bereits 2,3,11,12 beschrieben worden. Keines dieser Modelle umfassen eine venöse Ende arterielle Anastomose Konfiguration, die am meisten in der klinischen Situation verwendet wird....

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch einen Zuschuss der Dutch Kidney Foundation (KJPB 08.0003) unterstützt.

Carolien Rothuizen wird für ihren Beitrag zur Studie gedankt. Hoang Pham ist für seine Unterstützung bei der Aufarbeitung der Pathologie bekannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PräpariermikroskopLeicaM80
PinzetteMedicon07.61.25
GefäßzangeS& TJFL-3D.2
GefäßzangeS& TD-5a.2
PinzetteRobozSS/45
Mikroschere 5 mm KlingeFine Science Tools15000-08
Micro Schere 2 mm KlingeFine Science Tools15000-03
SchereMedicon05.12.21
Clip Applier 1S& S TCAF-4
Gefäßklemme 1S& TB-1V
Clip applier 2BBraunFE572K
Gefäßklemme 2BBraunFE740K
Hämostatische PinzetteBBraunBH110
10.0 NähteBBraunG1117041
6.0 NähteBBraun768464
CauterizerFeinwissenschaftliche Werkzeuge18010-00
NadelhalterMedicon11.82.18
AugensalbePharmachemie41821101
Chlorhexidin-Tinktur 0,5%Leiden University Medical CenterNA
HeparinLeo Pharma012866-08
BuprenorphinRB Pharmaceuticals 
IsofluranePharmachemie45,112,110
AnästhesiemaskeUniversität Maastrichtmaßgeschneiderte
MidazolamActavisAAAC6877
DexmedetomidinOrion141-267
FentanylBipharma15923002
Kontinuierliche Anästhesie-InduktionskammerLösungen für VeterinärmedizinAN010R
283732

Referenzen

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