Hierin schlagen wir eine Strategie vor, um die Wirkung eines interessierenden Transkriptionsfaktors auf das microRNA-Transkriptom unter Verwendung öffentlich zugänglicher Daten, Rechenressourcen und Hochdurchsatzdaten von microRNA-Arrays nach der Transfektion von Zellen mit kleiner Haarnadel (sh)RNA zu untersuchen, die auf einen interessierenden Transkriptionsfaktor abzielt.
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Methodenartikel
Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während die Transkriptionsregulation der Protein-kodierenden Gene ausgiebig untersucht wurde, ist nur wenig bekannt darüber, wie Transkriptionsfaktoren in der Transkription von nicht-kodierenden RNAs beteiligt sind, insbesondere von Mikro-RNAs. Hier schlagen wir eine Strategie, um die potentielle Rolle des Transkriptionsfaktors zu studieren an der Transkription von microRNAs regulieren öffentlich verfügbaren Daten, Rechenressourcen und hohem Durchsatz Daten. Wir verwenden die epigenetischen Signatur H3K4me3 zu microRNA Promotoren und Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) -sequencing Daten aus dem ENCODE-Projekt identifizieren zu microRNA Promotoren zu identifizieren, die mit Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen angereichert sind. Durch Transfektion von Zellen von Interesse mit shRNA einen Transkriptionsfaktor von Interesse und Aussetzen der Zellen an microRNA Array Targeting untersuchen wir die Wirkung dieses Transkriptionsfaktors auf der microRNA Transkriptom. Als anschauliches Beispiel verwenden wir unsere Studie über die Wirkung von STAT3 auf der microRNA Transkriptom der chronischen lymphocytic Leukämie (CLL) Zellen.
Einleitung
MicroRNAs sind endogene kleine, nicht kodierende regulatorische RNAs, die typischerweise als negative Regulatoren der mRNA-Expression auf der posttranskritionelle Ebene funktionieren. Etwa 1000 nicht-codierende 20 bis 25 Nucleotide langen mikroRNAs im menschlichen Genom zu finden sind 1,2. MicroRNAs regulieren die Genexpression durch kanonische Basenpaarungen zwischen dem Keimsequenz des mikroRNA und sein komplementärer seed Übereinstimmung Sequenz, die üblicherweise am 3'-untranslatierten Region (UTR) der Ziel-mRNAs befindet. Zusammenfassend regulieren mikroRNAs mehr als 30% der Protein - codierenden Gene 3, aber nur wenig über die Transkription von DNA von mikroRNAs bekannt. Es wurde vorgeschlagen, dass die Regulation der Transkription MikroRNA , die der mRNA 4,5 ähnlich ist. Insbesondere ähnlich wie seine Aktivität Transkription von Protein - kodierenden Gene bei der Förderung, sind Transkriptionsfaktoren gedacht 6 Transkription von microRNAs zu aktivieren. Der Transkriptionsfaktor-microRNA Zusammenspiel wurde als Modulator Faktor der Genexpression 7, berichtet und kann auch Feedback- und Feedforward - Schleifen bilden. Zum Beispiel Yamakuchi et al. Berichteten von einer Rückkopplungsschleife , in der p53 die Expression von microRNA34a induziert, die wiederum Translation des p53 - Repressor SIRT hemmt und dadurch Erhöhung p53 Aktivität 8.
Während spezifische Beispiele von Transkriptionsfaktor-abhängige Expression von microRNAs berichtet worden, die eine anerkannte Methode, um Informationen darüber, wie ein Transkriptionsfaktor von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom bietet fehlt. Der Zweck des Protokolls hier vorgeschlagen ist, eine eingehende Beschreibung der Transkriptionsfaktor-abhängige Regulation der microRNA-Transkriptom zu liefern. öffentlich verfügbaren Daten, Bioinformatik-Tools Durch die Kombination und Microarray-Technologie, die Forscher, die diesen Algorithmus folgen zu erfassen wäre in der Lage zu einer genomischen Maßstab, wie jederTranskriptionsfaktor in jedem Zelltyp von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom und ein mutmaßliches Beitrag des Transkriptionsfaktors-mRNA bei der Regulierung der microRNA Ausdruck zu erkunden.
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Protokoll
1. Identifizieren Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in dem Promoter von microRNA Gene, Data Mining-Ansatz
- Verwenden Sie die University of California Santa Cruz (UCSC) Genom-Browser Chromatinimmunpräzipitation (CHIP) Sequenzierungsdaten als Teil der Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) Projekt erzeugt zu extrahieren.
- Öffnen Sie die Tabelle Browser im UCSC Genom-Browser.
- Verwenden Sie die folgenden Spezifikationen, die Tabelle zu extrahieren: Clade: (Säugetiere), Genom: (Mensch), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), Gruppe: (Verordnung), Schiene (TxnFactorChIP), Tabelle: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), Region : (Genome), Ausgabeformat (alle aus ausgewählten Tabelle Gene).
- Speichern Sie die Ausgabe von 1.1.2 als TXT-Datei und in eine Tabelle.
- Sortieren und Filtern für den Transkriptionsfaktor von Interesse (zB STAT2).
- Verwenden Sie die Liste von microRNA Vermittler auf Basis von H3K4me3 Epigenetik Signatur verfügbar bei Baeer et al. 9 . Kopieren Sie diese Liste in eine .txt-Datei.
- Zur Anpassung nach Koordinaten auf dem menschlichen Genom, zeichnen sie die Daten von 1.1 und 1.2 (zB Bindung von STAT3 auf mutmaßliche microRNA - Promotoren) und bestimmen Sie die mittlere Bindungsaffinität mit dem Code in C geschrieben scharf wie in ergänzenden skizzierte Codierung Datei 1.
2. Verwenden Sie shRNA Down-Regulierung der Expression eines Transkriptionsfaktors von Interesse
- Platte 1.5 x 10 6 Zellen von humanen embryonalen 293 - Nierenzelllinie in 10 cm Platte bei etwa 50% Konfluenz (DMEM mit 10% FBS).
- Transfizieren Zellen von humanen embryonalen 293-Nierenzelllinie mit 5 ug grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) Lentivirus shRNA enthält gerichtet an den Transkriptionsfaktor von Interesse und mit 5 ug Verpackungsvektoren Transfektionsreagenz für adhärente Zellen unter Verwendung von dem Protokoll des Herstellers entsprechend.
- Als Kontrolle mit den Zellen aus 293 menschlichen embryonalen Nierenzelllinie zu transfizierenverwürfelten shRNA und die Verpackungsvektoren dem Protokoll des Herstellers entsprechend.
- Halten Sie Transfektionsgemisch auf Zellen für 16 Stunden (bei 37 ° C, CO 2 Inkubator), dann wird ein neues Medium 10% DMEM - Medium mit 10% FBS auf 10 ml geändert werden .
- Warten Sie 48 Stunden nach der Transfektion Zentrifugation der Zellkultur (300 × g, 5 min) und sammeln infektiösen Überstand. Filtriere den Überstand durch ein 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter (25 mm tensidfrei Celluloseacetat-Membran), um alle schwebenden Zellen zu entfernen.
- Konzentrieren Sie den Überstand und sammeln die Lentiviren ein Ultrazentrifugalmühle Filtervorrichtung mit Schwellenwert von 100 kDa. Spin bei 950 xg für 30 - 60 min, bis das Volumen hat Konzentrats auf weniger als 250 & mgr; l. Lagern Sie das konzentrierte Virus bei -80 ° C.
- Transfizieren der Zellen mit der lentivirus. Entfernen Sie gefrorene Lentiviren von -80 ° C Gefrierschrank und tauen auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 100 ul Virusüberstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bring das Volumen in dem Rohr zu 1 ml mit reduziertem Serum-Medium auf. In Hexadimethrinbromid zu 1 ml Virussuspension für die endgültige Konzentration von 10 ng / ml, vorsichtig mischen und lassen Sie die Mischung für 5 Minuten stehen.
- Zentrifuge 5 x 10 6 Zellen für jede Transduktion und sanft das Zellpellet in 0,5 ml Medium , das Virus resuspendieren. Lassen Sie die Zellen für 4 im Inkubator bleiben - 24 Stunden, dann wurden 0,5 ml Medium in einer Endkonzentration von 10% FBS mit 20% FBS hinzufügen.
- Warten Sie 48 bis 72 Stunden und färben die Zellen mit Propidiumiodid (PI) und grün fluoreszierendem Protein (GFP) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schützen Sie die Zellen , die aus Licht und mit einem FACS - Sorter die Raten der GFP + / PI zu messen - Zellen. Da PI Flecken nur tote Zelle, ist diese Rate eine Schätzung der Transfektionseffizienz in lebenden Zellen.
- Sortieren Sie die positive Zellpopulation auf GFP - Expression (GFP +) durch FACS - Sorter wie zuvor 10 beschrieben.
- Verwenden Western Immun Blotting wie zuvor beschrieben 10 die Pegel eines Transkriptionsfaktors von Interesse vor und nach der Infektion der Zellen von Interesse (zB CLL - Zellen) mit den benannten shRNA zu bestimmen.
3. Bestimmen Sie die Expression von microRNA Transkriptom in Zellen, die mit Transcription Factor-shRNA
- Isolieren RNA Kommerzielle Kits nach Herstellerprotokoll.
- Beschriften Sie die RNA und hybridisieren es zu microRNA Microarray - 11.
- Bestimmen Sie die differentiell exprimierte microRNA in Zellen , die mit Transkriptionsfaktor-shRNA oder mit leerem Vektor Kontrollen 5.
- Überprüfen Sie die Microarray - Ergebnisse für die meisten differentiell exprimierten microRNAs unter Verwendung von Echtzeit - PCR - 5.
4. Bestimmen Sie die Überlappung zwischen den Bioinformatik und der shRNA-Ansatz in der Transkriptionsfaktor abhängige Transkriptom beschreiben
- detHermelin die erwarteten und beobachteten Verhältnisse von microRNA Gene , die Transkriptionsfaktor - Bindungsstellen in ihren Promotoren und wurden downregulated in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen beherbergen, gehen Sie wie folgt vor :
- Beziehen Sie das Verhältnis von Genen, die den Transkriptionsfaktor von Interesse an ihrem Promotor / Gesamt microRNA aus der Liste erzeugt in 1.3 Hafen. Diese Liste ist das erwartete Verhältnis (zB microRNA Gene mit STAT3 - Bindungsstellen / Gesamt microRNA Gene getestet = 0,25).
- Bestimmen Sie die Anzahl von Genen , die in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen aus der Liste in 3.3 erzeugt downregulated wurden und hat Transkriptionsfaktor von Interesse Bindungsstellen aus der Liste in 1.3 erzeugt. Diese Nummer / Gesamtzahl der nach unten reguliert Gene ist das beobachtete Verhältnis (zB microRNA Gene mit STAT3 sites / Gesamtzahl der downregulated microRNAs = 0,6 Bindung).
- Verwenden χ2 Statistik zeigt den beobachteten und erwarteten Verhältnisse zu vergleichen, die oben erzeugt wurden, und zu bestimmen, ob die Liste von Genen, die in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen herunterreguliert wurden in ihrem Promotor mit Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen angereichert sind.
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Ergebnisse
STAT3 ist ein Transkriptionsfaktor , der typischerweise die Transkription von Genen induziert , die anti apoptotischen und proliferative Wirkungen 12. Ob STAT3 wirken sich auch auf die nicht-kodierende RNA Transkriptom derzeit nicht bekannt ist. In allen CLL - Zellen ist STAT3 konstitutiv phosphoryliert an Serin 707 Reste 10,13. Phosphoserin STAT3 Shuttles zum Kern, bindet an DNA und aktiviert Gene bekannt 10 durch Tyrosin pSTAT3 in anderen Zelltypen akti...
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Diskussion
Der Mechanismus der RNA-Polymerase II- abhängige Transkription von Protein-codierenden Genen zugrunde liegenden wurde ausgiebig untersucht. Während diese Elemente nur 1% ausmachen - 2% des menschlichen Genoms, Beweise aus dem ENCODE - Projekt legen nahe , dass mehr als 80% des menschlichen Genoms 17 Transkription unterzogen werden kann und was reguliert die Transkription der nicht-kodierenden DNA - Elemente , bleibt weitgehend unbekannt 6 .
Mehrere Studien, die zeigten ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der CLL Global Research Foundation unterstützt. Die University of Texas MD Anderson Cancer Center wird zum Teil durch die National Institutes of Health durch ein Cancer Center Support-Grant (P30CA16672) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0,45 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon Ultrazentrifugalfiltergerät mit einem Schwellenwert von 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol Reagenz | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Zelllinie | humane Sigma-Aldrich | 85120602 |
Referenzen
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