Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische In Utero Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Seit der ersten Beschreibung im Jahr 2001 von drei unabhängigen Gruppen ^1-3 i n utero Elektroporation hat sich zu einem weit verbreiteten Standard-Tool zur Analyse der Genexpression in der Nagetier zentralen Nervensystems. Im Vergleich zu der Erzeugung von Knockout-Mäusen, die, trotz kontinuierlich Verbesserung der Techniken, noch Zeit und Geld raub, die in utero Elektroporation gefällt durch ihre Einfachheit. Also, in utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle und effiziente Verstärkungs- und loss-of-function-Studien ^4.

Die Hirnregionen zu transfizieren, wird die Lösung, welche das negativ geladene Plasmid in einem Ventrikel injiziert. Während des elektrischen Impulses, wandert der negativ geladenen DNA zum positiven Pol und daher kann die transfizierte Region einfach durch Verändern der Position des positiven Pols ausgewählt werden. Es ist oft gezeigt worden, dass zahlreiche Regionen des zentralen Nervensystems können targeted ^3,5-8. Beispielsweise zeigen neuere Studien, spezifische Transfektionen des Hippocampus, der piriformen Cortex oder Striatum ^9-11. Die Information über den richtigen Positionen sind jedoch oft nur kaum standardisiert und sind nicht immer leicht zu verschiedenen Mäusestämme zu übertragen.

Transfektion bestimmter Embryonalstadien ist bei weitem nicht trivial. Viele Einflussfaktoren zu beachten bei der Auswahl des Set-up für bestimmte in utero Elektroporation genommen werden. Erstens, um optimal zu transfizieren, die entsprechenden embryonalen Stadien, ist das Wissen über die geeigneten Spannungen notwendig. Hohe Spannungen verringern die Überlebensrate, wohingegen niedrige Spannungen reduzieren die Transfektionseffizienz ^2,3,12. Auch die Größe der Elektrode Paddel spielt eine entscheidende Rolle, denn die Verwendung von Elektroden Paddel, die zu groß zu einer verringerten Spezifität sind oder Tod aufgrund von Erkrankung des Herzrhythmus ^4,12,13 verursachen. Die angelegteSpannung und die Größe und die Position der Elektrode Paddel sind die wichtigsten Merkmale zu berücksichtigen, es gibt aber auch weitere Faktoren, die die Ergebnisse der Elektroporation, wie die aufgebrachte Menge an DNA-Lösung.

Wir haben ein detailliertes Protokoll, das eine schnelle und effiziente Transfektion von verschiedenen Hirnregionen der C57BL / 6-Maus ¹² ermöglicht. In diesem Protokoll detaillierte Information über die Spannungen, die verwendet werden und die Größe der Elektrode Paddel für erhöhte Spezifität bereitgestellt. Weitere Information über die Herzkammer mit Empfehlungen für die Menge der Plasmid-Lösung und der Lage der Elektrode zugeführt wird, gefüllt werden. Die Anzeige der detaillierten Positionsinformationen in der Karte und der weiteren Darstellung von diesen Positionen ermöglicht eine einfache spezifische und effiziente in utero Elektroporation des retrosplenialen Cortex, dem motorischen Cortex, somatosensorischen Cortex piriformis cortex, ter Ammonshorn 1-3, dem Gyrus dentatus, das Striatum, die laterale Septum-Kern, der Thalamus und Hypothalamus.

Ethics Statement: Die Handhabung der Mäuse und die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit europäischen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt.

1. In Utero Elektroporation

Hinweis: In utero Elektroporation wurde wie zuvor veröffentlichten ^12,14. Daher ist das Verfahren nur kurz beschrieben in den folgenden (1).

1. Vorbereitungen
   1. Bereiten Fast Green farbigen endotoxinfreiem advanced Transfektion-Grade-Plasmid-Lösung (enthaltend 1,5 pCAGGS), wie zuvor beschrieben ^12.
   2. Ziehen und Schleifen (35 ° Winkel) Borosilikatglas Kapillaren (0,8-0,9 Durchmesser) für Injektionszwecke.
   3. Sterilisieren Instrumente.
2. Chirurgie
   1. Verwalten Analgetika (Carprofen, 4 mg / kg Körpergewicht, sc, 24-Stunden-Depot) mindestens 30 Minuten vor Beginn der Operation.
   2. Halten Sie die Längedie Anästhesie zu einem Maximum von 35-45 min (Stufe III - Phase der chirurgischen Anästhesie nach Guedel ¹⁵ - maximal 25-30 min).
   3. Anesthetize zeitlich trächtige Mäuse mit Isofluran (Induktion in einer Kammer: 2,8%, Chirurgie über Maske: 2,5%). Bestätigen Anästhesie durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise.
   4. Bewerben Augensalbe, um ins Auge Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
   5. Sterilisieren Sie den OP-Bereich mit 7,5% Providon-Jod-Lösung und decken Sie die Maus mit steriler Gaze (feucht mit 0,9% Benzylalkohol Kochsalzlösung) nur mit dem OP-Bereich ausgesetzt.
   6. Schneiden Sie die Bauchhöhle mit einem Skalpell (Hautschnitt: 1,5-2 cm, Muskel Einschnitt: 1-1,5 cm).
   7. Erhaltung der geöffneten Bauchhöhle vor dem Austrocknen durch Befeuchten mit erwärmtem 0,9% Benzylalkohol Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen isotonischen Lösung wie von Tierärzten oder Ausschuss gerichtet.
   8. Vorsichtig heraus Gebärmutterhörner (mit Ringzangen, die Gebärmutter mit dem Finger nicht berührens).
3. Injektion von DNA und Elektroporation. Hinweis: Die genauen Details für die auf bestimmte Regionen in Punkt 2.
   1. Langsam spritzen die farbigen DNA-Lösung in die Herzkammer, wie in Abbildung 1 und Abschnitt 2 über die vorbereiteten Borosilikatglas Kapillaren angezeigt.
   2. Tragen Sie die entsprechende Spannung für den entsprechenden embryonalen Phase (z. B. 36 bis 38 V zur E14) über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). Pulse die Elektroporation Paddel während des Anlegens der Spannung zu Schäden an der Gebärmutterwand zu minimieren.
4. Beitrag Elektroporation / post-operative Betreuung
   1. Vorsichtig wieder die Gebärmutterhörner in der Bauchhöhle.
   2. Naht der Muskeln und der Hautschnitt getrennt.
   3. Lassen Sie die Maus Rest auf einer Wärmevorrichtung für die Wiederherstellung.
   4. Beaufsichtigen Sie die Maus während der Wiederherstellung (Verhalten, Futtermittel undWasserverbrauch), 4 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Operation. Falls erforderlich, zusätzliche Analgetika (Carprofen, 4 mg / kg Körpergewicht, 24-Stunden-Depot) für weitere 2 Tage.

2. Transfektion von spezifischen Hirnarealen

Anmerkung: Die Position des positiven Pols wird als der Winkel zwischen der vertikalen Mittellinie durch die Herzkammer mit der DNA-Lösung (die rechte oder dritten Ventrikel) und der Position der mit dem positiven Pol gezeigt gefüllt. Beim Befüllen des linken Ventrikels die Positionen spiegelbildlich. In Figur 4 sind die Positionen der Gehör primordialen gezeigt, die wichtige Anhaltspunkte liefern.

1. Transfektion von kortikalen Arealen (2A, Tabelle 1).
   1. Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in utero Elektroporation von kortikalen Arealen verwenden E14 Embryonen.
   2. Injizieren 1,5-2 ul DNA-Lösung, die 4 & mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikelüber die vorbereiteten Borosilikatglas Kapillaren.
      1. Der Embryo sorgfältig zu positionieren, indem Ringzange, so dass es keine sichtbaren Gefäße über der Einstichstelle.
      2. Und injizieren die DNA-Lösung von etwa 0,75 mm koronal vom Lambdanaht und 0,5 mm lateral von der Pfeilnaht (Abbildung 3). Sicherzustellen, dass die Eintauchtiefe beträgt 1,2 mm (E14, von der Gebärmutterwand gemessen). Überprüfen Sie für eine blau-grüne Färbung mit einer scharfen Abgrenzung.
   3. Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms).
      1. Verwenden Sie ein 3 oder 5 mm-Elektrode Paddel.
      2. Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 36 bis 38 V.
      3. Legen Sie die Mitte der Elektroden nur vordere der Ohr primordia.
      4. Um die retrosplenialen Cortex Verwendung Winkel 330-0 ° transfizieren, um die motorischen Kortex 0-40 ° transfizieren, um den somatosensorischen Kortex 40-95 ° Transfektion, zur TransfektionCortex piriformis (2A) 95-110 ° beträgt.
   4. Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Opfern, die Mäuse und 4 Tage Analyse der Embryonen nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben.
2. Transfektion des Hippocampus (2B, Tabelle 1).
   1. Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in utero Elektroporation von Hippocampus verwenden E15 Embryonen.
   2. Injizieren 2 ul DNA-Lösung, die 4 & mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikel über den hergestellten Borosilikat Kapillaren.
   3. Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms).
      1. Verwenden Sie ein 3 oder 5 mm-Elektrode Paddel.
      2. Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 38 bis 40.
      3. Legen Sie die Mitte der Minuspol nur vordere des Ohres Primordium und dem Zentrum Of den Pluspol an der Mitte des Ohr primordium.
      4. Zur Transfektion von Gyrus dentatus verwenden Winkel von 190 bis 210 °, um die Ammonshorn (CA) 3 210 bis 230 ° zu transfizieren, um die CA2 230-250 ° transfizieren, um die CA1 250-275 ° (2B) zu transfizieren.
   4. Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Führen Analyse nach vollständiger Hippocampus (nach der Geburt, p21), wie in Kapitel 3 beschrieben.
3. Transfektion des lateralen Septums Kern und Striatum (2C, Tabelle 1)
   Hinweis: Die Winkel überschneiden sich mit denen, für die Transfektion der Hippocampus. Effektiv transfizieren die laterale Septum Kern und das Striatum ohne unerwünschte Hippocampus Transfektion früher Embryonalstadien (E12) verwendet werden müssen.
   1. Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für das in utero Elektroporation des lateralen Septums Kern und striatum zu verwenden E12 Embryonen.
   2. Injiziert 1 ul DNA-Lösung, die 4 & mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikel über den hergestellten Borosilikat Kapillaren.
   3. Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms).
      1. Verwenden Sie ein 0,5 mm-Elektrode.
      2. Verwenden Sie 33 V.
      3. Legen Sie die Mitte der Elektroden auf der Ebene der Ohr primordia.
      4. Die seitlichen septalen Kern Verwendung Winkeln von 100-170 ° zu transfizieren, um die Striatum 170-240 ° (2C) zu transfizieren.
   4. Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Opfern, die Mäuse und zu analysieren, die Embryonen 6 Tage nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben.
4. Transfektion des Thalamus und Hypothalamus (2D, Tabelle 1)
   1. Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in uTero Elektroporation der Thalamus und Hypothalamus Einsatz E12-E13 Embryonen.
   2. Injizieren 1-1,5 & mgr; l DNA-Lösung, die 4 & mgr; g DNA in den lateralen Ventrikel (links oder rechts) über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. Warten für 2-3 min, bis die Lösung in das dritte Ventrikel diffundiert. Alternativ direkt in den dritten Ventrikel zu injizieren.
      Hinweis: Dies verbessert Spezifität, aber vielleicht eine verminderte Überlebensrate (hohe Beschädigungsgefahr) führen.
   3. Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms).
      1. Verwenden Sie eine 0,5 oder 3 mm-Elektrode.
      2. Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 33 bis 35 V.
      3. Legen Sie die Mitte der Elektroden nur posterior die Ohr primordia.
      4. Zum Thalamus Verwendung Winkel 25-40 ° transfizieren, um die Hypothalamus 90-180 ° (2D) zu transfizieren.
   4. Führen Sie die nach der Elektroporation / post-operative Betreuung als described in Abschnitt 1.4. Opfern, die Mäuse und zu analysieren, die Embryonen 6 Tage nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben.

3. Perfusionsfixierung

1. Vorbereitungen
   1. Warm 4% Paraformaldehyd (PFA) auf 37 ° C.
   2. Füllen Sie einen 50-ml-Spritze mit PBS (4 ° C) und eine zweite Spritze mit aufgewärmt PFA. Vermeiden Sie Luftblasen.
   3. Verbinden der Spritzen zu einem Dreiwegehahn. Verbinden Sie das dritte Ende mit einem venenverweilkanüle (Schmetterling).
   4. Spülen Sie die venenverweilkanüle mit PBS.
2. Perfusion
   1. Tief betäuben die Mäuse (Schwangerschaft oder postnatale transfiziert) mit subkutanen Anwendung Ketaminhydrochlorid (60 mg / kg) und Xylazin (7,5 mg / kg).
   2. Bestätigen Sie die chirurgische Toleranzstufe durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise.
   3. Öffnen Sie die Bauchhöhle direkt unter dem Brustkorb.
   4. Schneiden Sie vorsichtig die Membran.
   5. Den Brustkorb öffnen Sie vorsichtig über einen Schnitt auf each Website bis zum Schlüsselbein.
   6. Legen Sie die Spitze des Schmetterlings in die linke Herzkammer (ausgehend von der Spitze des Herzens).
   7. Schneiden Sie die linke Herzohr.
   8. Langsam durchströmen die Maus mit PBS (ca. 10 ml).
   9. Schalten Sie den Dreiwegehahn.
   10. Perfusion der Maus mit 5-10 ml 4% PFA.
   11. Enthaupten die Maus mit einer Schere und sezieren das Gehirn beginnend am Foramen magnum. Führen Sie die Dissektion als bisher veröffentlichten ^16.
   12. Postfixate das Gehirn für 2 Tage in 4% PFA. Halten Sie die Gehirne bei 4 ° C im Dunkeln.

4. Immunhistochemie

1. Erzeugen 70 um Abschnitte (zB mit einem Vibratom).
2. Optional: Verbessern Fluoreszenz mit Antikörperfärbung.
   1. Blockieren die Abschnitte für 1 h bei RT (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normalem Ziegenserum)
   2. Inkubieren O / N mit dem entsprechenden Antikörper (Anti-GFP, 1: 1.000)
   3. Wash 3-5-Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer.
   4. Inkubieren Sie 3-5 Stunden mit dem entsprechenden Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 konjugierten Anti-Kaninchen-IgG, 1: 1.000).
   5. Optional: 4-6-diaminodino-2-phenylindol (DAPI, 0,2 g / ml in 0,1 M Phosphatpuffer) Gegenfärbung für 1 min.
   6. Analyse Fluoreszenz mit einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop.

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die spezifische in utero Elektroporation der Regionen entwickelt sich der retrosplenialen Hirnrinde, dem motorischen Kortex, dem somatosensorischen Kortex, die piriformen Cortex, Ammonshorn 1-3, dem Gyrus dentatus, das Striatum, die laterale Septum-Kern , Thalamus und Hypothalamus. Die Ergebnisse der Transfektionen sind gezeigt neben dem empfohlenen Winkel (Abbildung 2). Zur besseren Veranschaulichung der Winkel in vivo die Position der Elektrode (0,5 mm) werden ebenfalls auf einen Embryo (Abbildung 5, Embryos in utero, Embryos im Fruchtblase, seziert Embryo) gezeigt. Um bieten einen Überblick Tabelle 1 zusammengefasst die relevanten Fakten für spezifische Transfektion.

Ferner wurde gezeigt, daß die Größe der Elektrode spielt eine entscheidende Rolle für die Spezifität (Abbildung 6). Größere Größe der Elektrode Paddel führt zu larger transfiziert Bereichen als beispielhaft in Figur 6 gezeigt ist. Ferner sind die Elektroden, die zu groß Abdeckung zu viel des Embryos sind, wodurch das Risiko einer Beeinträchtigung des Embryos Herzrhythmus (7) verbessert wird. Zum Beispiel eine 10 mm Elektrodenpaddel umfasst die gesamte E12 Embryonen (Abbildung 7).

Figur 1. In utero Elektroporation. Grundschritte der Leistung des in utero Elektroporation gezeigt. (A) zeigt den gesamten Aufbau der Chirurgie, mit der Maus auf eine Heizplatte gelegt bereits mit Isofluran betäubt. (B) Die Desinfektion des Operationsfeldes ist ein entscheidender Schritt vor dem Öffnen der Bauchhöhle (C) der Maus. (D) Die DNA-haltige Lösung wird mit Fast G farbigenrüne, das die Visualisierung der erfolgreiche Injektion ermöglicht (E, F). Erfolgreiche Injektion in einen lateralen Ventrikel führt in die halbmondförmige Fleck. (G) Nach der Injektion die entsprechende Spannung wird über Zangentyp Platin-Elektroden angelegt. (H) Nach sorgfältiger Austausch der Gebärmutter in die Bauchhöhle die chirurgische Wunde vernäht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2. Winkel-Diagramm für die Elektroporation von bestimmten Bereichen im murinen Cortex, Hippocampus, Septum seitlichen Kern, Striatum, Thalamus und Hypothalamus. Die geeigneten Positionen für die positiven und negativen Pole sind in der schematischen Zeichnung dargestellt. Für (AC ng>) werden die Positionen zum Injizieren der DNA-Lösung in den rechten Ventrikel angegeben. Für Injektionen in die linke Herzkammer, die Winkel sind spiegelbildlich. Die spezifischen Transfektionen wurden histologisch verifiziert. (A) zeigt die Positionen der Plus- und Minuspol zur Transfektion von kortikalen Arealen (die retrosplenialen Kortex (RSC), der motorischen Kortex (MC), die somatosensorischen Kortex (SSC) und der piriformen Cortex (PC). (B) zeigt die Positionen der positiven und negativen Pol zum Transfizieren hippocampalen Bildungen (Ammonshorn 1-3 (CA1, CA2, CA3) und dem Gyrus dentatus (DG). (C) zeigt die Positionen der positiven und negativen Pol zum Transfizieren Striatum (STR) und die laterale Septum-Kern (LS). (d) zeigt die entsprechenden Positionen der Elektroden für die Transfektion der Thalamus (TH) und des Hypothalamus (HY). von Baumgart J. & Grebe N. 2015 12 angepasst. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3 Punktionsort. Die optimale Position für die Injektion der DNA-Lösung ist etwa 0,75 mm koronalen von der Lambdanaht und 0,5 mm lateral von der Pfeilnaht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Position des Ohres Primordium. Die Position des Ohr Primordium ist klar definiert (Pfeil).nk "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Visualisierung der Winkel auf einem Embryo. Zur besseren Visualisierung die entsprechenden Positionen für die positive (mit einem blauen Pluszeichen gekennzeichnet) und der negative Pol für spezifische Transfektionen der kortikalen Arealen (retrosplenialen Cortex, motorischen Kortex, somatosensorischen Kortex, piriformis Kortex), die Hippocampus-Gebieten (Ammonshorn (CA) 1-3, Gyrus dentatus (DG)),die laterale Septum-Kern, das Striatum, Thalamus und Hypothalamus sind auf eines Embryos in utero gezeigt, ein Embryo in der Fruchtblase und auf einem seziert Embryo (alle E15,5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6. Die Spezifität der Transfektion in Abhängigkeit von der Elektrodengröße. Vergrößerung des Elektrodenpaddel reduziert die Spezifität der Transfektion. Dies ist vor allem bei jüngeren embryonalen Stadien (E12, oben) auf der Hand, sondern auch sichtbar im späten embryonalen Stadien (E17, unten). Von Baumgart J. & Grebe N. 2015 12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Größe der Elektrode Paddel im Vergleich zur Größe eines E12 Embryo. Die Elektroden, die zu groß Abdeckung zu viel des Embryos sind und damit das Risiko einer Erkrankung der Herzrhythmus erhöht. Zum Beispiel eine 10 mm-Elektrode (rechts) deckt die ganze E12 Embryonen und wird deshalb nicht empfohlen, auch wenn Spezifität ist nicht das vorrangige Ziel. Von Baumgart J. & Grebe N. 2015 12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1:. Zusammenfassung der Ergebnisse in dieser Tabelle nicht enthalten ist, alle relevanten Informationen für spezifische Transfektion der beschriebenen kortikalen Arealen. Sie enthält Informationen über den Zielbereich, wobei der Winkel, der Position der Elektrode, Embryonalstadium, der aufgebrachten Menge und Konzentration der DNA-Lösung, der Spannung und der Größe der Elektrode.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.