Methodenartikel

Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

DOI:

10.3791/53307

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26. Dezember 2015

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1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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MicroRNAs spielen eine entscheidende Rolle im Gehirn und sind potenzielle Ziele für die Modellierung der Neurodegeneration. Die Störung des miRNA-Spiegels ist jedoch aufgrund der kurzen Länge der miRNA und der Unzugänglichkeit des Hirngewebes eine Herausforderung. Dieses Video stellt eine Methode für das Antagomir-Design und die gehirnspezifische Verabreichung unter Verwendung eines Neuropeptids bei Mäusen vor.

Zusammenfassung

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MicroRNAs (miRNAs) sind Schlüsselregulatoren der Genexpression. Im Gehirn hängen lebenswichtige Prozesse wie die neurologische Entwicklung und neuronale Funktionen von der korrekten Expression von microRNAs ab. Die Störung von microRNAs im Gehirn kann genutzt werden, um neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, indem der neuronale Zelltod moduliert wird. Derzeit wird die stereotaktische Injektion verwendet, um miRNA-Knockdown-Wirkstoffe an eine bestimmte Stelle im Gehirn zu bringen. Hier diskutieren wir Strategien zum Design von Antagomiren gegen miRNA mit gesperrten Nukleotidmodifikationen (LNA). Beschreiben Sie anschließend eine Methode zur gehirnspezifischen Verabreichung von Antagomiren, einheitlich über verschiedene Regionen des Gehirns. Diese Methode ist einfach und breit anwendbar, da sie die Operation, die damit verbundene Verletzung und die Einschränkung der lokalen Verabreichung bei stereotaktischen Injektionen überwindet. Wir haben einen Komplex aus neurotropem, zellpenetrierendem Peptid Tollwutvirus-Glykoprotein (RVG) mit Antagomir gegen miRNA-29 hergestellt und durch die Schwanzvene injiziert, um es spezifisch im Gehirn zu verabreichen. Das Antagomir-Design enthielt Merkmale, die ein spezifisches Targeting der miRNA und die Bildung nicht-kovalenter Komplexe mit dem Peptid ermöglichen. Der Knock-down der miRNA in neuronalen Zellen führte zum apoptotischen Zelltod und damit verbundenen Verhaltensstörungen. Somit kann die Methode für akute Modelle der Neurodegeneration durch die Störung von miRNAs verwendet werden.

Einleitung

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MicroRNAs sind als neue therapeutische Targets aufgrund ihrer universellen Rolle bei der Regulation der Genexpression und direkte Beweise für die Beteiligung an der Krankheit entstanden. MiRNAs werden aktiv auf ihr Potenzial untersucht, wie Drogen-Ziele 1,2. Ferner werden Veränderungen der miRNA-Expression mit verschiedenen Krankheiten 3 und Simulation dieser Veränderungen durch künstliche Störung der miRNA-Expression verbunden sind, können verwendet werden, um die zelluläre Signalwege in Krankheitsmanifestation beteiligt untersuchen. Gewebespezifische Lieferung von miRNA gezielt Medikamente ist derzeit eine der größten Herausforderungen für die miRNA-basierte Wirkstoffentwicklung. Antagomirs und miRNA-Mimetika sind vielversprechend Mittel zum Stören miRNA Ebenen 4-6. Spezielle Funktionen, die ihre Spezifität und Wirksamkeit erhöhen, weisen jedoch in der Gestaltung der Antagomirs eingebaut werden, bevor sie für die in vivo Störung der miRNA-Expression verwendet werden.

MicroRNAs sind besonders relevant, als Ziele in derzeit unheilbaren neurodegenerativen und neuroentwicklungs Krankheiten. Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine Beschränkung für die Lieferung von Antagomirs im Gehirn. Stereotaktische Injektionen sind weit verbreitet in Nagetiermodellen verwendet werden, um Moleküle an bestimmten Stellen im Gehirn 7 zu liefern. Es erfordert Geschick, umfangreiche Investitionen in der Instrumentierung und Zeit. Stereotaktische Injektionen sind invasive, umfassen Chirurgie, führen zumindest leichten Verletzungen und an lokale Auslieferung beschränkt. Die Verwendung von Zelldringenden Peptide mit einer Vorliebe für die Ausrichtung Neuronen können diese Einschränkungen zu begegnen, da sie durch die trans-Kreislauf-Strecke geliefert werden, sondern durchbrechen die Bluthirnschranke. Solch ein Peptid aus der Rabies Virus Glycoprotein (RVG) abgeleitet ist, wurde zuvor verwendet, um siRNA gegen Japanische Enzephalitis-Virus bei Mäusen 8 zu liefern. Wir haben festgestellt, dass unter Verwendung des Peptids für Antagomir Lieferung, miRNAs kann wirksam sein niedergeschlagen im Gehirn der Maus 9.

NHALT "> Die zweite große Herausforderung der miRNA knock-down ergibt sich aus der geringen Größe der miRNAs und das Vorhandensein von eng verwandten Sequenz Isoformen. Wir nehmen das Beispiel des MMU-miR-29-Familie, die aus drei eng verwandte Isoformen besteht, miR-29a , b und c. Antagomire sind auch allgemein entlang der Hauptkette modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen und machen sie beständig gegenüber Nukleasen angreifen. Locked Nucleic Acids (LNAs) bieten einen weiteren Vorteil, dass sie verbessern die thermische Stabilität und sogar dazu führen, um den Abbau über und jenseits Ziel sterische Hinderung. 10 Einführung Änderungen entlang der Hauptkette kann wirksam, aber teuer sein. Wir haben bereits gesehen, daß Modifikationen über eine optimale Anzahl kann nicht weiter die Wirksamkeit. Die Gestaltung des antagomir beinhaltet daher die optimale Änderung der antagomir.

Um die komplexen Antagomir nicht-kovalent mit dem neurotropen Peptid, einem geladenen Hepta- zu nona-Arginin-Erweiterung verwendet wird. D-ArgininRückstände werden verwendet, da sie eine höhere Stabilität zu verleihen, da sie nicht anfällig für eine Spaltung durch Proteasen. Hepta- zu nona-Arginin Strecken wirken als effiziente Zellpenetrationsmittel, obwohl sie Behandlungen nicht die Zelltyp-Spezifität. Durch kovalente Verknüpfung der RVG-Peptid an die nona-Arginin-Linker, einem neurotropen, Zelle eindringende Peptid generiert wurde. Die positiv geladenen Reste des Peptids in Wechselwirkung mit der negativ geladenen Nukleinsäure Rückgrat, um Komplexe zu bilden. Diese Komplexe können verwendet werden, um DNA oder RNA effektiv transfizieren in kultivierten Zellen und in vivo in das Gewebe wird.

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Protokoll

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Hinweis: Alle Verfahren einschließlich Tier Themen wurden von Institutional Tiere Ethikkommission (IAEC) am Institut für Genomik und Integrative Biologie, Neu-Delhi genehmigt worden (IGIB / AEC / 10/2013). Dieses Protokoll ist speziell für die gezielte Abgabe Antagomir-29 im Gehirn und Knockdown von miR-29 eingestellt.

1. Antagomir Design Strategy

  1. Rufen Sie die reife miRNA-Sequenz aus miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Rufen Sie den Sequenzen verwandter miRNA Familienmitglieder über den Link "Gene Family" in der miRBase Rekord
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Reverse Komplement der Sequenz: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html bietet ein komfortables Werkzeug zurreverse Komplement-Sequenzen.
  4. Markieren Sie die Positionen, die von LNA geändert werden mit Hilfe der folgenden Richtlinien:
    1. Wählen Thyminreste 3-4 Basen auseinander für den LNA Modifikation platziert, da LNA Pyrimidine sind stabiler als Purine 12.
    2. Wählen Cytosinreste um 3-4 Reste getrennt, wenn vorhergehenden Schritt erzeugt weniger als fünf Modifikationen.
    3. Priorisieren der fünf Modifikationen am 5'-Ende des antagomir, da die Saat-Sequenz vermieden wird.

2. Antagomir-Neuropeptid Complex Vorbereitung

Anmerkung: Dies ist der wichtigste Schritt im Protokoll und Standardisierung muss. Um das Protokoll zu jeder fluoreszenzmarkierte Oligonucleotid (FLO) kann anstelle des antagomir 9 verwendet werden standardisieren. Die Peptide sollten von hoher Reinheit sein (HPLC-Qualität, 98% Reinheit) .Sequences und Ladung des Peptids und antagomir sind in Tabelle 1 angegeben.

  1. Entscheiden Sie, die Anzahl der moles von antagomir bezogen auf molare Ladung auf antagomir, seiner Toxizität und Gewicht der Maus injiziert werden. Berechnen Sie die Anzahl der Mole des Peptids injiziert basieren auf molare Ladungsverhältnis von Antagomir: Peptid.
    HINWEIS: Standardisieren molaren Ladungsverhältnis von Antagomir: Peptid zur Toxizität und effektive Bereitstellung im Gehirn der Maus. Verwenden Sie unterschiedliche molare Ladungsverhältnissen von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid: Peptids zur Standardisierung. Wir fanden, dass Antagomir-29 und Kontrolle waren beide bei 4microgram / Gramm Körpergewicht der Maus giftig. Antagomir-29 und Kontrolle wurden bei 2microgram / Gramm Körpergewicht verwendet, aber das effektive Konzentration dürfte für jeden microRNA variieren.
  2. Verdünnen des Peptids und antagomir in getrennten Mikrozentrifugenröhrchen aus Stammlösungen mit steriler 10% D-Glucose auf die gewünschte Endkonzentration in Schritt 1 berechnet.
  3. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Peptid-Lösung auf einem Vortex bei moderaten Vortexen Geschwindigkeit.
  4. In 1/3 der einentagomir Lösung der Peptidlösung Rohr langsam tropfenweise, während es wird gründlich auf einem Vortex-Mischer gemischt.
  5. Setze das Mischen der Lösungen auf dem Vortex für den nächsten 1 min und dann lassen Sie die Mischung für 1 min stehen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 zwei weitere Male um den verbleibenden antagomir Lösung mit der Peptidlösung in die gleiche Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Langsame Zugabe ist kritisch für die Bildung von monodispersen Komplexe, die wirksam bei der Transfektion. Schnelle hinaus kann die Aggregation der Komplexe und deren Niederschlag führen.
  7. Inkubieren des Komplexes für 30 min bei RT ohne Verwirbelung. Während dieser Zeit der Inkubation akklimatisieren die Mäuse ins Labor, wo Injektionen durchgeführt.

3. Schwanzveneninjektion von Antagomir-Neuropeptid-Komplex

  1. Um das Tier zurückzuhalten, die Maus in einem Verzögerer oder decapicone der richtigen Größe.
  2. Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes mit Wattestäbchen pre getränkten in warmem Wasser (ca. 40 ° C). Dies wird Vasodilatation fördern und erhöhen die Sichtbarkeit der Vene.
  3. Nähern Sie sich dem Schwanz mit einem kleinen Volumen (0,5 bis 1,0 cc) Insulinspritze in einem 15-20 ° -Winkel. Darauf achten, dass keine Luft in die Spritze einzuführen. Beginnen an dem distalen Abschnitt des Schwanzes. Spritzen Sie die Anlage. Entfernen Sie die Nadel und wenden eine antiseptische Tupfer direkt an der Injektionsstelle (etwa 5-10 sec), um Blutungen zu stoppen.
  4. Ersetzen Sie die Maus in einem individuell belüfteten Käfig in der Gruppe von 3-5, mit dem Maiskolben und Tissue-Papier als Bereicherung. Injizierten und injizierten Mäusen halten Sie nicht in demselben Käfig.

4. Verhaltens Assays

Hinweis: Bewahren Sie die Zeitspanne von 3-4 Stunden zwischen Injektion und Verhaltenstests zur Erholung nach der Injektion zu ermöglichen. Bringen Sie die Maus, um ein ruhiges Zimmer. In dieser Zeit der Eingewöhnung der Tiere nicht stören.

  1. Akklimatisieren Sie die Maus auf dieneuer Raum für 30 Minuten und starten Sie dann die folgenden Verhaltenstests. Halten Sie einen Abstand von 10 Minuten zwischen den einzelnen Verhaltenstest.
  2. Hinterlauf clasping:
    HINWEIS: Dieser Test zeigt, motorische Störungen und neurologischen Störungen.
    1. Heben Sie die Maus sanft, indem in der Nähe Basis des Schwanzes im klaren Hintergrund.
    2. Überprüfen Sie die hinteren Gliedmaßen Position für 10-15 Sekunden. Wildtyp-Maus spreizt Hinterbeine von Bauch, während eine ataktische Maus neigt dazu, eine oder beide Hinterbeine in Richtung des Bauches mehr als 50% der Zeit ausgesetzt 13 zurückzuziehen.
    3. Bringen Sie die Maus, um den Käfig
  3. Ledge-Test:
    1. Heben Sie die Maus vorsichtig, indem Sie den Schwanz und halten Sie auf dem Sims eines Käfigs.
    2. Beachten Sie die Maus, die speziell auf die Ecke des Käfigs. Wildtyp-Maus können Sie die Ecken problemlos ohne Angst und verlieren das Gleichgewicht. Ataktische Maus verliert sein Gleichgewicht, einfrieren oder schüttelt bei einem Spaziergang entlang des Käfigs Leiste und an den Ecken.
  4. Mouse Fußdruck Assay:
    HINWEIS: Für diesen Test halten die Absorptionslage bereit, auf dem Boden einer schmalen Landebahn (~ 70 cm langen, ~ 5 cm breit mit ca. 5 cm hohe Wände.)
    1. Halten Sie die Maus sanft mit einer Hand und wenden Tinte auf den Hinterbeinen mit einem Pinsel.
    2. Legen Sie die Absorptionsschicht auf dem Boden einer schmalen Landebahn.
    3. Lassen Sie Maus zu gehen oder laufen über eine Absorptionsschicht in einer geraden Linie in einer Start- und Landebahn von einem Ende zum anderen.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal mit jeder Maus mit frischen Absorptionslage.
    5. Den Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten in der Vorwärtsbewegung. Fügen Sie keine ersten und letzten paar Fußspuren, wo das Tier ist nur die Einleitung und Beendigung ihrer Sicht sind.

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Ergebnisse

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Unter Verwendung der hier vorgestellten Verfahren, Komplexe von 50microgram fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid (FLO) und ~ 850microgram RVG-Peptid von 1:15 molaren Ladungsverhältnis: wurden (FLO Peptid) hergestellt und nur einmal durch Schwanzvene injiziert. Komplexe von nicht-neurotropen Rabies Virus Matrix (RVM) Peptid und FLO wurde als Lieferkontrolle verwendet. Am nächsten Tag, Mäuse Gehirn und Leber wurden isoliert und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop für grüne Fluo...

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Diskussion

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Hier demonstrieren wir eine allgemein zugängliche Methode, um die Auswirkungen der miRNA-Modulation zu untersuchen. Derzeit beinhalten die meisten Versuche zur In-vivo-Charakterisierung von miRNA-Funktionen die Schaffung von Knockout-Mäusen oder eines Transgenen, das einen miRNA-Schwamm exprimiert. Die meisten miRNAs, auch die zelltypspezifischen, werden in mehr als einem Organ exprimiert. Zum Beispiel werden miRNAs, von denen ursprünglich angenommen wurde, dass sie spezifisch für das hämatopoetische System s...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Souvik Maiti für die Hilfe bei der Gestaltung der Antagomire. Wir danken auch Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey und Bijay Pattnaik für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden. Diese Arbeit wurde vom Rat für wissenschaftliche und industrielle Forschung (BSC0123) finanziert. HS, MV und RR erhalten ein Stipendium des Council of Scientific and Industrial Research, Indien. Die MAS erkennt das Stipendium der University Grants Commission, Indien, an.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vortex
Restrainer oder Decapicone
Schmale Start- und Landebahn~ 70 cm lang, ~ 5 cm breit mit ~ 5 cm hohen Wänden.
Reagenzien
Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% sterile D-Glucose
Antagomir-29ExiqonCustom Synthesis
Antagomir-ControlExiqonCustom Synthesis
NeuropeptideRVG G.L.Biochem ( Shanghai) Ltd.kundenspezifische Synthese>98% Reinheit
Neuropeptid RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.Kundenspezifische Synthese>98% Reinheit
Andere
Baumwolle Warmes
Wasser
Insulinspritzen
Saugfähige Blätter
Tinte
Pinsel
Antiseptisch

Referenzen

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Schlagwörter

MicroRNA KnockdownAntagomir DesignLocked Nucleic Acidzellpenetrierendes PeptidTollwutvirus GlykoproteinSchwanzveneninjektionhirnspezifische ApplikationVerhaltensassaysquantitative PCRNeurodegenerationsmodell

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