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Methodenartikel

Intracerebroventricular Injektion von Amyloid-β-Peptide in normalen Mäusen zu Akut Induce Alzheimer-ähnliche kognitive Defizite

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DOI:

10.3791/53308

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16. März 2016

 ,  ,  ,  , 
1Center for Neuro-Medicine, Korea Institute of Science and Technology, 2Research Institute, GoshenBiotech, Inc., 3Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 4Biological Chemistry Program, Korea University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Amyloid-β (Aß) -injected Tiermodell die Verabreichung einer definierten Menge und Arten von Aß-Fragmente ermöglicht und reduziert individuelle Unterschiede innerhalb der einzelnen Studiengruppe. Dieses Protokoll beschreibt die intracerebroventricular (ICV) Injektion von A & bgr; ohne stereotaktischen Instrumente, die Produktion von Alzheimer-ähnliche Verhaltensstörungen in normalen Mäusen ermöglichen.

Zusammenfassung

Amyloid-β (Aβ) ist ein wichtiger pathologischer Mediator sowohl der familiären als auch der sporadischen Alzheimer-Krankheit (AD). Im Gehirn von Alzheimer-Patienten wird eine fortschreitende Akkumulation von Aβ-Oligomeren und Plaques beobachtet. Es wird angenommen, dass solche Aβ-Anomalien die langfristige Potenzierung blockieren, die synaptische Funktion beeinträchtigen und kognitive Defizite induzieren. Klinische und experimentelle Beweise haben gezeigt, dass der akute Anstieg des Aβ-Spiegels im Gehirn die Entwicklung von Alzheimer-ähnlichen Phänotypen ermöglicht. Daher ist in vielen Fällen ein detailliertes Protokoll erforderlich, das beschreibt, wie ein AD-Mausmodell akut über die intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von Aβ generiert werden kann. In diesem Protokoll sind die Schritte des Experiments mit einer Aβ-injizierten Maus enthalten, von der Herstellung der Peptide bis zur Testung von Verhaltensauffälligkeiten. Der Prozess der Vorbereitung der Werkzeuge und der Probanden vor der Injektion, der Injektion des Aβ in das Mäusegehirn durch ICV-Injektion und der Beurteilung des Grades der kognitiven Beeinträchtigung wird im gesamten Protokoll leicht erklärt, wobei der Schwerpunkt auf Tipps für eine effektive ICV-Injektion von Aβ liegt. Durch die Nachahmung bestimmter Aspekte der Alzheimer-Krankheit mit einer bestimmten Injektion von Aβ können Forscher den Alterungsprozess umgehen und sich auf die nachgelagerte Pathologie von Aβ-Anomalien konzentrieren.

Einleitung

Gegeben ist, dass Amyloid-β (Aß) ein pathologisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit (AD) ist die Entwicklung von AD Tiermodellen auf neuronale Überexpression von Aß konzentriert. Da Mutationen in Amyloid - Vorläuferprotein (APP) oder Presenilin (PS) , um Störungen des Aß Gleichgewicht führen und letztlich zu der Pathogenese von familiärer AD 1, Maus - Modellen beteiligt APP oder PS - Gen - Mutationen im Allgemeinen angenommen wurden. Zu der breiten Palette von transgenen Mäusen, sind prototypische Mausmodellen die folgenden: TG2576, PDAPP, APP / PS1 und APP23. Im Gehirn zeigen diese Mäuse im allgemeinen Aß Aggregation und schließlich senile Plaques; Plaquebildung wird durch signifikante kognitive Beeinträchtigungen so vor, dass sie eine schlechte Leistung in Verhaltenstests von Lernen und Gedächtnis zeigen. Die Erzeugung von transgenen Mäusen, die natürlich menschliche AD Pathologie nachahmen hat damit zu AD Forschungsgesellschaft bei, indem es uns ermöglicht, den Verlauf der di zu überwachenSease. Jedoch ist transgenen Mäusen unter Verwendung unwirtschaftlich und zeitraubend , weil es Monate für die Mäuse nimmt Aß - Plaques zu entwickeln und sogar länger 2,3 Aß-induzierten synaptischen Abnormalitäten oder Verhaltensstörungen zeigen. Ursprünglich als Alternative entwickelt, die Mängel von transgenen Mausmodellen zu überwinden, nicht-transgene Modelle auch sind häufig aufgrund ihrer klaren Vorteile eingesetzt. Pathogen-induzierte AD Modelle können durch die direkte Injektion von A & bgr; in das Gehirn erzeugt werden, während AD-ähnliche kognitive Defizite können auch durch andere chemische und physikalische Mittel-wie die Injektion von neurotoxischen Verbindungen wie Scopolamin, der Induktion von Läsionen ausgelöst werden in der Erkenntnis relevanten Bereichen wie dem Hippocampus oder durch Rindenschäden 4. Allerdings ist die nicht-pathogene Induktion der kognitiven Beeinträchtigung nicht genau die grundlegenden Pathophysiologie von AD reflektieren; sondern es ahmt nur die symptomatische Ergebnisse. Im Gegensatz dazu ist ein pathogen-induzierte AD-Modell, die A46; -injected Maus-Modell kann nicht nur AD-ähnliche Verhaltensauffälligkeiten zeigen, sondern auch Aß Pathologie aufweisen kann, das gemeinsame Merkmal von familiären und sporadischen AD geteilt.

Trotz der Schwierigkeit Aß-Plaques im Gehirngewebe zu visualisieren, der größte Vorteil des Aß-injizierten Modell, das es attraktiv für AD Untersuchung macht, ist ihre Steuerbarkeit. Die Forscher können die individuellen Unterschiede in Mausmodellen auszusondern, die zu fehlerhaften Daten in der Drogen Studien führen kann. Die rechtzeitige medikamentöse Behandlung ist auf den Mechanismus des Kandidaten Droge aktiviert abhängig; zu erarbeiten, kann ein Inhibitor der Aß Aggregation vor der Injektion von A & bgr; angewendet werden. Zusätzlich können Forscher gehen davon aus, dass die pathogene Transformation, die nach der Injektion Aß entsteht aus dem Aß Belichtungs abgeleitet ist, weil die anderen Faktoren streng kontrolliert werden, einschließlich der individuellen Unterschiede.

In diesem Protokoll wird eine anschauliche Beschreibung von how einen AD-ähnlichen Phänotyp bei normalen Mäusen über Aß intracerebroventricular (ICV) Injektion ohne stereotaktischen Instrumente zu induzieren vorgestellt. einschub provozierten Schäden an Hirngewebe zu minimieren ist unerlässlich, um die Möglichkeit der strukturellen Schädigung und Läsion induzierten Entzündung zu verhindern. Ein Mangel an Fähigkeiten in der Maus Handhabung führt zu unerwarteten neuronalen Verletzungen. Weiterhin Techniken, die die entsprechenden Winkel und Tiefe ermöglichen, während der Injektion erreicht werden, sind besonders wichtig, häufige Fehler zu umgehen. Zusätzlich zu einer detaillierten, klare Erläuterung der ICV-Injektion, die Zuverlässigkeit des Modells durch das folgende Protokoll hergestellt wird auch in den folgenden Abschnitten dargestellt. Das folgende Protokoll könnte eine zuverlässige und leicht verständlich Werkzeug sein, das zu AD Forschung beiträgt, wodurch ein Sprungbrett bieten, die letztlich zu einer sinnvollen Entdeckung für AD Gesellschaft führen könnte.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publications No. 8023, überarbeitet 1978) und mit dem Animal Care und Use Committee des Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt von KIST (Seoul, Korea).

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Bereiten Sie eine Gruppe von 7-Wochen alte männliche ICR-Mäuse (oder C57BL / 6).
  2. Lassen Sie die Mäuse für 3-7 Tage nach dem Transport einer Eingewöhnungsprozess durchlaufen Homöostase wiederherzustellen. In der Regel stellen eine Gruppe von 4-5 Mäuse in jedem Käfig und halten sie bei 22 bis 23 ° C und 40% Luftfeuchtigkeit, mit einem 12/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Geben Sie Wasser und Nahrung ad libitum.
    neue Wohnung, Nahrung, Wasser und Geruch sowie einen neuen Käfig und Licht-Zyklus Der Akklimatisierungsprozess kritisch ist Erholung vom Stress der Schifffahrt und eine Anpassung zu ermöglichen: Hinweis. In diesem Experiment wurden die Mäuse in individuell belüftete Käfige (IVCs) befindet sich in der Spe untergebrachtsche pathogenfreie (SPF) -grade Anlage
  3. Wiegen Sie jede Maus und verstehen sich inklusive Probanden, deren Gewicht abweicht ± 10% vom Mittelwert.
  4. Teilen Sie die Themen in zwei Gruppen: eine Fahrzeug-injizierten Gruppe (Aß (-)) und ein Aß-injizierten Gruppe (Aß (+)). Wenn der Versuch, die Wirksamkeit eines bestimmten Arzneimittelkandidaten zu testen ist, teilen sich die Mäuse in vier Gruppen: (1) A & bgr; (-) / Droge (-), (2) A & bgr; (-) / Medikament (+), (3) A & bgr; (+) / Droge (-) und (4) A & bgr; (+) / Medikament (+).

2. Aß-Peptidpräparation

  1. Behandeln die Aß - Peptide, chemische Synthese 5 oder aus kommerziellen Quellen abgeleitet durch, mit vorgekühltem 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) , um alle Aggregate zu lösen und die Peptide homogene 6 zu machen .
    1. Beschallen die Aß / HFIP Lösung in einem mit Wasser Ultraschallbad für 5 min (bei RT), sanft Wirbel, und Inkubation bei RT die Lösung für 30 min. Entfernen Sie die HFIP vollständig durch Verdampfen mit Stickstoffund speichern Sie die homogene Aß bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Bereiten Sie die Aß-Monomere: (. 100 & mgr; M Aß, 10% DMSO, 90% PBS) machen 1 mM Aß Dimethylsulfoxid (DMSO) Lager und verdünnen Sie es 10-fach in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
  3. Bereiten Sie Aß-Oligomere.
    1. Inkubieren des Aß Monomerlösung (Schritt 2.2.) Bei 37 ° C für 3 oder 7 Tage (A & bgr; (1-42) oder A & bgr; (1-40) enthält), respectively.
    2. Legen Sie die Aß-Lösung in einem verschlossenen Rohr in einer Reißverschlusstasche mit einem nassen Papiertuch, das eine feuchte Umgebung zu schaffen, die Wasserverdunstung während der Inkubationszeit zu verhindern.
  4. Bestätigung vorbereitet Aß Oligomeren über Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit photoinduzierten Vernetzung des unmodifizierten Proteine ​​6.
  5. Bereiten Sie die PBS-Lösung 10% DMSO für das Fahrzeug ICV Injektion enthält.

3. Spritzenpräparation

  1. Bereiten Sie eine Mikrospritze mit einer 26 G Nadel aus rostfreiem Stahl für die ICV-Injektion.
  2. Sterilisieren der Spritze in Autoklaven mit allen anderen Geräten, die für den chirurgischen Eingriff verwendet werden soll. Nach dem Autoklaven, legen Sie das Gerät unter dem UV-Licht für 20 min.
  3. Wickeln der Nadel des Mikrospritze mit Parafilm zu seiner Länge auf 3,8 mm einzustellen , um eine maximale Genauigkeit in der Tiefe der Injektion in das Gehirn (1A) ermöglichen. (Für B6 Mäuse, passen Spritzennadel bis 3,6 mm).
    Hinweis: Die Kompression der Parafilm auf die Tiefe der Injektion führen übersteigt 3,6 mm ventral. Um die Parafilm vermeiden, dass beim Einführen der Nadel zusammengedrückt wird, dicht wickeln die Nadel mehrmals.
  4. Wasche den Innenraum der Spritze mit 70% Ethanol, zweimal.
  5. Beschallen die Spritze und die Nadel in einem mit Wasser Ultraschallbad für 30 min bei RT.
  6. Wasche den Innenraum der Spritze mit 70% Ethanol, zweimal.
  7. Spülen Sie die Spritze ausmit destilliertem Wasser und trocknen Sie es vollständig in einem Abzug für länger als 30 min. Lassen Sie die saubere Spritze unter UV-Licht für 20 Minuten vor der Injektion Aß beginnt.

4. Aß-injizierte Maus-Modell Vorbereitung

Hinweis: Reinigen Sie das Operationsfeld mit einem Desinfektionsmittel sterilen Bedingungen zu halten und zu sterilisieren alle chirurgischen Instrumente für ICV Injektion unter Verwendung von 70% igem Ethanol und UV-Exposition.

  1. Anästhesieren die Maus durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Xylazin (20 mg / kg) und Tiletamin · HCl / Zolazepam · HCl (80 mg / kg) vor der ICV Injektion. Platzieren Sie die Maus auf eine warme Matte seine Körpertemperatur zu halten, während narkotisiert und eine ausreichende Anästhesie bestätigen Sie mit der Fuß-Pinch Antwort zu bewerten.
  2. Steriler PBS sinkt auf beiden Augen kornealen Trockenheit während des Verfahrens (1B) zu verhindern.
  3. Bereiten Sie zwei Spiegel von mehreren geraden vertikalen Linien auf ihren Oberflächen bei difficu Zeichnunglty Injektion der Spritze senkrecht.
  4. Platzieren Sie einen Spiegel (M1) direkt neben dem Körper der Maus und dem anderen (M2) vor dem Kopf. Halten M1 parallel zu der gedachten Mittellinie zwischen den beiden Augen der Maus und ordnen M2 senkrecht zur M1, so dass die beiden Ebenen einen Winkel von 90 ° (1C) bilden. Platzieren M1 auf der linken Seite der Maus, wenn der Forscher rechtshändig ist. Platzieren M1 auf der rechten Seite der Maus, wenn der Forscher linkshändig ist.
  5. Spray 70% Ethanol auf die Mitte der Stirn der Maus und reiben Sie es mit einem trockenen Wattestäbchen. benetzen nicht zu groß werden von einem Bereich der Stirn aufgrund der Verdampfung der Körpertemperatur des Alkohols zu vermeiden, verringert.
  6. Wischen Sie die gleiche Fläche auf der Stirn mit 2% Chlorhexidin-Lösung eine saubere Wattestäbchen verwenden. Wiederholen Sie scrubbings mit Alkohol und Chlorhexidin für insgesamt drei Mal.
    Hinweis: Falls erforderlich, rasieren Haare auf der Stirn der Maus, um die Mög zu minimierenbarkeit der Kontamination
  7. Finde Bregma.
    1. Mit dem Daumen und Zeigefinger, fest halten Sie die Haut der Stirn, direkt oberhalb der beiden Augen zu dem Grad, dass beide Augen herausragen. Ziehen Sie die Haut zurück, um die Stirn straff zu machen und zu minimieren Schädelbewegungen unter die Haut.
    2. Bilden Sie einen unsichtbaren Dreieck durch drei Eckpunkte zuweisen: Die beiden Augen der Maus und der Punkt, wo der Daumen und Zeigefinger zusammentreffen, die Bregma. (1B, Roter Pfeil: Bregma)
  8. Suchen Sie die Injektionsstelle mit Maßband: -1,0 ± 0,06 mm hinter Bregma, 1,8 ± 0,1 mm lateral der Pfeilnaht und 2,4 mm in der Tiefe (1D, blaue Sterne: Injektionspunkte in jeder Hemisphäre). (Für B6-Mäuse: -0,9 mm posterior, 1,7 mm lateral und 2,2 mm in der Tiefe)
  9. Füllen Sie die Spritze mit 10 ul Aß-Lösung oder ein Fahrzeug mit überschüssiger Lösung, um ein versehentliches Luftinjektion zu vermeiden.
  10. Legen Sie die Spritze auf the Injektionsstelle (beschrieben in Protokoll 4.7). Nehmen Sie die Spritze senkrecht zur Ebene der Injektionsstelle. Richten Sie reflektierten Bilder der Spritze in beiden Spiegeln mit den gezogenen Linien auf den Spiegeln aus einer festen Perspektive (1C).
  11. Beginnen Sie mit der Nadel ein, bis die Parafilmwickel die Haut erreicht.
  12. Halten Sie die Hand, die Spritze fest und verwenden andere Hand 5 ul des Aß-Lösung oder ein Fahrzeug zu injizieren, langsam über 5 Sekunden ohne Pause. Stellen Sie sicher, dass die Spritze senkrecht in ganz bleibt. Nach der Injektion Abschluss warten 3 bis 5 Sekunden, bevor die Spritze für die Diffusion zu entfernen.
  13. Unter der Annahme, das ursprüngliche Dreieck Position üben mäßigem Druck, den Schädel von unnötigen Bewegungen zu schützen. Entfernen Sie die Spritze ohne Kippen.
  14. Legen Sie die Aß-injizierte Maus auf warmen Pad für die Wiederherstellung und Erhaltung seiner Brustlage. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis er das Bewusstsein wiedererlangt und nicht zurück, die mOuse zu einem Käfig nicht-chirurgische Mäuse enthalten, bis sie vollständig erholt hat.
  15. Waschen Sie die Spritze gemäß den Schritten 3,3-3,6.
  16. Postoperativ überwachen die Beweglichkeit der Mäuse und auf eventuelle Anzeichen einer Infektion oder Krankheit in den Mäusen für 5-7 Tage.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Aß Injektion in die ICV - Bereich (A) Parafilm umwickelt Spritzennadel im Vergleich zu einem unmodifizierten Spritzennadel. (B) PBS fällt auf die Augen Trockenheit zu verhindern; das Dreieck auf der Stirn der Maus mit Daumen, Zeigefinger, und die beiden Augen der Maus als auch der imaginären Mittellinie im gleichen Abstand von jedem Auge gebildet ist; (C) zwei Spiegel (M1 und M2) mit mehreren vertikal auf den Oberflächen gezogenen Linien senkrecht Injektion der Injektionsnadel zu unterstützen; (D) das Dreieck mit den Injektionsstellen, indicated als blaue Sterne (-1,0 ± 0,06 mm von Bregma und 1,8 ± 0,1 mm sagittal) auf jeder Hemisphäre der Maus; Grüner Pfeil: Parafilm, Roter Pfeil: Bregma Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Bestätigung von Aß Injection von Y-Labyrinth und Gehirn-Analysen

  1. Beurteilen Sie den Arbeitsspeicher von Aß-injizierten Mäusen durch Y-Labyrinthtests 3,7,8
    1. Warten 3 Tage nach der Injektion für den Beginn der Gedächtnisdefizite.
    2. Führen Sie die Y-Labyrinth-Tests einen schwarzen Kunststoff-Labyrinth mit drei identischen Armen beschriftet mit A, B und C, von denen jede verzweigt sich in einem Winkel von 120 ° von der Mitte des Labyrinths (Breite x Länge x Höhe, 10 cm x 40 cm x 12 cm).
    3. Legen Sie eine Maus am Anfang Arm (Arm A) und lassen Sie das Thema frei, das Labyrinth für 8 min erkunden.
    4. Messen Sie die Anzahl der Einträge in jedem Arm und berechnen die alternationsrate jedes Probanden 3,9.
  2. Direkt post mortem Gehirn untersuchen, um zu prüfen, ob die Injektion der ICV-Region in geeigneter Weise ausgerichtet.
    1. Anesthetize die Maus nach dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 4.1 beschrieben. Dann opfern, um die Maus durch Genickbruch.
    2. Enthaupten die Maus und die Haut entfernen, den Schädel mit chirurgische Scheren zu belichten. Entfernen Sie Gewebe und Muskeln aus dem Schädel.
    3. Machen Sie Schnitte auf der Lambdanaht (zwischen Scheitel- und interparietal Knochen), ohne das Gehirn zu beschädigen. Entfernen Sie die Hinterhaupts und interparietal Knochen, dann die parietalen und frontalen Knochen. Entfernen Sie die Schädelknochen einer Pinzette und zu isolieren, das Gehirn aus dem Schädel durch die Hirnhaut anheben.
    4. Das Gehirn in gekühltem steriler Kochsalzlösung waschen und den ICV - Region des Gehirns im koronalen Richtung mit einem chirurgischen Messer (2) schneiden.
    5. Bestätigen Sie den Injektionsbereich basierend auf der Spur der Nadelung an dieHirngewebe (Abbildung 2). Überprüfen Sie, ob die Nadel Spur hat sich zu einem der Ventrikel erreicht. Wenn die Nadel Spur nicht oder durch die Ventrikel passieren zu erfüllen, auszuschließen, die Gegenstand der Daten aus der Analyse der experimentellen Ergebnisse.

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Ergebnisse

Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele der Ergebnisse, die durch Bestätigung von Aß Aggregation und Y-maze Bewertung der Gedächtnisdefizite erhalten werden kann. Verwendung des Volllängen - A & bgr; (1-42) Peptid von 42 Aminosäuren, eine Mischung von Aß Monomeren, Oligomeren und Fibrillen (3) hergestellt. Durch die HFIP-induzierten Monomerisierung Schritt relativ homogenen Monomere (Spur B) erhalten. Nach der 7-tägigen Inkubation entwickelt diverse Größen von Aß-...

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Diskussion

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist das ICV-Injektion von Aß. Dieses Protokoll wurde entwickelt , Aß in den ICV - Region von Mäusen ohne stereotaktischen Instrumente 11,12 einzuspritzen. Bevor ein Experiment starten, eine vorläufige Zeit der Praxis Injektionen mit einem blauen Farbstoff anstelle von Aß stattfinden sollte ausreichend Geschicklichkeit zu erreichen. Unmittelbar nach der Injektion, ist es notwendig, ob das Pigment Injektion zu prüfen, wurde ordnungsgemäß durchgeführt. Vorsichtig das Ge...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R & D-Projekt durch die Korea Health Industry Development Institute (Khidi) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Gesundheit und Soziales, Republik Korea (Grant-Nummer: H14C04660000).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ICR-MausOrientbiomännlich, 6-8 Wochen, 27-29 g Körpergewicht
C57BL/6 MausOrientbiomännlich, 6-8 Wochen, 21-23 g Körpergewicht
Amyloid-beta1-42im Haus SyntheseStammkonzentration: 1 mM/DMSO, injizierte Konzentration: 100 μ M/10% DMSO und 90% PBS
ICV-Injektionsspritze (26s Gauge)Hamilton80308
Evans blauer Farbstoff (EBD)abcamBIochemikalienab1208691% EBD in PBS
DMSOSigma D2650
PBSgibco10010-023
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis KitELPiS BiotechEBS-105615% Gel
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra StandardsBio-Rad161-0377
Silber-FärbesetGE-Healthcare17-1150-01
LabDietOrientbio5053

Referenzen

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