Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Summary

Kernige Hüllproteine spielen eine zentrale Rolle in vielen grundlegenden biologischen Prozessen und wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Cre/Lox-basiertes Mausmodell, das die räumlich-zeitliche Kontrolle der Störung von LINC-Komplexen ermöglicht.

Abstract

Die nukleare Migration und Verankerung in sich entwickelnden und adulten Geweben hängt stark von großen makromolekularen Proteinanordnungen ab, die als LInkers des Nukleoskeletts und des Zytoskeletts (LINC-Komplexe) bezeichnet werden. Diese Proteingerüste überspannen die Kernhülle und verbinden das Innere des Zellkerns mit Komponenten des umgebenden zytoplasmatischen Zytoskeletts. LINC-Komplexe bestehen aus zwei evolutionär konservierten Proteinfamilien, Sun-Proteinen und Nesprinen, die C-terminale molekulare Signaturmotive beherbergen, die als SUN- bzw. KASH-Domänen bezeichnet werden. Sonnenproteine sind Transmembranproteine der inneren Kernmembran, deren N-terminale nukleoplasmatische Domäne mit der Kernlamina interagiert, während ihre C-terminalen SUN-Domänen in den perinukleären Raum hineinragen und mit der Kash-Domäne von Nesprins interagieren. Kanonische Nesprin-Isoformen haben einen N-Terminus unterschiedlicher Größe, der in das Zytoplasma projiziert und mit Komponenten des Zytoskeletts interagiert. Dieses Protokoll beschreibt die Validierung einer dominant-negativen transgenen Mausstrategie, die endogene SUN/KASH-Interaktionen auf zelltypspezifische Weise stört. Unser Ansatz basiert auf dem Cre/Lox-System, das viele Nachteile wie perinatale Letalität und zellnicht-autonome Phänotypen umgeht, die mit Keimbahnmodellen der LINC-Komplexinaktivierung assoziiert sind. Aus diesem Grund bietet dieses Modell ein nützliches Werkzeug, um die Rolle von LINC-Komplexen während der Entwicklung und Homöostase in einer Vielzahl von Geweben zu verstehen.

Introduction

Die Kernhülle (NE) trennt das Kernplasma aus dem Zytoplasma. Es besteht aus einem inneren und äußeren Kernmembran (INM und ONM, respectively), die an Kernporen verbinden zusammen. Das Lumen von beiden Membranen abgegrenzt wird als perinukleären Raum (PNS). Die ONM ist eine Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der INM haftet an der Lamina, um ein Maschenwerk des Typs V-Atom Intermediärfilamente von A- und B-Typ dargestellt Lamine ^1,2. Linker der Nucleoskeleton und Zytoskelett (LINC) -Komplexe sind makromolekularer Komplexe, die die gesamte Kernhülle überspannen kann, um das Innere des Kerns physikalisch verbinden Zytoskelettfilamenten und molekularen Motoren (1A). Sie bestehen aus Wechselwirkungen zwischen evolutionär konservierte Motive, die zwei Familien von integralen Transmembranproteine ​​des NE charakterisieren: Sun (SAD1 / Unc84) Proteine ​​und Nesprine (Nuclear Envelope Spek). Bei Säugetieren Sun1 und Sun2 are Transmembranproteine ​​des INM, deren N-terminale nukleoplasmatischen Region interagiert direkt mit A- und B-Typ Lamine ^3-5. Auf der anderen Seite des INM, im PNS, Hafen Sun Proteine ​​einen evolutionären konserviert Strecke von ~ 150 C-terminalen Aminosäuren genannt SUN-Domäne. SUN Domänen interagieren direkt mit dem evolutionären konserviert KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologie) -Domäne, die molekulare Signatur der Nesprine. KASH Domänen bestehen aus einer Strecke von ca. 30 C-terminalen Aminosäuren, die in die PNS, gefolgt von einer Transmembran-Domäne ⁶ ragt. Mindestens vier verschiedene Nesprin Gene (Nesprin1-4) kodieren KASH haltige Proteine, die an der NE ⁷ lokalisieren. Die zytoplasmatischen Regionen Nesprine, deren Größen variieren von ~ 50 kDa (Nesprin4) zu einer erstaunlichen 1.000 kDa (Nesprin1 giant) enthalten mehrere Spektrin wiederholt sowie spezifische Motive, damit ihre Wechselwirkung mit Zytoskelett-Komponenten, wie beispielsweise Actin, plectin und molekularen Motoren ^{8- 13.}

Studium in Wirbeltieren und wirbellosen Tieren haben gezeigt, dass Lamin / Sun / Nesprin / molekulare Motoren stellen eine evolutionär konservierte "Achse" Steuerung Kern Migration und Verankerung. Einige Knock-out (KO) Maus-Modellen der LINC komplexe Bauteile wurden beschrieben und waren maßgeblich an der Schaffung eines Rahmens, um die Rolle von Sun und Nesprin Proteine ​​an der NE während der Entwicklung von Säugetieren ^9,14,15 zu verstehen. Allerdings sind diese Modelle weisen mehrere signifikante Nachteile auf, insbesondere: 1) Schwierigkeiten bei der Interpretation Phänotypen aufgrund der nicht autonomen Effekte, 2) Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der phänotypischen Beitrag von Zell KASH haltigen vs. KASH losen Nesprin Isoformen ^16, 3) die funktionelle Redundanz von Sonne und Nesprin Proteine ​​an der NE in zahlreichen Zelltypen erfordert komplexe Zuchtprogramme, alle SUN-KASH Wechselwirkungen bei Mäusen ^{17 und} 4) die perinatale Sterblichkeit von Mäusen mangelhaft für die KASH-Domäne sowohl inaktivierenNesprins1 und 2 schließt die Analyse der Erwachsenen Phänotypen ^18.

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Mausmodell entwickelt, um alle SUN-KASH Wechselwirkungen in vivo stören, in einer Zelle autonom und entwicklungsregulierter Weise umgehen somit viele der oben beschriebenen Nachteile. Diese Cre / lox-basierten Mäusemodell beruht auf zwei wichtige Konzepte: 1) die KASH Domäne von irgendeinem bekannten Nesprin Protein ausreicht, um EGFP auf die NE in Zellkultursystemen Ziel und 2) Sonnendomänen interagieren promiscuously mit KASH Bereichen, wodurch eine Überexpression von beliebige KASH Domäne werden alle endogenen SUN Domänen zu sättigen und zu inaktivieren LINC-Komplexe in einer dominant-negative Art und Weise ¹⁷ (1B). Dieses Protokoll beschreibt Gewebe Ernte- und Verarbeitungsschritte verwendet werden, um die Störung aller SUN-KASH Wechselwirkungen im Kleinhirn-Purkinje-Zellen bestätigen.

Protocol

Ethics Statement: Verfahren, die Tierversuchspersonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Washington University in St. Louis genehmigt.

1. Mauszucht und Genotypisierung

1. Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, die mit Tg (PCP2-Cre) Mäuse Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20 zu erzeugen. Anmerkung: Während der Rest dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung der Tg (PCP2-Cre) Mauslinie zu EGFP-KASH2 Ausdruck Purkinje Zellen innerhalb des Kleinhirns zu beschränken, kann ein ähnliches Verfahren mit einer anderen Tg (Cre) Maus verfolgt werden ( Abbildung 2a).
2. Führen Genotypisierung um Welpen beherbergen beide EGFP und Cre-Transgene, wie zuvor beschrieben ¹⁹ zu identifizieren.

2. Vorbereitung der Materialien für die Präparation und Gewebeentnahme

1. Bereiten Sie 100 ml 30% Saccharose in PBS (30 g Saccharose / 100 ml 1x PBS) und bei -20 ° C. Der Tag der Gewebe hie Ernte, Tauwetter und Last ~ 30-35 ml Saccharose-Lösung in einen 35-ml-Spritze für transkardialer Infusionen.
2. Vorbereitung 40 ml von 4% PFA in PBS (10 ml 16% igem Paraformaldehyd und 30 ml PBS). Last ~ 30-35 ml 4% PFA in eine 35 ml-Spritze zur transkardialer Perfusionen.
3. Füllen Sie einen 10 cm-Gewebekulturplatte mit 10 ml PBS für Gewebedissektion.
4. Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Cocktail, bestehend aus 16 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin.
5. Eine Lösung aus 70% Ethanol für die Präparation.

3. Dissection und Gewebeentnahme

1. Unter Verwendung einer 1 ml Spritze injizieren 500 ul des Ketamin / Xylazin Cocktail pro 25 Gramm Körpergewicht, und warten Sie ca. 15 min. Alternativ verwenden Sie einen anderen institutionell genehmigten Sedierung Methode, die für das biologische System von Interesse geeignet ist.
2. Nach Sedierung, sanft Prise die Hinterpfote, den Mangel an Schmerzreaktion zu bestätigen, stecken alle Pfoten auf einem Styropor-Fach mit der Rückenseite desMaus nach unten.
3. Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und einen Einschnitt von den Unterbauch an die Spitze des Brustkorbs, um Zugang zum Herzen zu gewinnen.
4. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens und legen Sie die Spritze mit der 30% igen Zuckerlösung in den linken Ventrikel des Herzens.
5. Perfusion der Lösung bei einer Rate von ~ 2-5 ml pro min. Wenn leer, entfernen Sie die Spritze und wiederholen Sie mit der 4% PFA-Lösung.
6. Unpin die Maus vom Styroporbehälter und zu enthaupten, um das Gehirn zu gelangen.
7. Entfernen Sie die Haut um den Kopf des Tieres mit einer Pinzette und Schere. Poke ein Loch in den hinteren Teil des Schädels mit einer Nadel und entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit Schere und Pinzette.
8. Sobald das Gehirn ist eindeutig erreichbar, verwenden Pinzette, um das Kleinhirn zu entfernen und legen Sie sie in PBS. Halbieren das Kleinhirn in der Sagittalebene mit einem Skalpell und übertragen, die 30% Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Um prepsind Paraffinschnitten, beheben das Kleinhirn über Nacht bei 4 ° C in 4% PFA vor Gewebeeinbettung und Schnitte.

4. Gewebeverarbeitung und Schnitte

1. Bereiten einer Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Dass die Temperatur des Bades während 5 min sich ausgleichen lassen.
2. Füllen Sie eine cryomold mit OCT-Verbindung und legen Sie eine Hälfte des zweigeteilten Kleinhirn in die Form.
3. Mit Hilfe eines Binokular und einer Pinzette Position das Kleinhirn, so dass der zweigeteilten Oberfläche (in der Nähe der Mittellinie des Kleinhirns) nach oben zeigt.
4. Übertragen Sie die cryomold auf die Trocken Eisbrei für 5 Minuten, bis der OCT-Verbindung hat eine solide weißen Matrix um die Gewebeprobe gebildet. Anmerkung: Die gefrorene Probe kann nun bei -20 ° C, wenn erforderlich, gespeichert.
5. Etikett vorbehandelt Polylysin Folien zum Sammeln von Gewebeschnitten und bereiten den Kryostaten gemß den Anweisungen des Herstellers, um 15 um Abschnitte des cere sammelnbellum. Um die Abschnitte zu sammeln, vorsichtig an den Oktober Abschnitt mit dem Poly-Lysin-beschichtete Seite der Folie. Um die Ausrichtung des Abschnitts zu erhalten, müssen Sie die Folie während dieses Schritts nicht drehen.
6. Shop Gewebeschnitte bei -20 ° C, bis mit der Färbung und Imaging fortfahren.

5. Die Färbung und Imaging von Kleinhirn Sections

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Gewebefärbung:
   ~ 50 ml PBS
   ~ 5-10 ml von 4% PFA in PBS
   ~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS
2. Thaw Kleinhirnschnitten. Wichtig ist, zu minimieren, ihre Exposition gegenüber einer beliebigen Quelle von kontinuierlichen und intensiven Licht, um Verblassen der EGFP verhindern.
3. Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift, ein Rechteck um den Gewebeschnitten.
4. Post-fix die Abschnitte mit 4% PFA für 5 min. Verwenden Sie ausreichend Flüssigkeit, um den gesamten Bereich von der hydrophobe Barriere (in der Regel ~ 500 ul) abgegrenzt decken. Mit Hilfe eines Vakuum oder Pipette wiederbewegen das Fixiermittel besonders achten, dass die Gewebeschnitte stören.
5. Mit einer Pipette vorsichtig anzuwenden PBS auf der Folie, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Nach 5 min verwenden das Vakuum oder Pipette vorsichtig die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die PBS spülen insgesamt dreimal.
6. Verwendung einer Pipette vorsichtig Die geeignete Verdünnung von primären Antikörpern (3 ul Calbindin und / oder Nesprin2 Antikörper pro 900 Mikroliter Lösung) in 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS gelten. Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   Anmerkung: EGFP-KASH2 wird durch direkte Fluoreszenz-Mikroskopie auf Gefrierschnitten sichtbar und es ist nicht notwendig, um eine Anti-EGFP-Antikörper zu verwenden. Wenn Paraffinschnitte wurden hergestellt, Imaging von EGFP-KASH2 erfordert jedoch Immunodetektion mit einem Anti-EGFP-Antikörper.
7. Entfernen Sie die Antikörperlösung und spülen Sie mit PBS dreimal.
8. Vorbereitung 1: 1000 Verdünnungen von Alexa-Fluor sekundären Antikörper in 0,5% Triton X-100,10% Eselserum in PBS und lagern in der Dunkelheit.
9. Entfernen Sie vorsichtig die endgültige PBS spülen und wenden Sie die Sekundärantikörperverdünnung für eine Stunde im Dunkeln.
10. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung, spülen und waschen Sie den Abschnitt dreimal. Falls erforderlich, tragen Sie eine Kernfärbung, wie DAPI (~ 300 nM), während der ersten PBS-Anwendung.
11. Vollständig zu entfernen, die PBS-Lösung, um von der Gewebe und Ort ~ 5-7 & mgr; l Montagetechnik auf dem Gewebeschnitt. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Gewebeschnitts und beiseite stellen für ~ 15-30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit eingestellt.
12. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtern ausgestattet, um EGFP und alle anderen für die Sekundärantikörper in den Schritten 5.8 / 5.9 verwendet geeigneten Wellenlängen zu visualisieren. In Kleinhirnscheiben, mit einem 20x-Objektiv an EGFP-KASH2 Kern Felgen anzuzeigen.

Results

Dieses Protokoll zeigt die Nützlichkeit der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell EGFP-KASH2 Ausdruck cerebellar Purkinje-Zellen unter Verwendung Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B)

Discussion

Der wichtigste Schritt, um erfolgreich zu studieren die Rolle des LINC-Komplexe in vivo unter Verwendung der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Modell ist, um eine geeignete Cre Mauslinie (n) zu identifizieren. In der Tat, wenn Cre ist in anderen Zelltypen in ähnlicher Wegen beteiligt aktiv, es kann die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Daher ist es wichtig, in der Nähe von Zellen zu untersuchen, wie hier in der molekularen und Körnerzellschicht des Cerebellums (2B) dargestellt. Ebenso ist es, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Paraformaldehyd Lösung	Elektronenmikroskopie Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Adhäsion Objektträger	StatLab	M1000W
Eselsserum	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anti-Calbindin Antikörper	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Antikörper	Abcam	ab13970
Anti-Nesprin2 Antikörper			Zuvor beschrieben in Ref. 21
Fluoreszierende Montage Medien	Dako	S3023
2-Methylbutan	Sigma Aldrich	O3551