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Methodenartikel

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

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DOI:

10.3791/53328

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2. Mai 2016

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1Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir zeigen die Vorbereitung und beschäftigen uns mit der Machbarkeit von zellulären Vehikeln, die Goldnanostäbchen für die photoakustische Bildgebung von Krebs enthalten.

Zusammenfassung

Gold-Nanostäbchen sind attraktiv für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen, wie zum Beispiel die fotothermische Ablation und der photoakustischen Bildgebung von Krebs, dank ihrer intensiven optischen Absorption im nahen Infrarot-Fenster, niedrige Zytotoxizität und Potential zu Hause in Tumoren. Allerdings ist ihre Lieferung an Tumoren immer noch ein Problem. Ein innovativer Ansatz besteht aus der Ausbeutung des Tropismus von Tumor-assoziierten Makrophagen , die mit Gold - Nanostäbchen in vitro geladen werden kann. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und die photo-akustischen Prüfung von Zellfahrzeuge Gold-Nanostäbchen enthält. PEGylierte Gold-Nanostäbchen sind mit quartären Ammoniumverbindungen modifiziert, um eine kationische Profil zu erreichen. Bei Kontakt mit murine Makrophagen in gewöhnlichen Petrischalen werden diese Partikel gefunden massiven Aufnahme in endozytischen Vesikeln zu unterziehen. Dann werden diese Zellen in biopolymeren Hydrogele eingebettete, die verwendet werden, um zu überprüfen, dass die Stabilität der photoakustischen Umwandlungsder Partikel wird in ihre Aufnahme in zelluläre Fahrzeugen beibehalten. Wir sind zuversichtlich, dass diese Ergebnisse neue Inspiration für die Entwicklung neuer Strategien plasmonic Partikel zu Tumoren zu liefern liefern.

Einleitung

Im Laufe der letzten zehn Jahre verschiedene plasmonic Partikel wie Gold - Nanostäbchen, Nanokugeln und Nanokäfige haben beträchtliche Aufmerksamkeit für Anwendungen in der biomedizinischen Optik 1, 2, 3, 4 empfangen. Abweichend von Standard - Gold - Nanokugeln, schwingen diese neueren Teilchen im nahen Infrarot (NIR) , welches 1 für tiefste optische Durchdringung durch den Körper und höchste optische Kontrast über endogene Komponenten. Dieses Merkmal hat das Interesse für innovative Anwendungen geweckt, wie der photoakustischen (PA) Bildgebung und die fotothermische Ablation von Krebs. Allerdings hemmen einige Probleme, die klinische Eindringen dieser Teilchen. Zum Beispiel neigt die optische Aktivierung ihre Überhitzung zu induzieren und ihre funktionelle Form zu mehr sphärischer Profile zu ändern, die eine Photoinstabilität 5 antreibt, 6, 7, 8 sup>, 9. Ein weiteres Problem, das die wissenschaftliche Debatte dominiert, ist ihre systemische Zufuhr in Tumoren. Insbesondere Gold-Nanostäbchen kombinieren Größen, die zu pervade Tumoren sind ideal, die mit spezifischen Sonden von malignen Markern erhöhte Permeabilität und Retention und Leichtigkeit der Konjugation anzuzeigen. Daher ihre Vorbereitung für eine direkte Injektion in den Blutkreislauf wird als machbar Schema 10 wahrgenommen, 11, 12, 13. Jedoch bleibt dieser Weg problematisch, wobei die meisten der Partikel durch die mononukleären Phagozyten System 10 erfasst immer, 11, 12. Darüber hinaus ist ein weiteres Anliegen der optische und biochemische Stabilität der Partikel nach der Zirkulation durch den Körper 14. Wenn Teilchen ihre kolloidale Stabilität und Aggregat verlieren, ihre plasmonic Merkmale und Wärmeübertragungsdynamik von Plasmonen Kopplung leiden 15, 16, 17 und Quer Überhitzung 18.

In jüngerer Zeit hat der Begriff den Tropismus von Tumor-assoziierten Makrophagen auszunutzen als intelligente Alternative 19, 20, 21 entstanden. Diese Zellen halten eine angeborene Fähigkeit, zu erkennen und zu durchdringen Tumoren mit hoher Spezifität. Daher kann eine Perspektive , diese Zellen von einem Patienten zu isolieren sein, sie mit Gold - Nanostäbchen in vitro laden und sie dann in den Patienten zu injizieren zurück, mit der Absicht , sie als zelluläre Fahrzeuge verantwortlich für die Lieferung zu verwenden. Ein weiterer Vorteil wäre, um mehr Kontrolle über die optische und biochemische Stabilität der Partikel zu gewinnen, weil ihre biologische Schnittstelle würde in vitro konstruiert werden. Dennoch müssen die Leistungen dieser zellulären Fahrzeuge als optische Kontrastmittel eine kritische Analyse.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Vorbereitung und die wichtigsten Fragen von Cellular Fahrzeuge Gold-Nanostäbchen für die PA-Bildgebung von Krebs enthält. PEGylierte Gold - Nanostäbchen sind mit quartären Ammoniumverbindungen 22, modifiziert , um ein kationisches Profil zu erreichen, die ihre Wechselwirkungen erwartet wird , mit plasmatischen Membranen 23, 24 zu fördern. Diese Partikel gehen effiziente und unspezifische Aufnahme von den meisten Zellarten, hoffentlich ohne viel mit ihren biologischen Funktionen zu stören. Murine Makrophagen geladen werden mit bis zu mehr als 200, 000 kationische Gold-Nanostäbchen pro Zelle, die in engen endocytic Vesikel eingeschlossen sein. Diese Konfiguration sollte Sorge entstehen, wegen der Gefahr von Plasmonen Kupplung und Quer Überhitzung im Inneren dieser Vesikel. Daher werden die Makrophagen in biopolymeren Hydrogele eingebettete, das biologische Gewebe zu imitieren, um zu verifizieren, dass der größte Teil der Stabilität der PA-Umwandlung der Teilchen in der Übertragung aus dem Wachstumsmedium zu den endozytischen Vesikel zurückgehalten wird. effective Messkriterien sind, um die Stabilität der PA-Umwandlung unter Bedingungen von unmittelbarem Interesse für PA-Bildgebung zu messen, ausgearbeitet. Eine Umformung Schwelle in den Anfängen der optischen Instabilität nach einem Zug von 50 Laserpulse mit der typischen Wiederholungsrate von 10 Hz eingestellt.

Wir sind zuversichtlich, dass diese Ergebnisse Impulse für die Entwicklung neuer Strategien zur Verfügung stellen können Plasmonen Partikel zu Tumoren zu liefern.

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Protokoll

Hinweis: Alle Konzentrationen von Gold-Nanostäbchen werden in Form von nominal Au Molarität ausgedrückt. Zum Vergleich mit anderen Arbeiten zu beachten, dass 1 M Au entspricht in etwa 20 & mgr; M Gold-Nanostäbchen, in unserem Fall.

1. Herstellung von kationischen Gold-Nanostäbchen

Hinweis: Das Verfahren beginnt mit der Synthese von Cetrimoniumbromid (CTAB) -capped Gold - Nanostäbchen durch die autokatalytische Reduktion von HAuCl 4 mit Ascorbinsäure, entsprechend dem Protokoll , das von Nikoobakht eingeführt et al 25 und angepasst gemäß Ratto et al 26... Dann werden diese Gold - Nanostäbchen modifiziert , um für plasmatischen Membranen mehr Biokompatibilität und Affinität zu gewinnen, die durch die Kombination von Polyethylenglykol Stränge 10, 11, 27, 28 und quartären Ammoniumverbindungen 22.

  1. Reinige 24 ml CTAB-capped Gold-Nanostäbchen an einem concentration von 450 uM Au durch zwei Zyklen von Zentrifugation (12.000 xg, 30 min) und Dekantierung. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Totvolumen Anfangsvolumen liegt bei etwa 1/200 oder weniger für alle Zentrifugationsschritte in diesem Protokoll. Verwenden 500 & mgr; M wässrigen CTAB als Waschlösung und übertragen schließlich die Teilchen in 6 ml 100 mM Acetatpuffer bei pH 5, enthaltend 500 uM CTAB und 0,005% (v / v) Polysorbat 20.
  2. Zugabe von 30 & mgr; l 10 mM wässrige alpha-methoxy-omega-mercapto-poly (ethylenglykol) (MW ~ 5000) gestellt und für 30 min bei 37 ° C zu reagieren.
  3. Zugabe von 30 & mgr; l 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N - trimethylammonium - bromid in Dimethylsulfoxid und verlassen in Ruhe für 24 h bei 37 ° C.
  4. diese Partikel durch vier Zyklen von Zentrifugation (12.000 xg, 30 min) und Dekantierung Nächstes fügen 18 ml 0,005% (v / v) Polysorbat 20 in Wasser und zu reinigen. Verwenden 0,005% (v / v) Polysorbat 20 in Wasser als Waschlösung und übertragen schließlich die Partikel in 2,4 ml steriler PBS bei pH7.4. Die endgültige Soll-Konzentration von Gold beträgt 4,5 mM.

2. Laden von murinen Makrophagen mit Gold-Nanostäbchen

  1. Verwenden, um die Monocyten / Makrophagen-Zelllinie J774A.1 und DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 1 mM Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin als Kulturmedium. Platte 5 x 10 5 Zellen in vier Petrischalen von 60 mm Durchmesser und lassen sie für 24 h wachsen, so wie zum Zeitpunkt der Ablösung subkonfluenten werden (siehe Schritt 2.2).
    1. Während des gesamten Protokolls beibehalten , die Zellen unter Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luft und 100% relativer Luftfeuchtigkeit). Verwenden Sie einen Laminarflowbox und geeignete persönliche Schutzausrüstung, um die Zellen zu manipulieren.
  2. Nach 24 Stunden laden, um die Zellen mit kationischen Gold-Nanostäbchen und bereiten sie in Chitosanfilme eingebettet werden:
    1. Um die Partikel zu ermöglichen, die von den Zellen aufgenommen zu werden, fügen Sie eine aliquote Menge von 4,5mM Au kationisches Gold-Nanostäbchen in PBS in jede Petrischale, um eine Endkonzentration von 100 uM Au zu erreichen. Lassen Sie die Petrischalen in einer Inkubationszeit von 24 Stunden.
    2. Als nächstes beachten Sie die Zellen unter einem optischen Mikroskop ihre guten Bedingungen und mit dem Hochladen zu bestätigen. Die Zellen sollten ihre normale Morphologie und eine Reihe von dunklen intrazellulären Vesikeln aufweisen. Lösen sich die Zellen durch einen Abstreifer, fusionieren die aus zwei Petrischalen, um eine geeignete Menge an Zellen für die folgenden Stufen (mindestens 2 x 10 6 Zellen) zu erreichen, und zentrifugieren (120 · g, 6 min) zu eliminieren jede Überschuss von kationischen Gold-Nanostäbchen. Die zelluläre Pellet sollte fast schwarz aussehen.
    3. Suspendiere das Pellet in 2 ml PBS und die Zellen durch die Verwendung eines Bürker Kammer zählen. Zentrifuge eine Suspension , die 2 x 10 6 Zellen (120 · g, 6 min) und fixieren ihre Pellet in 2 ml 3,6% (w / v) Formaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Schließlich waschen dieses Pellets dreimal durch centrifugation (120 · g, 6 min), um das Fixierungsmittel zu entfernen. Verwenden PBS als Waschlösung.

3. Embedment von Makrophagen in Chitosanfilme

Hinweis: Die besonderen Eigenschaften von Chitosan 26, 27, 28, 29 genutzt biomimetische Phantome Makrophagen gefärbt mit kationischen Gold - Nanostäbchen herzustellen enthält. In Bezug auf andere Hydrogele, wie Agarose, Chitosan ermöglicht Filme , die viel stärker und dünner sind, die für PA 6 Mikroskopie kritisch ist. Die Herstellung dieser Phantome erfolgt nach bisherigen Protokolle 29, 30, 31 mit einigen Modifikationen wie 30 in den Anhänger vorgeschrieben.

  1. Bereiten Sie eine angesäuert (pH 4,5, durch Zugabe von Essigsäure) und viskosen 3% (w / v) mit niedrigem Molekulargewicht Chitosan (durchschnittliche MW 120 kDa) Lösung, es gründlich mischen undließ es bei 40 ° C für 24 h zu homogenisieren.
  2. Enthaltend murine Makrophagen kationische Gold - Nanostäbchen (2 × 10 6 Zellen) mit 500 ul Chitosan - Lösung Als nächstes mischen.
  3. Um ~ 50 & mgr; m dicke Phantome zu erhalten, gießen Sie 250 mg der Mischung in 1,91 cm 2 Polystyrol - Formen und lassen sie unter einem Stickstoffstrom für 24 Stunden. Danach behandeln diese Proben mit 500 ul 1 M NaOH, um Vernetzung zu induzieren, und spülen Sie sie mit 10 ml Reinstwasser.

4. Testen der Stabilität von Photoakustische Conversion

Anmerkung: Die Stabilität der PA-Umwandlung wird mittels PA Experimente mit dem hausgemachten Einrichtung untersucht, die in Lit. 6 beschrieben.

  1. Suspend ein Chitosanfilm die Makrophagen in DI-Wasser, beispielsweise durch die Verwendung eines Kunststoffhalter eingetaucht in eine Petrischale enthält, um einen Abstand von ca. 5 mm von der Unterseite der Platte zu halten. Setzen Sie diese Platte auf eine mikrometrischer XY-Tischum die Probenposition zu steuern.
  2. Konzentrieren eines Laserstrahls mit ~ 5 nsec Impulsdauer in Resonanz mit der Längs plasmonic Band der Gold - Nanostäbchen (beispielsweise von einem optischen parametrischen Oszillator , der durch die dritte Harmonische eines Q-geschalteten gepumpten Nd: YAG - Laser mit Wellenlängenbereich von 400 - 2.500 Dauer von 5 nsec nm und Puls), die senkrecht zu der Filmoberfläche mit einem ~ 300 & mgr; m Punktdurchmesser.
    1. Platzieren ein Dämpfungsglied vor dem Laseraustritt zum Abstimmen des Laserfluenz und mit einem Strahlteiler einen Teil des Laserstrahls auf einen Energiezähler (beispielsweise ein pyroelektrischer Detektor) und zu überwachen Fluenz Schwankungen zu fokussieren. Pflegen Sie die optische Fluenz unter ~ 1 mJ / cm 2 pro Impuls bei der Ausrichtung. Verwenden Sie geeignete Laserschutzbrillen, wenn der Laser eingeschaltet ist.
  3. Dip einen Ultraschallwandler (Frequenzbereich von 1 - 20 MHz) in die Petrischale ~ 2 mm aus der Folienoberfläche und stellen seine Position durch mikrometrischer Übersetzungen unter Verwendung vonund Rotationsstufen der PA-Signal von dem Film emittiert wird, zu maximieren.
  4. Bestimmen Sie eine Sonde Fluence F LO, der nicht die Probe 6 nicht beschädigt:
    1. Bestrahlen einen beliebigen Punkt der Probe bei einer Fluenz etwa 1 mJ / cm 2 pro Puls mindestens 500 Impulse für. Für jeden Impuls, um das entsprechende PA-Signal von dem Ultraschallwandler und Laserflußdichte vom Energiezähler mit einem Oszilloskop zu erwerben. Benennen Sie die durchschnittliche Fluence als F LO - Studie.
    2. Berechnen der Intensität des PA-Signal als seine Peak-zu-Peak-Amplitude als Funktion der Impulszahl. Um die Laserintensitätsschwankungen auf das Gegengewicht, normalisieren die Amplitude jedes PA - Signal auf das Verhältnis von seiner eigenen Einfluss auf F LO - Studie. Analysieren Sie den Trend der normierten PA Intensität als Funktion der Pulszahl und die Prüfung seiner Stabilität im Laufe der Zeit.
    3. Im Falle der Instabilität, wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 mit einem niedrigeren Wert von F LO zu 4.4.3 Studie. Im Falle der Stabilität, wiederholen sie mit einem Wert von F LO Studie höher ~ 10%, bis ein Verlust der Stabilität ergibt. Stellen Sie die Sonde Fluence F LO als der zweithöchsten Wert von F LO - Studie , die Stabilität gewährleistet.
  5. Messen Sie eine Umformung Schwellfluenz:
    1. Wählen Sie einen anderen beliebigen Punkt der Probe und der Sonde eine durchschnittliche PA Intensität (I LO a) über 500 Pulse bei F LO.
    2. Stellen Sie eine nominale Fluence größer ist als F LO und 50 Impulse liefern. Nennen Sie ihre durchschnittliche Fluence als F exc.
    3. Sonde , die eine durchschnittliche PA Intensität (I LO b) über 500 Pulse bei F LO erneut. Berechnen Sie das Verhältnis R = I LO b / I LO ein. Ein Wert von R unter Eins gibt Beweise für eine irreversible Änderung der optischen Eigenschaften der Probe.
    4. Verwenden Sie die mikrometrischer XY-Tisch, um den Film zu bewegen und die poin ändernt der Probe nach dem Zufallsprinzip. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.1 mit unterschiedlichen Werten von F exc bis 4.5.4, um einige Werte von R unten zu nehmen, um und über die Einheit. 15 Punkte sind angemessen.
    5. Plot R als Funktion von F exc und identifizieren die Umformungs Schwellfluenz F th als dieser Wert , wenn R von einem über statistische Unsicherheit zu unterscheiden beginnt. 6

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Ergebnisse

Hier wird die Machbarkeit der zellulären Fahrzeuge Gold-Nanostäbchen für die PA-Bildgebung von Krebs enthält, wird zusammen gezeigt mit typischen Ergebnisse des Protokolls.

Die TEM - Aufnahmen in Abbildung 1 zeigen die übliche Erscheinung der Partikel nach dem Schritt 1 und ihre zellulären Fahrzeuge nach Schritt 2. Die Herstellung der Partikel und der Zellen für TEM - Aufnahmen wird an anderer Stelle 17

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Diskussion

Der Begriff tumorassoziiertes Makrophagen zeichnet sich als ein leistungsfähiges Konzept zu zielen 34 Krebs zu bekämpfen, 35, 36. Hier kann anstelle ihrer Zerstörung sind diese Zellen als zelluläre Fahrzeuge rekrutiert Gold-Nanostäbchen in einen Tumor zu bringen, durch die Ausnutzung ihrer Tropismus. Diese Perspektive erfordert eine durchdachte Design der Partikel, deren Integration in die Zellen und deren Charakterisierung. Wir haben festgestellt, daß die Photostab...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise von der Region Toskana und der Europäischen Gemeinschaft im Rahmen des ERANET + Projekte LUS BUBBLE und BI-TRE unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HexadecyltrimethylammoniumbromidSigma-AldrichH6269Zur Synthese von Gold-Nanostäbchen
Gold(III)-chlorid-TrihydratSigma-Aldrich520918Zur Synthese von Gold-Nanostäbchen
SilbernitratSigma-AldrichS6506Zur Synthese von Gold-Nanostäbchen
L-AscorbinsäureSigma-AldrichA5960Zur Synthese von Gold-Nanostäbchen
NatriumborhydridSigma-AldrichZur Synthese von Gold-Nanosaaten
MeO-PEG-SHIris BiotechPEG1171Zur PEGylatierung von Gold-Nanostäbchen. Molekulargewicht ca. 5.000 Da.
EssigsäureSigma-Aldrich320099zu PEGylatierung von Gold-Nanostäbchen und Solubilizen von Chitosan
NatriumacetatSigma-AldrichS8750zu PEGylat von Gold-Nanostäbchen
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-TrimethylammoniumbromidSigma-Aldrich733305zur Modifizierung von Gold-Nanostäbchen mit quartären Ammoniumverbindungen
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich276855Zur Solubilisierung von (11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammoniumbromid
Polysorbat 20Sigma-AldrichP2287Zur Zentrifugation von PEGylierten Gold-Nanostäbchen
PBSLonzaBE17-516FZur Suspendierung von Gold-Nanostäbchen vor der Inkubation mit Zellen und zur Behandlung von Zellpellets
J774a.1ATCCTIB-67Monozyten/Makrophagen Maus-Zelllinie
DMEMLonzaBE12-707FZellkulturmedium
FBSLonzaDE14-801FZur Zugabe zu Zellkulturmedium
L-GlutaminLonzaBE17-605EZur Zugabe zu Zellkulturmedium
Penicillin/StreptomycinLonzaDE17-602EZur Zugabe zu Zellkulturmedium
PetrischaleNEST705001Zellkultur Schale
ZellschaberEuroCloneES7018Zum Ablösen von Zellen
FormaldehydFluka47630Zum Fixieren
von Zellen Chitosan, niedermolekularesSigma-Aldrich44886975-85% deacetyliert. Molekulargewicht ca. 120.000 Da.
NatriumhydroxydSigma-Aldrich306576Zur Unlöslichkeit von Chitosan und zur Erzeugung des Hydrogels
Polystyrol-ZellkulturplattenNEST702011Wird als Form zur Herstellung von Chitosan-Hydrogelen verwendet
Optischer parametrischer Oszillator, der von der dritten Harmonischen eines gütegeschalteten Nd:YAG-Lasers gepumptwird Kontinuum, Santa Clara, USASurelite OPO plusQuelle der optischen Anregung für photoakustische Tests
Pyroelektrischer Detektor Gentec, Quebec, KanadaQE8SPZur Überwachung der optischen Fluenz für photoakustische Tests
Vorverstärktes NadelhydrophonPrecision Acoustic, Dorset, UKModell mit 1 mm Sensordurchmesser und Frequenzbereich von 1-20 MHzZur Messung photoakustischer Signale

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