Måling Vedlegg og internalisering av Influensa A virus i A549-celler ved flowcytometri
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
Oppføringen av influensa A virus (IAV) er en flertrinnsprosess som starter med bindingen av viruset til reseptorer på plasmamembranen av målceller 1. Reseptoren for IAV er sialinsyre som er tilstede på et stort utvalg av glykoproteiner og glykolipider. Hemagglutinin (HA) av IAV protein som er tilstede i den virale kappe bindes til sialsyre og derved formidler festing av viruspartikler til plasmamembranen av målceller 2. Viruset kommer inn i cellene via clathrin endocytose, men også alternative inngangsveier, for eksempel macropinocytosis, har blitt beskrevet 3-6. Samspillet mellom HA og sialinsyre synes å være tilstrekkelig for å mediere både feste og utløsning internalisering av virale partikler 7. Likevel har alternative inngangs reseptorer blitt foreslått og deres roller i IAV oppføringen er for tiden under etterforskning 1,8,9.
Currently, søker man å identifisere vertsfaktorer som er involvert i den virale livssyklus med sikte på å utvikle haster nye antiviral terapi 10-12. Virus entry ville være en gunstig skritt for målretting IAV vekst for å blokkere viral infeksjon ved dens tidligste punkt. Måling forskjellige stadier av IAV inngangs eksperimentelt er utfordrende som vanligvis store mengder av virus er nødvendig for å detektere innkommende virus. I tillegg er deteksjonsområde for endringer i virus angivelse lineær på grunn av mangel på viral replikasjon. Dette understreker behovet for analyser med høy følsomhet.
Analysen vi presenterer her tillater påvisning av bundet virus ved celleoverflaten, samt påvisning av virus internalisert i forhold til den totale mengden av celle-assosiert virus. Bruken av biotinylert villtype-virus gir praktisk måling ved farging med STV-Cy3 og avlesning ved strømningscytometri. Biotinylated virus er kald-bundet til celles for å tillate vedlegg, men hindre internalisering av viruspartikler. Celler kan fikses, permeabilized og farget med STV-Cy3 å måle festet virus. Signalet fra ekstracellulære, festet virioner kan oppheves hvis en blokkeringstrinn påføres før fiksering i hvilken cellene blir inkubert med ikke-merket streptavidin (STV). I et neste trinn, etter feste av biotinylert IAV, blir temperaturen skiftet til 37 ° C og internalisering av virale partikler tillates å finne sted. Internalisert partikler er beskyttet mot binding av STV dermed tillater diskriminering mellom ekstra og intracellulære virus.
Per eksperimentell tilstand, er fire prøver kreves: '0 min': Den første prøven, merket '0 min', er å måle kald-bundet virus ved celleoverflaten. '0 min + STV': den andre prøven, merket '0 min + STV', gir referansesignalintensiteten av forsøket. Vedlagt virus blokkeres viddh STV og signalet etter farging med STV-Cy3 bør være mye lavere enn i '0 min' prøven. '30 Min ': Den tredje prøve, '30 min' inneholder bundet og internalisert virus på grunn av temperaturen skiftet til 37 ° C i 30 min. '30 Min + STV ': Den fjerde prøven, '30 min + STV' tiltak den intracellulære brøkdel av virus. Den STV blokkeringstrinn påføres etter 30 min inkubasjonstid. Som et resultat, er virale partikler på celleoverflaten bundet av STV slik at bare internaliserte virus er tilgjengelig for farging med STV-Cy3. Den relative mengde av internalisert virus kan beregnes som forholdet mellom internalisert virus (målt i '30 min + STV 'sample) dividert med den totale mengden av virus (beskrevet av '30 minutter "prøve).
Som kontroller vi foreslår å inkludere mock-infiserte celler. Signalet følgende STV-Cy3 farging av mock-infiserte celler gir bakgrunnsom følge av fargings protokollen. En kontroll for IAV vedlegget er forbehandling av celler med bakteriell neuraminidase (NA). NA spalter off sialinsyre fra cellulære glykoproteiner, for derved å fjerne feste reseptorer fra celleoverflaten. Natriumazid (SA) er et potent metabolsk inhibitor, og derved blokkerer endocytose 13. Celler behandlet med natriumazid bør være positivt for viruset bindende, men negativt for internalisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår protokollen beskriver en enkel måte å måle virus tilknytning og internalisering ved strømningscytometri. Det tillater bruk av merket villtype-virus som etterligner tettere virusinfeksjoner sammenlignet med anvendelsen av viruslignende partikler (VLP). Mens vår protokollen har blitt optimalisert for å måle tilknytning og internalisering av IAV det kan lett tilpasses for andre virus. I tillegg, som flowcytometri brukes for avlesning, co-stainings enkelt kan legges til protokollen f.eks å teste uttryk…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra den sveitsiske National Science Foundation (31003A_135278) til SST. MOP er mottaker av et doktorgradsstipend fra AXA forskningsfond. Vi takker Patricia Nigg for hjelp med utforming av figur 1.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
Referenzen
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virolog. 2, (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G., Macey, M. G. . Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
