Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Sortierstrategie für Mausspermatiden mittels Durchflusszytometrie. Die Spermatiden werden in vier hochreine Populationen eingeteilt, darunter runde (Spermiogenese-Schritte 1-9), früh-elongierende (Spermiogenese-Schritte 10-12), spät-elongierende (Spermiogenese-Schritte 13-14) und längliche Spermatiden (Spermiogenese-Schritte 15-16). DNA-Färbung, Größe und Granulosität werden als Selektionsparameter verwendet.

Zusammenfassung

Die Differenzierung der Maus Spermatiden eines kritischen Verfahren zur Herstellung einer funktionellen männlichen Keimzellen mit intakter Genoms auf die nächste Generation übertragen werden. Bisher wurden molekulare Studien dieser morphologischen Übergang durch das Fehlen eines Verfahrens ermöglicht eine angemessene Trennung dieser wichtigen Schritte spermatid Differenzierung für nachfolgende Analysen behindert. Frühere Versuche zur richtigen Gating dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie kann schwierig gewesen, weil der eine eigentümliche Steigerung der DNA-Fluoreszenz in Spermatiden unterziehen Chromatin-Remodeling. Basierend auf dieser Beobachtung, bieten wir die Details eines einfachen Durchflusszytometrie Schema, wodurch reproduzierbare Reinigung von vier Populationen mit Ethanol fixiert Maus Spermatiden, die jeweils einen anderen Zustand in der Kernumbauprozess. Bevölkerung Anreicherung mit Schritt-spezifische Marker und morphologischen Kriterien bestätigt. Die gereinigten Spermatiden für Genom- und Proteom verwendet werdenic-Analysen.

Einleitung

Haploide runde Spermatiden differenzieren sich durch einen Prozess, der Spermiogenese genannt wird, zu Spermien. Dies umfasst viele verschiedene Schritte, darunter die Anschaffung eines Flagellums, den Umbau des Chromatins und des Zytoskeletts, die Kondensation des Zellkerns sowie den Verlust des größten Teils des Zytoplasmas. Diese einzigartigen zellulären Ereignisse müssen fein reguliert werden, um einen reifen funktionsfähigen Gameten mit einem intakten Genom zu erzeugen, das für die Befruchtung geeignet ist. Die Spermiogenese kann in vitro kaum untersucht werden, da kein zuverlässiges Zellkultursystem bisher in der Lage ist, das Fortschreiten durch die verschiedenen Prozessschritte zu unterstützen. Darüber hinaus führen die derzeitigen In-vitro-Techniken zu einer schlechten Ausbeute^1,2. In vivo sind korrekte Übergänge durch die verschiedenen Schritte der Spermiogenese entscheidend für die natürliche funktionelle Integrität der männlichen Gameten. Eine erfolgreiche Reinigung der Spermatiden nach ihren Differenzierungsschritten wurde noch nie mit einem ausreichenden Anreicherungsgrad erreicht, um eine molekulare Charakterisierung der Spermiogenese zu ermöglichen. Zum Beispiel wäre die Reinigung von Schlüsselschritten der spermatiden Differenzierung besonders nützlich, um das sich entwickelnde Akrosom, die Bildung des Mittelstücks³, die Zellübergangsdynamik⁴, die RNA-Dynamik⁵, den Chromatin-Umbauprozess^6,7 oder die genomische Stabilität⁸ zu untersuchen. Die Reinigung der Spermatiden wurde durch ihre fortschreitende morphologische Transformation, das Fehlen bekannter stadienspezifischer externer Biomarker und ihre eigentümliche Form und Größe behindert.

Obwohl die meisten männlichen Keimzellen eine direkte Beziehung zwischen DNA-Färbung und Ploidie (DNA-Gehalt) aufweisen, haben wir festgestellt, dass eine solche positive Korrelation nicht mehr auf Spermatiden anwendbar ist. Dies beruht auf unserer frühen Beobachtung, dass Schnitte aus Samenkanälchen eine unterschiedliche Intensität der DNA-Färbung über die verschiedenen Schritte der Spermiogenese hinweg aufweisen. Obwohl die DNA-Färbung mit ihrem haploiden Chromosomensatz aus den Spermiogenese-Schritten 1 bis 7 (runde Spermatiden) übereinstimmt, beobachteten wir einen starken Anstieg der Fluoreszenzintensität mit DAPI oder SYTO 16 um den Beginn der Kernreorganisation und des Chromatin-Remodells (Spermiogenese Schritt 8), der einen Höhepunkt zu Beginn der Kernkondensation erreichte (Spermiogenese Schritte 11-12). Nach der Kondensation des Zellkerns nimmt die Intensität der DNA-Färbung bis zur Spermierung ab (Spermiogenese Schritt 16). Wir vermuteten, dass dies wahrscheinlich mit der Bildung ihres eigentümlichen Chromatinstrukturübergangs zusammenhängt, bei dem Histone durch Protamine ersetzt werden. Wir haben daher eine zuverlässige Durchflusszytometrie-Methode entwickelt, die die Trennung von Spermatiden ermöglicht, wobei die Variation der DNA-Intensität der Spermatiden als Hauptselektionsparameter verwendet wird.

Ein einfacher Durchflusszytometrie-Ansatz wird beschrieben, um Mausspermatiden mit hoher Reinheit (95-100%) basierend auf ihrem scheinbaren DNA-Gehalt (SYTO16-Färbung), ihrer Größe und Granulosität zu trennen. Die Spermatiden werden in vier Populationen unterteilt; Spermiogenese Schritte 1-9, 10-12, 13-14 und 15-16. Aufgereinigte Spermatide eignen sich sowohl für genetische/genomische Analysen als auch für proteomische Anwendungen, wie in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung unserer Gruppe⁹ beschrieben.

Protokoll

Tierpflege war in Übereinstimmung mit der Université de Sherbrooke Animal Care und Verwenden Ausschuss.

1. Rohrvorbereitung

1. Am Tag vor der Zellsortierung, 1-2 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu 5 ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden und auf 15 ml und 50 ml-Polypropylen-konischen Röhrchen.
   Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr in der Protokoll ist beschichtet.
   Hinweis: FBS Beschichtung verhindert Keimzellen vom Kleben an Rohrwänden.
2. Langsam Einmischen O / N durch Inversion bei 4 ° C zur Beschichtung der Rohre gleichförmig unter Verwendung eines Rotators.
3. Am nächsten Tag, entfernen FBS aus beschichteten Röhrchen durch Dekantieren.
   1. * Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die 5-ml-Polypropylenrundrohre und die 15 und 50-ml-Röhrchen für Zellzubereitung verwendet (Protokoll Schritte 2,1-2,11) vollständig von FBS zu entleeren, um Fanning (dh ungenaue Abweichung der Seitenströme) zu verhindern. Verwenden Sie ein P200-Pipette, um die FBS zu entfernen.
      Hinweis: Rest FBS in Rohren vor dem Sortieren kann zu einem Verlust von Zellen oder Kontamination anderer Rohre während der Zellsortierung verwendet werden, führen,
   2. Lassen Sie eine kleine Restvolumen von FBS (etwa 100-200 & mgr; l) in der 5 ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen zum Sammeln gereinigten Zellen verwendet.

2. Zellpräparation

1. Opfern eine männliche Maus unter Narkose mit _O 2 / Isofluran (Induktion bei 5% dann bei 2% gehalten), gefolgt von _CO 2 Ersticken.
2. Verbrauchsteuern und decapsulate beide Hoden und Hackfleisch mit einer kleinen Schere in 500 ul Sortierpuffer in ein 1,5-ml-Tube.
3. Flush Keimzellen aus Samenleiter durch leichtes nach oben und unten Pipettieren in der 1,5-ml-Röhrchen, zuerst mit einer abgeschnittenen 100-1000 ul Spitze, und dann mit einem intakten 100-1000 ul Spitze.
4. Entfernen Sie die Ablagerungen und Klumpen von einem Filtrationsschritt unter Verwendung eines 40 & mgr; m Zellsieb und sammeln Filtrat in das 50 ml konischen Röhrchen zurückiously mit FBS in Schritt 1 überzogen.
5. Das Filter einmal zu waschen mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von 3 ml und Transfer Filtrat in 15 ml konischen Röhrchen zuvor in Schritt 1 beschichtet.
6. 16 ul 50 mM EDTA pH 8 pro ml Zellsuspension (48 & mgr; l für 3 ml), um eine Endkonzentration von 0,8 mM EDTA erhalten.
7. Um dies zu beheben Keimzellen, langsam 3 Volumina eiskaltem 100% Ethanol mit einem 10-ml-Pipette unter leichtem Schütteln (Vortex bei niedriger Geschwindigkeit), die eine milchige Suspension erzeugt.
   Kritischer Schritt: Langsame Zugabe Ethanol ist entscheidend und wichtig, um die Integrität der Zellpräparation zu erhalten. Wir haben festgestellt, dass eine schnelle Zugabe von Ethanol verursacht Zelllyse was zu einer großen Abnahme der Sortiereffizienz. Für einen 3 ml Zellsuspension sollte 9 ml Ethanol in ca. 1 min zugefügt werden.
8. Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min unter gelegentlichem Mischen durch Umdrehen.
9. Centrifuge Zellsuspension bei 800 xg für 5 min und entfernen Sie die klareÜberstand.
10. Vorsichtig resuspendieren festen Keimzellen in 2 ml Sortierpuffer.
11. In 4 ul SYTO16 DNA-Farbstoff (1 mM Lösung in DMSO) und Inkubation für mindestens 30 min (lichtgeschützt).
    Hinweis: Die besten Ergebnisse werden mit Sortier SYTO16 da es eine durchlässige DNA-Farbstoff, der leicht in die stark verdichteten Kerne von Spermatiden eingebaut erhalten.

3. Cell Sorter einrichten

Hinweis: Hier ein 4-Laser (405 nm - violett, 488 nm - blau, 561 nm - gelb-grün, 633 nm - rot) 20-Parameter BDFACSAria III Zellsortierer verwendet. Der BD FACSDiva 6.1.3 Software dient zur Visualisierung und Analyse der Daten. Die Einstellungen können abhängig von der Art von Sortierer variieren.

1. Sterilisieren Sie die FACS-Sorter, indem Sie 70% Ethanol als Mantelflüssigkeit während der Fluidik Shutdown-Vorgang (Menü "Cytometer" in der Software) vor der Sortierung. Wählen Sie "Cytometer" in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie "Fluidic shutdown ". Folgen Sie den durch die Prozesse genannten Schritte.
2. Vorzubereiten und zu filtern 1x PBS mit einem 0,22 um-Filter, um jegliche Kristalle und Verunreinigungen zu beseitigen. Füllen der Hülle mit dem oberen Tank Schweißlinie auf der Innenseite des Tanks.
3. Starten Sie die Software und melden Sie sich an. Starten Sie den FACS-Sorter, um vor der Sortierung Aufwärmen der Laser für mindestens 30 min. Führen Sie zwei fluidische Startprozesse von den Fluidik spülen, die Ethanol. Wählen Sie "Cytometer" in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie "Fluidic startup". Befolgen Sie die von den Prozessen genannten Schritte.
   Hinweis: Diese stellt Fluidik mit normaler Hüllflüssigkeit (1x PBS).
4. Reinigen Sie die Sortierblock und die Ablenkplatten mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie gründlich. Beschallen eine 100 & mgr; m Düse in einem Rohr aus destilliertem Wasser für 2 Minuten in einem Ultraschallbad gestellt. Wischen Sie die Düse gründlich.
5. Legen Sie die 100 & mgr; m Düse in die Durchflusszelle und drehen Sie die Düse-Verriegelungshebel im Uhrzeigersinn, um die 12-hr Position. Stellen Sie den Mantel Druck auf 20 psi.
6. Schalten Sie den Strom und stellen Sie die Amplitude, um Zielwerte für Frequenz (rund 30) zu erhalten, Tropfen 1 (um 150) und Gap (rund 12) und um eine stabile Tröpfchenabbruchmuster (einige Satellitentropfen) zu etablieren. Schalten Sie Dämpfung.
7. Stellen Sie sicher, dass der Strom ist gerade und mittig auf dem Abfall Absauger durch Veränderung des Winkels der Art Block. Hinweis: Eine 130 & mgr; m Düse bei 10 psi wurde ebenfalls getestet und kein offensichtlicher Unterschied gefunden wurde.
8. Set Laserverzögerung auf 0 für den blauen, -77,39 für den roten, 37,33 für die violetten und -39,85 für die gelb-grünen Lasern.
9. Set Bereichen Skalierung auf 1,14 für die blaue, 1,0 für den roten, 0,75 für die violetten und 0,96 für die gelb-grünen Lasern.
10. Verwendung eines Test Sort (im Fenster "Nebenstrom" der Software), stellen Sie sicher, dass die Nebenströme nicht schüren. Im Fenster "Nebenstrom", passen Sie die Schieberegler, Spannungs jeder Nebenstrom, so dass sie die middl getroffene von Testsammelröhrchen. Wenn die Mitte-Stream ist nicht fest, passen Sie die ^2., 3., ^und 4. Tropfen-Einstellungen, um das Zentrum Strom zu begrenzen.
11. Starten Sie das Setup-Cytometer und Tracking (CS & T) Anwendung in der Software (Menü "Cytometer").
12. Verwenden Sie die Zytometer Einrichtung und Tracking-Kügelchen bei 1 Tropfen je 350 & mgr; l, um die Charakterisierung und Verfolgung der Zytometer Leistung durch Herstellerangaben zu automatisieren.
13. Beenden Sie das CS & T-Anwendung. Übernehmen CS & T-Einstellung sicher, dass die Stromparameter eine stabile Tröpfchenabbruchmuster immer noch erlauben, und schalten Sie den Sweet Spot-Taste nach Herstellerangaben (in der "Abbruchfenster").
14. Optimieren Sie die Tropfen-Verzögerungswert unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Installieren Sie die Sammelröhrchen in den Halter. Öffnen Sie die Art Blocktür. Im Fenster "Nebenstrom", schalten Sie Spannung wählen Sie dann "Test-Art "und klicken Sie auf den Aspirator Drawer-Taste, um die Lade zu öffnen und Zugang zu den Sammelröhrchen.
    2. Optimieren Sie die Seitenströme, so dass sie in die Mitte des Rohres zu gehen. Einstellen von Werten und Schieberegler nach Bedarf.
    3. Schließen Sie die Art Blocktür und stellen Sie sicher, um die Messuhr anpassen, um die hellsten Perle Ort in der Mitte zu erhalten. Unselect Abfallschublade, Test Art und Spannung. Die Sammelröhrchen zu entfernen.
    4. Optimieren Sie das Drop-Verzögerung nach den Anweisungen des Herstellers.
       1. Kurz schütteln Wulst Fläschchen kräftig und verdünnter 1 Tropfen Perlen in 0,5 ml PBS.
       2. Verwenden von Anweisungen des Herstellers, setzen Sie das Drop-Verzögerung mit der Tröpfchenverzögerungs Experiment Vorlage in der Software verfügbar. Alternativ können Sie die Auto-Tropfen-Verzögerungsfunktion, um die Drop Verzögerung einstellen.
       3. Legen Sie das Rohr des fluoreszierenden Kügelchen und stellen Sie die Durchflussrate, bis die Schwellenwertrate ist ~ 3000 bis 4000 Ereignisse / Sekunde. Legen Sie die Sortiergenauigkeit zu "Initial" und letztely zur "Feinabstimmung" im Fenster "Layout Sortieren". Wählen Sie das optische Filter und Sortier Perlen. Stellen Sie die Drop-Verzögerung, bis ~ 100% werden nach links sortiert.
          Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass Zellen von Interesse Art in einem Seitenstrom. Die Kügelchen und das optische Filter verwendet Nähe einer 100% Tröpfchenabweichung zu erzielen.
15. Legen Sie eine FSC 1.5 ND (Neutraldichte-Filter) am linken Ende des FSC Detektorblock. Stellen Sie das Fenster-Erweiterung bis 2,00 & mgr; s und der FSC Bereich Skalierung auf 1,00 (im Register "Laser" im Fenster "Cytometer").
16. Vor dem Laden Probenröhrchen, legen Sie eine Probe Filterlinie von 50 um am Ende der Probenleitung, um Klumpenbildung zu vermeiden. Um dies zu tun, wählen Sie "Ändern Probe Filter" im Menü "Cytometer".
17. Testen der Zusammensetzung der Probenflüssigkeit, um eine gute Trennung ohne Auffächern zwischen den Seitenstrom zu erreichen und um die Zellen ein Anhaften an die Polypropyle verhindernne Rohre.
    1. Laden Sie das Probenröhrchen, schalten Sie den Ablenkplatten und wählen Sie "Test Art" mit die Schublade geschlossen ist. Schauen Sie sich Seitenströme, wenn die Trennung erfolgt, ohne zu viel Fanning.
       Anmerkung: Fanning wahrscheinlich aufgrund einer hohen Proteinkonzentration in der Probenpuffer.
18. Laden Sie das Probenröhrchen in die FACS-Instrument. Wählen einer Probe Rühren mit 300 Umdrehungen pro Minute und einer Probentemperatur von 4ºC. Wählen Sie "Acquire Data" in der "Acquisition-Dashboard".
19. Wenn nötig, verdünnen die Probe, um einen geeigneten Ereignisrate auf maximal 5.000 Veranstaltungen / s (bei einer maximalen Durchflussrate von 3,0) zu erreichen. Streng an diese Grenzen, so daß die Reinheit der sortierten Zellen aufrechtzuerhalten.
20. Zu analysieren und zu sortieren, die Zellen, die Optimierung der FSC Schwellenwert, um Schmutz, ohne sich mit der Bevölkerung von Interesse zu beseitigen. Im logarithmischen Maßstab, damit Einstellung der Spannung der Photomultiplierröhre (PMT) Detektor mit dem 530/30 Filtersicher, dass das Fluoreszenzsignal der Gesamtbevölkerung passt innerhalb der Skala und Gate auf dem positiven Population (Abbildung 1, Gate 1).
21. Produzieren eine Forward Scatter-Bereich (FSC-A) / Side Scatter-Bereich (SSC-A) Plot des SYTO16 positive Bevölkerung und stellen Sie die FSC-A auf etwa 110 V im linearen Skala und die SSC-A auf etwa 150 V im logarithmischen Maßstab, um alle Ereignisse zu visualisieren, während ohne sehr große Zellen und Zellaggregate.
22. Im Fenster "Sortieren Layout", stellen Sie den "Sortieren Präzisionsmodus" auf "4-Wege-Reinheit" (Yield Maske: 0, Reinheit Maske: 32, Phasenmaske: 0). Wählen Sie aus dem Menü "Ziel-Events" für die kontinuierliche Sortierung "Continuous".
23. Hinzufügen Populationen auf dem Gebiet entsprechend den Rohren zu sortieren (im Fenster "Sort Layout"). Stelle Populationen mit höheren Frequenzen in der Mitte und die mit niedrigeren Frequenzen an den Enden. Stellen Sie die Spannungsplatten bis 2500 V. Bei Sortierung, halten Sie die Probensammlung tUBEs auf Eis.

4. Zellsortierung

1. Unmittelbar vor dem Sortieren, Filterzellen unter Verwendung eines Filters 50 & mgr; m in einem zuvor beschichteten 5 ml Polypropylen-Rundrohr.
2. Den Filter ausgiebig waschen mit 1-2 ml Sortierpuffer.
3. Sortieren festen Keimzellen unter Verwendung eines 488 nm-Laser ausgestattetes Zellsortierer nach dem Gating-Schema in Abbildung 1 beschrieben. Collect gereinigten Fraktionen in 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen zuvor in Abschnitt 1 auf Eis überzogen.
   1. Sicherstellen, dass 100-200 ul FBS in den Sammelröhrchen gehalten werden, um ein Verkleben der sortierten Zellen an der Rohrwand zu vermeiden.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von SYTO16 wird sättigen, um Fluoreszenzfluktuationen während des Sortierzeit zu vermeiden. SYTO16 wird sättigt, wenn es keine weitere Veränderung der Zellfärbung Intensität am Alexa Fluor 488-Parameter (DNA-Färbung) in den Sortier Grafik. Falls erforderlich, fügen 1 ulSYTO16 zur Sortierrohr, um eine Sättigung zu erreichen.
   3. Zeigen Sie die Gesamt Veranstaltungen auf einer grafischen Anzeige der folgenden Parameter: Anzahl der Ereignisse vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Wählen Sie die positive DNA-Färbung Zellen mit Gate 1, wie in Abbildung 1 dargestellt.
      1. Anzeigezellen von Tor 1 auf einer Grafik mit SSC-A vs FSC-A als Parameter
         1. Markieren Sie die Zellen mit Gate 2, wie in Abbildung 1 gezeigt.
         2. Display-Zellen von Gate 2 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
         3. Wählen Sie Zellen mit Gate 5 und Gate 6 am Gate 2 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt.
         4. Separat Gate 5 und Gate 6 Anzeige auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
         5. Wählen Spermiogenese Schritte 1-9 Spermatiden auf dem Gate 5 Grafik und Spermiogenese Schritte 10-12 Spermatiden auf dem Gate 6 Grafiken, wie in Abbildung 1 gezeigt.
      2. AnzeigenZellen von Tor 1 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter
         1. Wählen Sie Zellen mit Tor 3 und Tor 4, wie in Abbildung 1 gezeigt.
         2. Separat Tor 3 und Tor 4 Zeigen Sie auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
         3. Wählen Spermiogenese Schritte 13-14 Spermatiden auf dem Gate 3 Grafik und Spermiogenese Schritte 15-16 Spermatiden auf dem Gate 4 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt.

Ergebnisse

Gating-Strategie mit der Durchflusszytometrie verwendet

Abbildung 1 stellt die Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie verwendet werden, um vier hochreine spermatid Populationen zu sortieren. Kurz gesagt, Zellen mit positiven DNA-Färbung (Alexa Fluor 488-A) zunächst mit Tor 1. Spermatiden von Spermiogenese Schritte 1-12 ausgewählt sind (Tor 2) auf einer Punkt-Diagramm, das die granulosity (SSC-A) vs Größe...

Diskussion

Spermatogenen Zellen waren schon immer eine Herausforderung, angesichts der Komplexität der Keimepithel sowie den begrenzten Erfolg der In-vitro-Kultur zu studieren. Im Laufe der Jahre sind viele Ansätze zur Reinigung von Keimzellen aus verschiedenen Spezies entwickelt. Sedimentation Techniken unter Verwendung von Schwerkraftaufbereitung mit Percoll oder Rinderserumalbumin Gradienten bieten in der Regel eine gute Ausbeute an intakten Keimzellen, aber nicht über angemessene Definition zwischen einigen Zelltypen ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isofluran	ABBOT	05260-05	Für die Mausanästhesie vor der Euthanasie
Fötales Rinderserum	Wisent	90150	Für die Tubenbeschichtung
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	Für die Sortierpuffervorbereitung
HEPES	Sigma	H	Für die Sortierpuffervorbereitung
100% Ethanol		092-09-11N	Für die Zellfixierung
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA-Färbung
5 ml Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden	BD Falcon	352063	Sammlung von sortierten Zellen
15 ml Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden	PROgene	1500
50 ml Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden	PROgene	5000
TEC4 Anästhesie-Vaporizer	Ohmeda	1160526	Für die Euthanasie von Mäusen
CO2 Gastank	Praxair	C799117902	Für die Euthanasie von Mäusen
O2 Gastank	Praxair	O254130501	Für die Euthanasie von Mäusen
Hausgemachte Mäusegaskammer			Für die Euthanasie von Mäusen
40 & micro; m Falcon Zellsieb	Corning Incorporated	352340
50 μ m Probenleitungsfilter	BD Biosciences	649049 Vortex-Mischer
	Labnet international, inc.	S0200	Für die Zellfixierung
Dynac Zentrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µ m Filter	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped Zellsortierer	BD	Biosciences FACSAria III
Accudop Fluoreszierende Beads	BD Biosciences	345249
Sortierpuffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBS			FBS ist hitzeinaktiviert. Frische Lösung herstellen, 0,22 μ m filtriert und bei 4°C aufbewahren.