Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Zusammenfassung

Elektronanofasern weisen eine hohe Oberflächenverhältnis, ausgezeichnete mechanische Integrität zu gewichten, und das Zellwachstum und Proliferation unterstützen. Diese Nanofasern haben eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen. Hier fertigen wir Keratin / PCL-Nanofasern, die Elektrospinntechnik, und zu charakterisieren, die Fasern für mögliche Anwendungen im Tissue Engineering.

Zusammenfassung

Elektrospinnen aufgrund seiner Vielseitigkeit und Potential für Anwendungen in verschiedenen Bereichen wird häufig zur Herstellung von Nanofasern verwendet wird. Die Herstellung dieser porösen Nanofasern ist von großem Interesse aufgrund ihrer einzigartigen physikochemischen Eigenschaften. Hier erarbeiten wir auf die Herstellung von Keratin enthaltenden Poly (ε-caprolacton) (PCL) Nanofasern (dh PCL / Keratin Verbundfaser). Wasserlösliche Keratin wurde zuerst aus Menschenhaar und gemischt mit PCL in unterschiedlichen Verhältnissen extrahiert. Die gemischte Lösung von PCL / Keratin wurde in Nanofasermembranen umgewandelt ein Labor entwickelt Elektro mit aufgebaut. Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie und Zugprüfmaschine Fasermorphologie und mechanischen Eigenschaften der erhaltenen Nanofaser wurden beobachtet und gemessen. Weiterhin Abbaubarkeit und chemischen Eigenschaften der Nanofaser wurden durch FTIR sucht. SEM-Bilder zeigten, gleichmäßige Oberflächenmorphologie für PCL / Keratinfasern unterschiedlicher Zusammensetzung. Diese PCL / Keratin Fasern zeigte auch hervorragende mechanische Eigenschaften wie Elastizitätsmodul und Fehlerpunkt. Fibroblasten-Zellen waren in der Lage zu befestigen und somit beweisen gute Lebensfähigkeit der Zellen vermehren. Basierend auf den Eigenschaften, die oben diskutiert, kann man argumentieren, dass die stark vermischten Nanofasern aus natürlichen und synthetischen Polymeren eine ausgezeichnete Entwicklung von Verbundwerkstoffen darstellen, die für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet werden kann.

Einleitung

Elektrospinnen ist als vorherrschende Methode zur Erreichung Polymer-Nanofasern anerkannt. Die Fasern können auf einer Nanometerbereich erzeugt werden und die Fasereigenschaften sind kundengerecht ^ein. Diese Entwicklungen und die Eigenschaften der elektrogesponnenen Nanofasern wurden für ihre Anwendungen in der biomedizinischen Technik vor allem im Tissue Engineering besonders interessant. Die elektrogesponnenen Nanofasern besitzen Ähnlichkeiten mit der extrazellulären Matrix und somit Zelladhäsion, Migration und Proliferation ² zu fördern. Aufgrund dieser Ähnlichkeit mit der extrazellulären Matrix (ECM), elektrogesponnenen Fasern können als Materialien verwendet werden, in Wundverband, Arzneimittelabgabe zu unterstützen, und für technische Gewebe, wie Leber, Knochen, Herz und Muskel ^3.

Eine Vielzahl von verschiedenen Polymeren aus synthetischen und natürlichen Ursprungs verwendet wurden elektrogesponnenen Fasern für verschiedene biomedizinische Anwendungen Engineering ⁴ zu schaffen. In jüngster Zeit gewachsen ist inInteresse an der Entwicklung von Verbundnanofasern von ⁴ synthetischen und natürlichen Polymeren gemischt werden. In diesen Zusammensetzungen erben die Endprodukte der Regel die mechanische Festigkeit mit dem synthetischen Polymer verbunden, während auch biologische Signale und Eigenschaften aus dem natürlichen Polymer übernehmen.

In diesem Experiment PCL und Keratin vorgestellt, wie die synthetischen und natürlichen Polymeren für die Synthese eines Verbundnanofaser verwendet zu werden. Keratin ist ein natürliches Polymer, das im Haar, Wolle und Nägel gefunden wird. Es enthält viele Aminosäurereste; von besonderem Interesse ist Cystein ^4,5. Idealerweise würde ein natürlich vorkommendes Polymer nachwachsender, biokompatibel und biologisch abbaubar sein. Keratin besitzt alle drei dieser Eigenschaften gleichzeitig Zellproliferation und Befestigung an den Biomaterialien verbessert es in ⁶ eingearbeitet worden ist.

Polycaprolacton (PCL) ist ein resorbierbares, synthetisches Polymer, das in signifikant istTissue Engineering ^4. Dieses Polymer hat für seine strukturelle und mechanische Stabilität gelobt, aber bisher fehlt es an Zell Affinität und weist eine lange Abbaurate. Die hydrophobe Natur von PCL ist wahrscheinlich verantwortlich für die fehlende Zellaffinität ^7. Allerdings macht PCL für ihre Grenzen, indem mit anderen Polymeren sehr gut mischbar sind. Eine PCL / Keratin Verbund sollten die mechanischen Eigenschaften von PCL demonstrieren und die biologischen Eigenschaften von Keratin übernehmen, es zu einer idealen Wahl für verschiedene biomedizinische Anwendungen.

Protokoll

Alle Protokoll folgt den Richtlinien der North Carolina A & T State University Office of Research Compliance und Ethik.

1. Chemische Zubereitung für Keratin Extraction ⁴

1. Zur Herstellung von 1.000 ml von 2% w / v Peressigsäurelösung (PAS), unter einer Abzugshaube 20 ml Peressigsäure bis 980 ml VE-Wasser (DI).
2. Zur Herstellung von 1.000 ml 100 mM Tris-Base-Lösung (TBS), fügen 12,2 g Tris-Base auf 1000 ml VE-Wasser und rühren, bis vollständig gelöst.
3. Bereiten verdünnter Chlorwasserstoffsäure-Lösung (DHAS) in einem Abzug von 4 ml konzentrierter Salzsäure in 30 ml DI-Wasser zu gießen.
4. Beschaffen ca. 20 g des menschlichen Haarabschnitten, die nicht chemisch behandelt oder verändert wurden. Haare können beliebig lang sein.
5. Waschen Sie die Haare gründlich per Hand mit warmem Wasser und Seife. Verwenden deionisiertem (DI) Wasser für die Schlussspülung.
6. Legen Sie das Haar in zwei 600 ml-Becher und in einen 80 ° C oven für 1 Stunde.
7. Lassen Sie die Flüssigkeit aus dem Boden des Bechers und legen Sie in den Ofen zurück, bis das Haar vollständig trocken ist.
8. Dividieren trockene Haar gleichmäßig zwischen den 600-ml-Becher, legen 10 g Haar in jedem Becher. Nicht in den Haaren mehr als 500 ml zu füllen.
9. Gießen Sie 500 ml PAS in jedem Becher dafür, dass alle Haare zu bedecken. Decke das Becherglas mit Parafilm und Speicher für 12 Stunden.

2. Herstellung von Keratin Extraktlösung

1. Trennen Sie die Haare aus dem PAS ein 500 um Sieb verwenden. Sammeln Sie die Abfall PAS in einem separaten Behälter. Spülen Sie das Haar gründlich mit VE-Wasser auf, übrig gebliebene PAS entfernen.
2. Setzen Sie den gespült Haar in einem 500 ml Kolben. Gießen Sie 400 ml TBS in den Kolben, um sicherzustellen, dass das Haar bedeckt ist. Danach wird der Kolben in einem Schüttelbad auf 38 ° C, 65 min-1 Std.
3. Nach 1 Stunde entfernen Bad Schütteln und gießen Sie die Flüssigkeit, ca. 400 ml aus Keratin Extraktionslösung (KES), into einem 1000-ml-Becher.
4. Gießen Sie 400 ml DI-Wasser in den Kolben die Haare enthalten, um sicherzustellen, dass das Haar bedeckt ist und legen Sie wieder in den Schüttelbad für 1 Stunde. Entfernen Sie den Kolben aus dem Schüttelbad und gießen Sie die restlichen 400 ml der KES in den 1000-ml-Becher mit dem zuvor erfassten KES. Das Haar wird nicht mehr benötigt und kann in den nächsten Papierkorb Behälter aus dem Kolben und entsorgt werden entsorgt.

3. Konzentration von Keratin Extraktlösung

1. Füllen rotodistiller Bad in die oberste Zeile mit destilliertem Wasser und auf 90 ° C. Stellen Rotationsgeschwindigkeit auf 200 Umdrehungen pro Minute. Schalten Sie den Kühlmittelkühler-Pumpe und auf -10 ºC.
2. ein pH-Meter unter Verwendung der pH-Wert der KES Verwenden einer Pipette zu überwachen langsam 1 mM DHAS bis zum Erreichen eines pH 7,0 bis der KES hinzuzufügen. Rühre langsam, während die Lösung zugegeben wird.
3. Gießen Sie die neutralisiert KES in die 500 ml-Rundkolben bis etwa Viertel voll. Führen Sie den Brenner nach HerstellerProtokoll für 1,25 Std.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis alle der KES destilliert worden. Stellen Sie sicher, dass der Kolben fest verbunden ist.

4. Dialyse von Keratin Extraktlösung

1. Gießen KES Lösung gleichmäßig in 12 separaten 14 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1050 × g für 10 min.
2. Gießen Sie die zentrifugiert KES in ein sauberes Becherglas, um sicherzustellen, aus den gesammelten Schmutz zu abgießen. Wiederholen, bis alle der KES wurde zentrifugiert wurde.
3. Füllen Sie einen 2000-ml-Messzylinder mit DI-Wasser.
4. Schneiden Sie Dialyseschlauch Cellulosemembran bis 24 Zoll, und ein Ende der Schlauchklemme zu halten sie zu.
5. Tauchen Sie die Länge des Rohres in den Zylinder DI-Wasser, um es flexibler und leichter zu öffnen.
6. Öffnen der nicht-begrenzten Ende der Dialyseschlauch Cellulosemembran und gießt langsam 60 ml zentrifugiert KES-Lösung in den Schlauch. Verwenden Sie einen anderen Clip dieses Ende der Rohrleitung zu schließen.
7. Legen Sie die dialysis Rohr in der 2000 ml Zylinder DI-Wasser und lassen für 24 Stunden zu sitzen. Ändern Sie den DI-Wasser in den Zylinder alle 3 bis 4 Stunden.
8. Nach dem 24-Stunden-Zeitraum, leeren Sie den dialysiert KES Lösung in bedeckten Gläser, sicher zu sein, für 24 Stunden bei -20 ° C Platz an der Spitze und in der Tiefkühltruhe zu verlassen.

5. Die Gefriertrocknung von Extraktlösung Keratin

1. Stellen Sie die Gefriertrocknungsanlage bis -86 ºC.
2. Entfernen Sie die Gläser eingefroren KES aus der Tiefkühltruhe enthält, nehmen Sie die Kappen aus der Gläser, und legen Sie sie in Gefriertrockner Ampullen. Legen Sie die Dichtungen an den Ampullen und den Drehknopf einen Unterdruck von 0,133 mbar bis erstellen. Lyophilisieren die Proben für etwa 48 Stunden, bis die gesamte Feuchtigkeit verschwunden ist.

6. Herstellung von Elektrospinnen Solutions (10 Gew% Keratin Solution)

1. Entfernen Sie die Keratin-Pulver aus der Gefriertrocknungsanlage und gewogen.
2. In DI-Wasser auf die Keratin-Pulver mit einer 10% Gewicht / Gewicht zu schaffenKeratin Lösung.

7. Herstellung von 10% Gew PCL-Lösung

1. Erhalten PCL (ε-Caprolacton-Polymer, Mn 70-90 kDa) und Trifluorethanol (TFE). Vorbereiten eines 10 Gewichts-% PCL in TFE durch Rühren O / N und eine homogene Mischung erhalten.

8. Herstellung von Keratin / PCL-Lösung

1. Besorgen Sie sich die 10 Gew% PCL-Lösung vorher vorbereitet und 10 Gew% Keratin Lösung. In Keratin in den PCL-Lösung tropfenweise um 10 ml PCL / Keratin Lösungen von 90:10 zu schaffen, 80:20, 70:30 und 60:40 Verhältnisse.
2. Verwenden Sie einen Vortexer eine homogene Mischung aus PCL / Keratin-Lösung zu erhalten, bevor das Elektrospinnen.

9. Produktion von elektro PCL / Keratinfaser

1. Es werden ca. 8 ml des PCL / Keratinlösung in einem 10 ml Einwegspritze, ausgestattet mit einer 0,5-mm Durchmesser Kunststoffrohr. Legen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe, wo die Durchflussmenge eingestellt ist 2,5 ml / h.
2. Spannung an die Spitze der Nadel Nehmen mit dem Rohr verbunden (~ 23 cm von der Fasersammel Trommel positioniert und ~ 30 Grad von der Horizontalen). Tragen Sie eine 19 - auf das Rohr 22 kV Spannung und drehen Sie den Sammeltrommel bei etwa 200 Umdrehungen pro Minute.
   1. Wickeln Sie die Sammeltrommel mit Aluminiumfolie vor der Ausführung des Beispiels. Sicherzustellen, dass die Aluminiumfolie des Etikettenbands durch Anlegen an beiden Enden stabil ist.
      Hinweis: Die Fasern auf der Aluminiumfolie bilden wird (siehe Abbildung 2), speichern Sie die Faser bedeckt Folie bei RT.

10. Mechanische Analyse von PCL / Keratin Nanofasern

1. Schneiden Sie die Probe in 60 mm x 8 mm. Achten Sie darauf, die Dicke durch Verwendung von digitalen Mikrometer zu erfassen. Für jede Zusammensetzung bereit, verwenden fünf Proben.
2. Bringen Sie die 60 x 8 mm Probe in der Zugprüfmaschine. Verwenden Sie eine kundenspezifische Probenhalter auf die Probe befestigen. Sandwich die Probe zwischen Probenhaltern, die sich von einer Karteikarte hergestellt wird unter Verwendung von Doppel-seitiges Klebeband. Übernehmen Sie die 10 N Kraftmessdose mit einem Hubraum von 10 mm / min.
   Hinweis: Der Probenhalter wurde entwickelt, 62 mm sein, um 40 mm mit einem inneren Fenster von 50 mm um 38 mm.
3. Satzerweiterung und Belastungswerte durch Software nach Software-Protokoll.
4. Berechnen Belastung durch die Kraft der Fläche der getesteten Probe dividiert wird. Als nächstes berechnen Stamm durch die Änderung in der Länge um Ausgangslänge dividiert wird.
5. Generieren Sie die Spannungs-Dehnungs-Kurve, die durch Stress in der y-Achse aufgetragen Dehnungswert in der x-Achse für entspricht.
6. Berechnen der Elastizitätsmodul aus dem linearen Bereich, in dem Hang zu Elastizitätsmodul entspricht. Bestimmen Zugfestigkeit von der Spannungs-Dehnungs-Grundstück von 0,2% im Stamm versetzt zu nehmen und eine parallele Linie zu dem linearen Bereich Kurve zeichnen.
7. Führen Sie die statistische Analyse der mechanischen in dreifacher Ausfertigung erhalten Daten, die zuvor unter Verwendung von Einweg-Varianzanalyse mit Analysesoftware ^8. P-Werte <0,05 wirsind statistisch signifikant angesehen.

11. Oberflächenmorphologie und strukturelle Charakterisierung

1. Verwenden Rasterelektronenmikroskop (SEM) mit Parametern von 15 kV und einem Strom von 5 & mgr; A Beschleunigungsspannung die Morphologie der elektrogesponnenen Fasern zu beobachten.
   1. Vor mit SEM Abbilden, schnitt ein 2 cm ² Schnitt der Faser und verbinden Sie es mit einem SEM Bühne Kupferband. Legen Sie die Bühne in der Sputter-Beschichtungsvorrichtung und Mantel mit Gold bei 15 mA für 1 Minute und 30 Sekunden mit einer Goldschicht etwa 11 nm Dicke zu schaffen. Legen Sie die Probe in der Kammer des SEM. Beachten Sie die Faserproben.
2. Verwenden Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR), die chemische Bindung zwischen den PCL und Keratin zu charakterisieren. Legen Sie die 2 cm ² Abschnitt der elektroNanoFaserMembran in einem Magnethalter und spülen Sie das System mit trockener Luft vor dem Test. Erhalten Spektren für 200 Scans und Analyse der Spektren sta mitndard Software nach Software-Protokoll.
3. Führen Spektralanalyse Standardsoftware und nutzen dreifacher Ausführung jedes Verhältnis von Nanofaser nach dem Protokoll des Herstellers.

12. Untersuchung von Zellfaser-Interaktion

1. Schnittfasern in 16 mm ² Proben. Verwenden Sie einen biokompatiblen Silikonbasis Leim jede Probe auf Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm zu befestigen.
2. Kleben Sie ein Ende des Faserprobe auf der Rückseite des Deckglases, wickeln Sie die Probe um das Deckglas, kleben Sie dann das freie Ende der Probe auf der Rückseite des Deckglases als auch, so dass das obere Ende der Rutsch bedeckt nur mit der Faserprobe.
3. Legen Sie die Faserproben in einer 24-Well-Platte. Sterilisieren der Proben nach 1 Stunde in 80% Ethanol eingetaucht.
4. Spülen Sie das Ethanol aus den Proben DI Wasser. Dann Pipette 2 ml Basismedium auf den Proben, um sicherzustellen, die gesamte Probe zu bedecken. Entfernen Sie das Medium nach 5 min.
5. Verwenden Fibroblasten 3T3 Zellen, die die Faserproben zu säen. Die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit Antibiotika und 10% fötalem Rinderserum (FBS), so dass es etwa 62.000 Zellen / cm ² pro 1 ml DMEM.
6. Schau mal 1 ml der 3T3-Zellen enthaltende DMEM-Lösung in jedes Well Platte sicherzustellen, dass jeder Faserprobe mit etwa 62.000 Zellen / cm ² bedeckt ist. Inkubieren der Well-Platten für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% _{CO 2.} Hinweis: Verwenden Sie _{5% CO 2,} weil das Niveau in der Regel den pH-Wert des Zellmedien in physiologischen Bereich für Tage aufrechterhalten kann.

13. Abbau von Nanofaser-Matrix

1. Cut getrocknet PCL / Keratin Nanofasermembranen in quadratische ca. 30 mm x 30 mm.
2. Sterilisieren Sie die 900 mm ² Proben mit 80% Alkohol für 10 Minuten Inkubationszeit und gründlich mit VE-Wasser. Inkubieren der Proben in 15 ml PBS, pH 7,5, bei 37 ºC. Ersetzen Sie den bufalle 3 Tage fer.
3. Nehmen die Membranen aus der Lösung in bestimmten Abständen, 1 Woche und 7 Wochen, und Spülen mit DI-Wasser.
4. Legen Sie die Membranproben in Gefriertrockner Ampullen. Legen Sie die Dichtungen an den Ampullen und den Drehknopf ein Vakuum zu erzeugen. Lyophilisieren für 24 Stunden, vollständig trocken bis.
5. Bringen Sie die getrocknete Probe an einen SEM Bühne Kupferband. Legen Sie die Bühne in der Sputter-Beschichtungsvorrichtung und Mantel mit Gold bei 15 mA für 1 Minute und 30 Sekunden.
6. Legen Sie die Probe in der Kammer des SEM. Beachten Sie die Faserproben bei einer Beschleunigungsspannung von 1,5 kV und 5 & mgr; A Strom.

Ergebnisse

Fasermorphologie
REM-Aufnahmen der Fasern wurden für alle Faserzusammensetzungen erhalten. Siehe Abbildung 3. Fiber Bild bestätigt, dass die Fasern zufällig orientiert sind.

mechanische Prüfung
Mechanisch feste Fasern für verschiedene Tissue Engineering-Anwendungen benötigt. Diese Fasern sollten eine ausreichende Festigkeit und Flexibilität unter bestimm...

Diskussion

Extraktion von Keratin aus Menschenhaar wurde erfolgreich erreicht. Die Peressigsäure fungierte als Oxidationsmittel auf das menschliche Haar, so dass das Keratin von der Tris-Base extrahiert werden. Die Produktion von Keratin Pulver wurde in kleinem Maßstab aufgrund der Tatsache, dass es nur für Forschungszwecke durchgeführt wurde. Diese Vorgehensweise hat sich in der Industrie etabliert für die Großproduktion bereits. Der Zweck der Klein Keratin Extrahieren war Kontamination zu kontrollieren, Batch-Variabilität und Wi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Menschliches Haar			Gewonnen von einem örtlichen Friseursalon in Greensboro
Peressigsäure	Sigma Aldrich
PCL (e-Caprolacton-Polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluorethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99,9% kristallin
Salzsäure	Fischer Scientific	A144C-212 Los 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Zellulosemembran	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molekulares
Trennlichtmikroskop	Olympus BX51M	BX51M Japan
Rasterelektronenmikroskop	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Tischgerät Shimadzu Maschine	Nordamerika Analyse- und Messgeräte AGS-X Serie	AGS-X Serie	Kolumbien, MD
Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin Software			Northampton, MA
Röntgenbeugung (XRD)	Bruker AXS D8 Advance Röntgendiffraktometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  Zelle	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS Mikroplatten-Reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls Post-hoc-Test	SigmaPlot 12 Software