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Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

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DOI:

10.3791/53384

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23. Dezember 2015

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1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Erzeugung und Charakterisierung von Blutwachstums-Endothelzellen (BOECs) aus einem kleinen Volumen von adultem peripherem Blut. BOECs können als Surrogat für Endothelzellen von Patienten mit Gefäßerkrankungen und als Substrat für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen verwendet werden.

Zusammenfassung

Historisch gesehen hat die begrenzte Verfügbarkeit von primären Endothelzellen von Patienten mit Gefäßerkrankungen die Untersuchung der molekularen Mechanismen behindert, die der endothelialen Dysfunktion bei diesen Personen zugrunde liegen. Die jüngste Identifizierung von Endothelzellen (BOECs) aus dem Blutwachstum, die aus zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen im peripheren Blut von Erwachsenen erzeugt werden, kann diese Einschränkung jedoch umgehen, indem sie ein endothelähnliches, primäres Zellsurrogat für patientengewonnene Endothelzellen anbietet. Abgesehen von ihrem Wert für das Verständnis der Endothelbiologie und der Krankheitsmodellierung haben BOECs potenzielle Anwendungen für Endothelzelltransplantationstherapien. Sie sind auch ein geeignetes zelluläres Substrat für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) durch nukleäre Reprogrammierung und bieten eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Zelltypen. Wir beschreiben eine Methode zur zuverlässigen Erzeugung, Kultivierung und Charakterisierung von BOECs aus adultem peripherem Blut für den Einsatz in diesen und anderen Anwendungen. Dieser Ansatz ermöglicht (i) die Erzeugung patientenspezifischer Endothelzellen aus einem relativ kleinen Volumen adulten peripheren Blutes und (ii) produziert Zellen, die primären Endothelzellen in Morphologie, Zellsignalisierung und Genexpression sehr ähnlich sind.

Einleitung

Bis vor kurzem wurde die postnatale Generation von neuen Blutgefäßen vermutlich ausschließlich durch einen Prozess bekannt als Angiogenese, definiert als das Sprießen neuer Schiffe von den Endothelzellen der bereits bestehenden Gefäßen auftreten. 1 Dieses Verfahren steht im Gegensatz aus der Vaskulogenese oder die de novo Bildung von Blutgefäßen von endothelialen Vorläuferzellen, die gedacht wurde, um während der Embryogenese ausschließlich auftreten. 2 Allerdings haben neuere Studien identifiziert und isoliert zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) im peripheren Blut von Erwachsenen. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit, in der Kultur zu reifen Endothelzellen differenzieren und sind vermutlich in der postnatalen Vaskulogenese zu beteiligen. 3,4

Protokolle für die Isolierung und Expansion dieser EPCs beinhalten üblicherweise die Kultur von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC) in Medien, die endotheliale Wachstumsfaktoren, einschließlich vascular endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. 5-8 EPC Kulturen produzieren eine Vielzahl von stark unterschiedlichen Zelltypen. Anfängliche Kulturen (<7 Tage) sind durch eine Monozyten-Zelltyp, in der Literatur als "früh" EPCs bekannt dominiert. Trotz ihres Namens exprimieren diese Zellen des Monozyten-Marker CD14, negativ für die Vorläufermarker CD34 und exprimieren nur geringe Niveaus der klassischen endotheliale CD31 und VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR2). 5 Fortsetzung Kultur führt zu einer sekundären Population von Zellen, erst Auswuchs EPCs oder Blut Auswuchs Endothelzellen (BOECs), die als diskrete Kolonien von Endothel-ähnlichen Zellen erscheinen bekannt. Im Gegensatz zu den monozytären frühen EPCs, BOECs, die auch endotheliale Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs), Auswuchs Endothelzellen oder spät Auswuchs Endothelzellen aufgerufen haben, zeigen Sie die Kopfsteinpflastermorphologie, die typisch für endotheliale Zellmonoschichten ist und in Oberflächenmarker sehr ähnlich5 und Genexpression 9 bis Endothelzellen reifen.

Die Erzeugung von Endothel-ähnlichen Zellen aus peripherem Blut bietet mehrere Vorteile, insbesondere für die Untersuchung der Endothelzelldysfunktion mit vaskulären Erkrankungen, wie pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) 10 oder von Willebrand-Krankheit. 11 Vor der Verfügbarkeit von BOECs, Endothelzellen assoziiert Zellen konnte nur von verpflanzten Organen zum Zeitpunkt des Todes oder der Organtransplantation oder isolierte aus der Nabelschnurvene Geburts ableiten. Dies reduziert die Verfügbarkeit eine ernsthafte Beschränkung auf das Verständnis der Biologie von endothelialen Zellen von Patienten mit Herzkreislauferkrankungen, sowie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und entweder Blutzellen oder Wandzellen. Ferner das Isolieren und Kultivieren einer reinen Population von Endothelzellen aus diesen Quellen ist technisch anspruchsvoll, und die Zellen mit diesen Verfahren abgeleitet zeigen nur eine limited proliferative Kapazität. BOECs bieten daher einen wertvollen Ersatz für die Isolierung und Kultivierung von Patienten stammende primäre Endothelzellen.

Zusätzlich zu ihrer in-vitro-Anwendungen sind BOECs potentiell auch in autologe Zelltransplantationstherapien nützlich. Diese Anwendungen sind sowohl Endothelzelltransplantation zur Gefäßneubildung (siehe 12 und Referenzen darin) zu fördern, sowie die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). 13 BOEC stamm iPSCs können für Krankheit Modellierung verwendet werden und bieten ein enormes Potenzial als Ausgangs Material für die autologe Zelltherapien. BOECs umprogrammieren schneller und mit einem höheren Wirkungsgrad als Haut-Fibroblasten. Außerdem BOECs auch für die Erzeugung von iPS-Zellen, die frei von karyotypischen Anomalien, die ein wesentliches Merkmal jeder Technologie, die sich für translationale Anwendungen sein wird, ist es zu ermöglichen. Die Fähigkeit, iPSCs von einem Patienten eine Blutprobe zu erzeugenlso eliminiert die Notwendigkeit für ein Hautbiopsie und die Erzeugung von Hautfibroblasten, wodurch die Erzeugung von Zellen zur Erleichterung von Patienten mit Wundheilungsstörungen oder sehr jungen.

Die unten beschriebenen Protokoll durch genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Research Ethics Service Committee (East of England) durchgeführt wird, bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Erzeugung von BOECs mit mehr als 90% Wirkungsgrad aus einem relativ kleinen Volumen (60 ml) aus dem peripheren Blut. Diese Zellen sind stark proliferative und kann wiederholt agiert werden, was zur Erzeugung von Hunderten von Millionen von Zellen aus einer einzelnen Blutprobe.

Protokoll

Ein Schema des BOEC Erzeugungsprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Blutentnahme und Dichte-Zentrifugation

  1. Für jeden Spender 3 ml Natriumcitrat, um jeden von zwei 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie 60 ml Blut durch Venenpunktion und 30 ml in jedes Röhrchen. Kehren sanft 2-3 Mal zu mischen. Verwenden weniger als 40 ml Blut in das Protokoll, mit Citrat Volumina entsprechend eingestellt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass Blutproben werden innerhalb von 2 h Kollektion verarbeitet. Verzögerte Verarbeitung von Blut führt zu einer deutlichen Reduktion der Auswuchs Kolonie Ausbeute.
  2. Bereiten Sie neue konische Röhrchen, die Dichtegradientenzentrifugation Medium durch erste Umdrehen der Flasche mehrmals, um zu mischen. In einer sterilen Haube 15 ml Dichtegradientenzentrifugation Medium pro 50 ml konische Röhrchen (1 Röhrchen pro 10 ml Blut, 6 Röhrchen pro Spender).
  3. Verdünnte Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferten Saline (DPBS). Kippen der Röhrchen mit dem Dichtegradientenzentrifugation Medium zu einem Winkel von 20 ° mit der Arbeitsfläche. Mit einer Pipette Hilfe und eine 25 ml serologische Pipette langsam Schicht 21 ml verdünntes Blut auf dem Medium durch allmähliche Zugabe von Blut auf der Wand der geneigten Röhre.
    HINWEIS: Dadurch wird Mischung des Blutes mit dem Dichtegradienten Schicht zu minimieren und eine engere Buffy-Coat sowie eine verbesserte Ausbeute herzustellen.
  4. Zentrifuge Proben bei 400 × g für 35 min bei RT mit dem Gaspedal und der Bremse ausgeschaltet.
  5. Während dieser Zentrifugation Zeit beginnen die Kollagenbeschichtung in den Schritten 2.1 detailliert - 2.4. Achten Sie darauf, diese Schritte, bevor zu Schritt 3.1 abgeschlossen.

2. Kollagenbeschichtung der T-75-Kolben und Vorbereitung des Kulturmediums

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Zellkultur Kapuze.

  1. Bereiten Sie eine 50 ug / ml Kollagenlösung durch Verdünnen Lager TyPE I-Kollagen in 10 ml 0,02 M Essigsäure. Beispiel: für Kollagen Lager in einer Konzentration von 4,05 mg / ml, so 123,5 ul Kollagen zu 10 ml 0,02 M Essigsäure. Sterilfilter Kollagensuspension vor der Verwendung.
  2. Verwendung einer serologischen Pipette 7,5 ml Kollagenlösung mit einem T-75-Zellkulturflasche. Dieses Volumen gibt 5 ug Kollagen / cm 2 (oder 375 & mgr; g / Kolben). Mantel Kolben für 1 h bei RT.
  3. Bereiten Sie das Hinzu endothelialen Grundmedium mit den Wachstumsfaktor Ergänzungen durch den Hersteller zur Verfügung gestellt für BOEC Erzeugung verwendet endothelialen Wachstumsmedium. Fügen Sie alle Ergänzungen, aber nicht Serum hinzuzufügen. Vorzubereiten 15 ml Erzeugungsmedium BOEC, fügen 2,5 ml definiert fötalem Rinderserum (FBS) zu 12,5 ml Endothelwachstumsmedium den Wachstumsfaktor enthaltenden Präparate.
  4. Fahren Sie mit den Schritten in Abschnitt 3 skizzierten Nach 1 Std Beschichtungszeitraum absaugen Kollagenlösung und abwaschen restliche Essigsäure durch Pipettierenin 10 ml DPBS. Absaugen des DPBS und wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal. Wenn die im Schritt 3.3 erhaltene Zellsuspension ist nicht bereit für die Beschichtung zu dieser Zeit, fügen Sie 5 ml Generation mittel BOEC in den Kolben, um die Kollagenbeschichtung vor dem Austrocknen zu halten.

3. Erhebung und Oberflächen von PBMNCs

  1. Im Anschluss an die Dichtegradientenzentrifugation in Schritt 1.4 beschrieben, sorgfältig sammeln die Buffy-Coat-Schicht unter Verwendung eines sterilen Plastiktransferpipette. Sammeln der buffy coat sollte etwa 20 ml Zellsuspension und Plasma aus jedem Röhrchen zu ergeben. Vermeiden Sie die Übertragung der Dichtegradienten-Medium.
  2. Verdünnen Sie die mononukleäre Zellsuspension 1: 1 in DPBS und invertieren zu mischen. Zentrifuge bei RT für 20 min bei 300 xg mit Bremse und Gaspedal bei max.
  3. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen, die durch Zugabe von 1 ml Generation mittel BOEC zu jedem Pellet und Auf-und Abpipettieren mehrmals. Pool Zellsuspensionen eind nachfüllen Gesamtvolumen auf 10 ml mit dem restlichen Medium.
  4. Um eine Schätzung der Gesamtzellzahl, Probe 10 ul Zellsuspension zu erhalten und zu verdünnen 50x mit 490 ul der Türken Lösung, die roten Blutkörperchen zu lysieren wird. Gehören eine 10 ul Probe des verdünnten Zellsuspension unter Verwendung eines Hämozytometers.
    HINWEIS: 60 ml Blut sollte etwa 100-150 x 10 6 weißen Blutkörperchen für die Beschichtung zu erhalten.
  5. Platte gesamte Zellsuspension in einer einzigen, mit Kollagen beschichteten T-75-Kolben, top-up Mittelvolumen auf 15 ml / Kolben und die Kultur bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. Zellen zu diesem Zeitpunkt überzogen darstellen Gang 0.
    Anmerkung: Es ist möglich, die isolierten PBMNC vor BOEC Isolierung um die BOECs zu einem späteren Zeitpunkt oder um die PBMNC in ein anderes Labor, in dem die BOECs erzeugt werden transportieren abzuleiten einzufrieren. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Einfrieren PBMNCs könnte die Effizienz BOEC Isolierung reduzieren. See Abschnitt 8 unten Methode.

4. Langfristige Zellkultur

  1. Ändern Medium alle 2 Tage durch Zugabe von 15 ml frischem BOEC Erzeugungsmedium (5: 1-Mischung von endothelialen Zellwachstumsmedium und definierte FBS). Für Wochenenden können Medium Änderungen alle 3 Tage verzögert werden.
    HINWEIS: Outgrowth Kolonien sollte zwischen 7 und 14 Tagen der Kultur angezeigt.
  2. Überwachen die BOEC Kulturflasche an den Tagen 7-14 für das Auftreten der Folge Kolonien. Identifizieren Kolonien als kreisförmige Gruppen von Zellen, die einen klassischen endothelialen Kopfsteinpflastermorphologie.
  3. Nachdem eine Kolonie oder mehreren Kolonien werden in den Kolben identifiziert, mit mittleren Veränderungen weiter und lassen Sie Kolonien auf etwa 1000 bis 2000 Zellen pro Kolonie vor Passagieren wachsen. Bestimmen Sie die Zellzahl pro Volk durch eine schwierige visuelle Schätzung.
    ANMERKUNG: Als Richtlinie üblich, Durchgang Anfangs Auswuchs Kolonien eine Woche nach der Identifizierung des ersten Auswuchs Kolonie ist es.
  4. Passage Zellen durch Spülen Kolben zweimal mit 10 ml DPBS. 5 ml 1X Trypsin-EDTA und Inkubation in einem Inkubator bei 37ºC für 5 min. Nach 5 min, zu neutralisieren Trypsin mit 10 ml Medium (enthaltend FBS) und bringen Zellen in Suspension mit wiederholten Pipettieren.
  5. Zentrifuge Suspension bei 300 xg für 5 min, resuspendieren in 15 ml frischem BOEC Erzeugungsmedium und der Platte gesamte Zellsuspension in einen neuen T-75-Kolben (entspricht Passage 1, P1). Keine Kollagenbeschichtung erforderlich.
  6. Weiterhin Mediums ändert, wie oben beschrieben, bis die Zellen konfluent (ungefähr 3-5 x 10 6 Zellen pro Kolben). Sobald konfluent, Passage-Zellen, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
    HINWEIS: Von Durchgang 2 ab, Zellen nicht mehr benötigen Generation mittel BOEC und kann in endothelialen Zellwachstumsmedium und 10% Standard-hitzeinaktiviertem FBS kultiviert werden. Collagen Beschichtung kann als ein optionaler Schritt für die Zukunft genutzt werden, denn es gibt Hinweise darauf, dass die Anwesenheit von Kollagen kann BOEC prolifer verbessernation Raten.
  7. Für die weitere Passage, Platte nicht weniger als 750.000 Zellen pro T-75-Kolben so niedrig Zelldichten kann dazu führen, die BOECs zu stoppen vermehren.

5. Einfrieren und Auftauen BOEC Kulturen

  1. Trypsinize Zellen, wie in Abschnitt 4.3 und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min beschrieben. Saugt den Überstand und resuspendiere in 10 ml Medium. Dies erfordert nicht endothelialen Zellwachstumsmedium; DMEM mit 10% FBS-Standard genügt. Sammeln eine 10 ul-Probe der Zellsuspension, um eine manuelle Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers durchzuführen.
  2. Zentrifuge wieder und resuspendieren in 2x10 6 Zellen / ml in eiskaltem Kryokonservierung Medium (40% DMEM mit 50% FBS und 10% DMSO). 0,5 ml (10 6 Zellen) zu jedem Gefäß, place Fläschchen in einer eiskalten Isopropanol Kryokonservierung Gefäß entnommen und in einen -80 ° C im Gefriergerät für mindestens 2 h vor der Übertragung an flüssigem Stickstoff. Lassen Sie keine Zellen bei -80 ° C für mehr als 24 Stunden.
  3. Zum Auftauen Zellen, 10 ml vorgewärmten Medium zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Wenn Auftauen Passage 1-Zellen aufgetaut, in endothelialen Zellwachstumsmedium mit definiertem FBS für die ersten 2 Tage nach dem Auftauen 20% ergänzt wird. Dies führt zu einer stabileren Zellisolierung für die Zukunft.
  4. Zellen, die aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad unter leichtem Rühren zu entfernen, bis nur ein kleiner Eiskristalle in der Durchstechflasche. Geben Sie den Inhalt des Fläschchens tropfenweise zu der konischen Zentrifugenröhrchen und Spin bei 300 g nach unten für 5 Minuten.
  5. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren Zellpellet in 10 ml EGM-2MV + 10% FBS. In den T-75-Kolben und Top-up-Medium auf 15 ml.

6. Charakterisierung der BOECs durchflusszytometrisch

  1. Sobald die in Abschnitt 4 beschrieben BOEC Kolonien erlaubt worden, zu erweitern, trypsinize Zellen, wie in Abschnitt 4.4 und resuspendieren in einer Konzentration von 10 6 Zellen pro ml in Färbepuffer beschrieben (DPBS with 2% FBS und 2 mM EDTA).
  2. Kombinieren Sie 10 5 Zellen mit einem Fluorochrom konjugierte Antikörper gegen CD45, CD14, CD34, CD31 (Nutzung aller bei 1:20 Verdünnung) oder VEGFR2 (verdünnen 1:10) gerichtet (siehe Tabelle 1 für weitere Informationen). Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  3. Zellen mit 1 ml Färbung Puffer und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min waschen. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren in 400 & mgr; l Färbepuffer für die Analyse. Halten Zellen bei 4 ° C und vor Licht vor der Analyse geschützt.
  4. Zuführen zytometrische Analyse auf einem Durchflusszytometer ausgestattet, um die Fluoreszenz-konjugierte Antikörper in dem Assay verwendet detektieren.
  5. Verwenden einen ungefärbten BOEC Probe, um die Zellpopulation am Zytometer durch Einstellen Vorwärts- und Seitenstreuspannungen sowie die Spannungen für die FITC und APC-Kanäle zu identifizieren.
  6. Bestimmen Sie Gating Schwellen mit Isotyps gefärbten Zellen für jedes Fluorochrom. Beurteilen Positivität für jeden Zelloberflächenmarker auf der Grundlage der Presence einer Spitzenverschiebung der Fluoreszenz-Intensität gegen die Isotyp-Kontrolle für die Fluorochrom analysiert.

7. Charakterisierung BOECs durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

  1. Platte BOECs in einer 24-Well-Flachboden-Gewebekulturplatte ohne Deckgläser in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen in 500 ul endothelialen Zellwachstumsmedium + 10% hitzeinaktiviertem FBS pro Vertiefung und lassen Sie sich an und wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen umfasst mindestens 70-80% der Oberfläche von jeder Vertiefung (Schätzung Konfluenz durch visuelle Untersuchung unter einem Lichtmikroskop).
  2. Wash-Zellen in jeder Vertiefung für 5 Minuten mit 1 ml DPBS.
  3. Fixieren Zellen O / N bei 4 ° C mit 500 ul 4% Paraformaldehydlösung in DPBS.
  4. Wash-Zellen für 3 x 5 min mit 1 ml DPBS pro Vertiefung. Hinzufügen und entfernen Sie die DPBS mit einer Pipette und eine Wasserstrahlpumpe verbunden.
  5. Permeabilisieren Zellen für 3 x 10 min mit 0,2% Polysorbat 20 in DPBS.
  6. Inkubieren Zellen für 1 h bei RT in Blocking-Puffer, enthaltend 10% FBS in DPBS.
  7. Fleckzellen bei 4 ° CO / N in 300 ul Antikörperverdünnungspuffer (0,1% Rinderserumalbumin in DPBS) mit primären Antikörpern gegen CD34 (10 ug / ml), CD144 gerichtet ist (1: 300) oder vWF (1: 250) . Siehe Tabelle 1 für weitere Informationen.
  8. Abwaschen ungebundenen primären Antikörpern für 5 x 10 min mit DPBS.
  9. Inkubieren Zellen für 1 h bei RT mit dem entsprechenden fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper, wie in Tabelle 1 (alle bei einer 1: 200) beschrieben.
  10. Abwaschen ungebundenen Sekundärantikörper für 5 x 10 min mit DPBS.
  11. Inkubieren Zellen mit 1 & mgr; g / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in DPBS für 10 min bei RT.
  12. Wasche die Zellen mit DPBS weitere 3 x 5 min.
  13. Bildzellen bei 100-facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop mit einer externen Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung ausgestattet, und die Aufnahmen mit einem befestigened Digitalkamera zur nachfolgenden Analyse offline.

8. Einfrieren und Auftauen PBMNCs

  1. Am Ende der Stufe 3.2, wird nach der Zentrifugation absaugen Medium und das Zellpellet bei wiederholter Auf- und Abpipettieren mit einer P1000 Pipettenspitze manuell unterbrechen. 1 ml Gefriermedium, 90% Serum und 10% DMSO, achten Sie darauf, vorsichtig mischen, um eine Zellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Kryoröhrchen und Einfrieren und Auftauen, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

Ergebnisse

Isolierung von Leukozytenmanschette mononuklearen Zellen von 60 ml Blut in der Regel ergibt 100-150x10 6 Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen. Wenn sie in einer einzigen T-75-Kolben ausplattiert, die große Anzahl von Zellen in der nicht-lysierten Zellsuspension macht es schwierig, einzelne anhaftende Zellen zu lösen unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie. Wiederholte Medium Veränderungen resultieren im Abstand von nicht-adhärenten Zellen und ermöglichen die Visualisierung der adhärenten Population von monozytären "frühen" EPCs. Am Tag 7 werden die T-75 etwa 7x10 6 dieser länglichen adhärenten Zellen. Von Tag 7 bis 14 sollten Kolonien BOECs innerhalb des Kolbens (2A) angezeigt. Colonies ersten erscheinen als 3 bis 5 benachbarten Zellen. Auswuchs Koloniezahl kann von 1 bis 10 Kolonien pro 60 ml Blut variieren. Allgemeiner jüngeren Spendern (dh 20-25 Jahre alt) dazu neigen, eine größere Anzahl von Auswuchs Kolonien, die auch weiter oben in Kultur erscheinen zu erzeugen.BOECs vermehren sich von diesem zentralen Gruppe von Zellen, um kreisförmige Kolonien, bestehend aus mehreren hundert Zellen zu bilden. Zellen innerhalb dieser Kolonien weisen eine klassische endothelialen Kopfsteinpflastermorphologie.

Es ist bevorzugt, um den Durchgang Anfangs Kolonien, wenn sie etwa 1000 Zellen pro Kolonie enthalten. Auswuchs Kolonien zu erreichen in der Regel diese Größe, 7 Tage nachdem ihr ursprüngliches Aussehen in der Kultur. Sobald die ursprünglichen Kolonien werden in einen neuen T-75-Kolben agiert, sollten sie sich vermehren, um eine konfluente Monoschicht (3-5x10 & sup6; Zellen pro Flasche) innerhalb von 5 Tagen oder weniger (2B) zu bilden. In einem kleinen Prozentsatz der Isolierungen (<10%), Auswuchs Kolonien ausbleiben, oder nicht ausreichend nach dieser ersten Passage Schritt vermehren. BOECs, die niedrige Proliferation nach der ersten Passage aufweisen gehen selten auf eine stabile BOEC Isolierungen werden und oft anhalten wuchernden innerhalb von zwei bis drei Passagen. Die Monozyten-EPCs früh innerhalb der BOEC Kulturen enthielten nicht-proliferative und werden typischerweise aus den Kulturen in 1-2 Durchgängen gelöscht wird. Clearance dieser frühen Zellen aufgrund Zelltod, Versagen der frühen Zellen erneut haften nach Passagierung und Verdünnung der nicht-proliferative frühen EPCs mit wiederholte Passagen.

Passage 1 Zellen können entweder weiter in Kultur agiert oder unten für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Nachdem eine stabile Isolierung erzeugt wird, können die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 1 konfluente Kolben auf 3-5 neue T-75-Kolben bis zum Durchgang 8 oder 9, bevor er Ruheagiert werden. Auch hier ist die Zelldichte im gesamten Kultur kritisch. Nach unserer Erfahrung sollte nicht weniger als 750.000 Zellen in einer T-75-Kolben plattiert werden, da niedrigere Zelldichten können Wachstumsstillstand verursachen. Trotz der hohen proliferative Potenzial von BOECs sollten die Zellen auch nicht gestattet, overconfluent werden (dh.,> 5x10 6 Zellen pro Kolben), da dies dazu führen convers Ion BOECs zu einem nicht-proliferativen Phänotyp.

Wir schlagen vor, dass jede Zelle markiert als BOEC sollten geeignete Zelloberfläche und die intrazelluläre Färbung für endotheliale Marker angezeigt. Charakterisierung BOECs durch Durchflusszytometrie (Figur 3) oder Fluoreszenzmikroskopie (Figur 4) erzielt werden, nach Anfärbung für typische Endothelzellmarkern. BOECs sind positiv für die endotheliale Oberflächenmarker CD31 und VEGFR2 und negativ für die Monozyten-Marker CD14 und dem pan-Leukozytenmarker CD45. BOECs posess auch Weibel-Palade-Körperchen und damit zum Ausdruck bringen Willebrand-Faktor (vWF) als diskrete, punktförmige zytoplasmatische Färbung. Im Gegensatz zu anderen reifen Endothelzellen-Typen, wie Lungenarterie oder Aorta-Endothelzellen, BOECs auch Ausdruck der Stammvater und Aktivierungsmarker CD34 auf ihrer Oberfläche.

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Abbildung 1 Schematische Darstellung der BOEC Erzeugungsprotokoll. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus Venenblut durch Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und kultiviert auf Kollagen-beschichteten Platten in endothelialen Wachstumsmedium definiert FBS. BOEC Kolonien innerhalb von 7-14 Tagen der Kultur angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Hellfeldbilder des Vertreters BOEC Kulturen. (A) Outgrowth Kolonien erscheinen in Kulturen zwischen den Tagen 7 und 14 Kolonien als Sammlungen von Endothel-ähnlichen Zellen, die in einer gepflasterten Monolage angeordnet sind und sich vermehren radial von einer zentralen Stelle vorhanden ist. Rund um das Auswachsen Kolonien sind die adhärenten Monocytic Zellen, die in frühen Kulturen machen die überwiegende Mehrheit der Zellen. Diese Zellen, die zuvor als "frühe" endothelialen Vorläuferzellen, haben eine spindelförmige Morphologie und exprimieren das Monozyten-Marker CD14. (B) Im Anschluss an Passagieren, die hoch proliferative BOECs über Kulturen zu nehmen, da die nicht-proliferative Monocytenzellen entweder absterben oder nicht wieder anzubringen, nachdem Passagieren. Maßstabsleiste 250 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Charakterisierung BOECs mittels Durchflusszytometrie. BOECs wurden trypsinisiert und mit Fluoreszenz-konjugierten Isotypkontrolle Antikörper (grau gefüllte Spitze) oder Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker (rote Linie) gerichtete gefärbt. Oberflächenmarker für cytometric Charakterisierungumfassen die hämatopoetischen Marker CD45 und CD14, die endotheliale Marker CD31 und VEGFR2 und die progentior und Endothelzellen Aktivierungsmarker CD34. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung von BOECs für Endothelzellmarkern. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von BOECs immunhistochemisch mit Antikörpern gegen endothelialen Zelloberflächenmarker CD144 gerichtet (VE-Cadherin, oben rechts) und das Blut Glykoprotein von-Willebrand-Faktor (vWF, unten rechts) . Entsprechende Tafeln mit DAPI-Färbung Kern werden links angezeigt. Maßstabsleiste 50 um. für CD144. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Diskussion

Wir stellen ein detailliertes Protokoll vor, das die robuste und effiziente Gewinnung von BOECs aus adulten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) ermöglicht. Unser Protokoll enthält zwei wichtige Verfeinerungen, die einen Fortschritt gegenüber früheren Methoden der BOEC-Isolierung darstellen. 14-16 Dazu gehören das Fehlen von Heparin im anfänglichen PBMNC-Kulturmedium und die Verwendung von definiertem, embryonalem Stammzell-qualifiziertem Serum. Letzterer Verfeinerung kommt dabei eine besondere Bedeutung zu. Embryonale Stammzellen (ESC)-qualifiziertes Serum ist eine konsistentere Serumqualität, und obwohl noch nicht bekannt ist, welche Komponente(n) im Serum angereichert sind, die für die BOEC-Isolierung von Vorteil sind, ist der Einfluss dieses definierten Serums auf die Effizienz der BOEC-Erzeugung in unseren Händen klar. Darüber hinaus ist es uns auch gelungen, BOECs mit humanem Serum zu isolieren und so die Erzeugung von BOECs für die klinische Translation zu ermöglichen. In unseren Händen führt dieses verfeinerte Protokoll zur erfolgreichen Isolierung stabiler BOEC-Kulturen von mehr als 90% der Spender, was es zu einer der zuverlässigsten BOEC-Erzeugungsmethoden macht, über die bisher berichtet wurde. Obwohl die Verwendung bestimmter Seren für die BOEC-Generierung von entscheidender Bedeutung ist, stellt sie auch eine primäre Einschränkung des aktuellen Protokolls dar. Zukünftige Verbesserungen der Technik könnten die Erzeugung dieser Zellen unter serumfreien, definierten Kulturbedingungen umfassen.

Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die schnellstmögliche Verarbeitung von Blutproben nach der Entnahme, die vollständige Ernte der Buffy-Coat-Zellen nach der Dichtegradientenzentrifugation und die rechtzeitige Passage der ersten Kolonien von P0 nach P1. Dieser Passageschritt ist entscheidend für die Etablierung einer stabilen Isolierung. Wie andere Endothelzellen scheinen BOECs sehr empfindlich auf die Plattierungsdichte zu reagieren. Wenn die Plattierungsdichte nach der Passage zu gering ist, vermehren sich die BOECs nicht. Umgekehrt, wenn man die Kolonien vor dem Passieren überkonfluent werden lässt, hören die Zellen auch auf, sich zu vermehren und haben die Tendenz, sich in einen länglichen, mesenchymalen Zellphänotyp umzuwandeln. Wenn zwischen Tag 7 und 14 nur wenige Kolonien auftreten oder wenn die Kolonien klein sind, kann die Fehlerbehebung die Erhöhung der Zelldichte umfassen, indem P0-Kolonien in einen T-25-Kolben statt in einen T-75-Kolben gegeben werden.

Sobald die Technik beherrscht ist, können die resultierenden BOECs in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, darunter In-vitro-Studien zur Endothelzellbiologie, Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening sowie In-vivo-Zelltransplantationstherapien. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Zelltherapieverfahrens ist die Verwendung von Zellen, die frei von pathogenen Mutationen sind. Wir haben bereits gezeigt, dass BOECs, die mit unserem Protokoll isoliert wurden, Genome besitzen, die frei von Variationen der Kopienzahl sind und somit repräsentativ für das Individuum sind, von dem sie gesammelt wurden. Darüber hinaus haben wir auch gezeigt, dass die Mehrheit der von BOEC abgeleiteten iPSC-Linien frei von Kopienzahlvariationen ist. 13 Dies steht im Gegensatz zu früheren Berichten über Variation der Kopienzahl bei Fibroblasten-abgeleiteten iPSCs. Bis heute sind diese Zellen die einzigen iPSCs, für die dieser Grad an genomischer Treue berichtet wurde. Diese Eigenschaft ist wichtig für das Gebiet der iPS-Biologie und die Verwendung von iPS-Zellen in der Krankheitsmodellierung, beim Wirkstoffscreening und in zukünftigen Zelltransplantationstherapien.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, die von der British Heart Foundation (BHF), dem Dinosaur Trust, der McAlpine Foundation, der Fondation Leducq, Fight for Sight, dem Cambridge Biomedical Research Centre, dem National Institute of Health Research einschließlich (i) dem BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) dem BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) dem Addenbrooke's Hospital, dem Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust und (iv) dem Papworth Hospital finanziert wurden NHS Foundation Trust und unterstützte den Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO wird durch ein BHF Intermediate Fellowship finanziert. FNK wird durch ein BHF-PhD-Stipendium finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Zur Blutentnahme
60 ml Spritze mit Luer-Lok-SpitzeBD309653
19G Surflo Winged Infusion SetTerumoSV-19BL
50 ml konisches ZentrifugenröhrchenStarLabE14502 pro Spender
NatriumcitratMartindale Pharmaceuticals270541
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Für die Isolierung von buffy Coats
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (ohne Ca2+ und Mg2+)Sigma-AldrichD8537
Steril verpackte Kunststoff-TransferpipettenAppleton WoodsKC231
Turk' s LösungMillipore1.093E+09<
strong>NameCompanyKatalognummerKommentare<
strong>Für Zellkulturen, Passing und Einfrieren von Zellen
Kollagen Typ 1 (aus Rattenschwanz gewonnen)BD Biosciences35-4236
Dulbecco' s PBS (ohne Ca2+ und Mg2+)Sigma-AldrichD8537
0,02M Essigsäure Sigma-AldrichA6283hergestellt in Wasser in Reagenzqualität
Endothelial Growth Medium-2MV
(enthält Bullet Kit, aber kein Serum)		LonzaCC-3202Hinweis: Es ist wichtig, dass das Medium kein Heparin enthält.  
Nicht verwenden EGM-2.
Fötales Rinderserum (USA), definierterHyklonSH30070
10x Trypsin EDTAGibcoT4174Gebrauch auf 1x in PBS verdünnen
Hitzeinaktiviertes FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty GefrierbehälterSigma-AldrichC1562
NameCompanyKatalognummer<>Comments
Für die durchflusszytometrische Charakterisierung
FITC-konjugierte Maus Anti-Human-CD14BD Biosciences555397Maus IgG1k, Klon: WM59
Verdünnung: 1:20
FITC-konjugierte Maus Anti-Human-CD31BD Biosciences555445Maus IgG1k, Klon: WM59
Verdünnung: 1:20
APC-konjugierte Maus Anti-Human-CD34BD Biosciences555824Maus IgG1k, Klon: 581/CD34
Verdünnung: 1:20
FITC-konjugiertes Maus-Anti-Human-CD45BD Biosciences560976Maus IgG1k, Klon: HI30
Verdünnung: 1:20
  APC-konjugierte Maus Anti-Human-VEGFR2R& D SystemsFAB357AMaus IgG1, Klon: 89106
Verdünnung: 1:10
FITC-konjugierte Maus IgG1k IsotypkontrolleBD Biosciences555748Klon: MOPC-21
Verdünnung: 1:20
APC-konjugierte Maus IgG1k IsotypkontrolleBD Biosciences555751Klon: MOPC-21
Verdünnung: 1:20
APC-konjugierte Maus IgG1k IsotypkontrolleR& D SystemsIC002A
Verdünnung: 1:10		Klon: 11711
EDTA, 0,5M LösungSigma-AldrichE7889
NameCompany<>KatalognummerKommentare
Für die Immunfluoreszenzmikroskopie 
Corning Costar 24-Well-GewebekulturplatteSigma-AldrichCLS3527
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
Polysorbat 20Sigma-AldrichP2287
Monoklonaler Maus-Anti-Human-CD34-AntikörperR& D SystemsMAB72271Clone 756510, IgG1, Einsatz bei 10 μ g/ml
Polyklonales Ziegen-Anti-Human-VE-Cadherin (CD144)R& D SystemsAF938Antigen-affinitätsgereinigtes IgG, Anwendung bei 1:300
Monoklonales Kaninchen Anti-Human-Von-Willebrand-Faktor (vWF)Abcamab154193Klon EPSISR15, Verwendung bei 1:250
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 KonjugatLife TechnologiesA-21202Polyklonal, 2 mg/ml, Verwendung bei 1:200
Esel Anti-Ziegen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 KonjugatLife TechnologiesA-11055Polyklonal, 2 mg/ml, 1:200
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568 KonjugatLife TechnologiesA-10042Polyklonal,   2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid)Sigma-AldrichD9542Anwendung bei 1 μ g/ml
Vor strong

Referenzen

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