Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Paula Nunes; Daniele Guido; Nicolas Demaurex

doi:10.3791/53402

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Methodenartikel

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

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DOI:

10.3791/53402

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7. Dezember 2015

Paula Nunes¹ , Daniele Guido¹ , Nicolas Demaurex¹

¹Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der phagosomale pH-Wert beeinflusst die Phagosomenreifung, die Produktion von Oxidationsmitteln, die phagosomale Abtötung sowie die Antigenpräsentation. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ratiometrische Methode zur Messung von Zeitverlaufs- und Endpunkt-pH-Veränderungen in einzelnen Phagosomen in lebenden Fresszellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Zusammenfassung

Phagozytose ist ein grundlegender Prozess, durch den angeborenen Immunzellen zu verschlingen Bakterien, apoptotischen Zellen oder andere Fremdkörper, um zu töten oder zu neutralisieren, die verschluckt Material oder um sie als Antigene zu präsentieren und zu initiieren adaptiven Immunantwort. Der pH der Phagosomen ist ein kritischer Parameter zur Regelung Spaltung oder Fusion mit Endomembranen und Aktivierung der proteolytischen Enzyme, Ereignisse, die phagozytischen Vakuolen in eine abbau Organell ausreifen. Zusätzlich wird die Translokation von H ⁺ zur Herstellung hoher Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die für eine effiziente Töten und Signalisierung zu anderen Wirtsgeweben erforderlich. Viele intrazelluläre Pathogene zu untergraben phagocytic Tötung durch Begrenzung phagosomalen Versauerung, der die Bedeutung der pH-Wert im Phagosom Biologie. Hier beschreiben wir eine ratiometrische Verfahren zur Messung phagosomalen pH in Neutrophilen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem Zymosan als phagozytischen targets, und Live-Cell-Imaging. Der Test basiert auf der Fluoreszenzeigenschaften von FITC, die durch saure pH abgeschreckt wird, wenn bei 490 nm angeregt wird, aber nicht, wenn sie bei 440 nm angeregt wird, so dass die Quantifizierung von einer pH-abhängigen Verhältnis statt der absoluten Fluoreszenz eines einzelnen Farbstoffs. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung einer in situ-Farbstoff Kalibrierung und Umwandlung des Verhältnisses realen pH-Werten ist ebenfalls vorgesehen. Single-Farbstoff ratiometrische Verfahren werden im Allgemeinen als überlegen einzigen Wellenlänge oder Dual-Farbstoff pseudo-ratiometrische Protokolle, da sie weniger empfindlich auf Störungen, wie beispielsweise Bleich sind, konzentrieren sich ändert, Laser-Variationen und unebene Kennzeichnung, die das Messsignal verfälschen. Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden, um in anderen pH phagozytischen Zelltypen zu messen und Zymosan durch jede andere aminhaltige Teilchen ersetzt werden, von inerten Kügelchen zu lebenden Mikroorganismen. Schließlich kann dieses Verfahren angepaßt werden, um die Verwendung von anderen fluoreszierenden Sonden empfindlich auf unterschiedliche pH-Bereiche oder andere phagosom machenal-Aktivitäten, so dass es eine allgemeine Protokoll für die funktionelle Bildgebung des Phagosomen.

Einleitung

Phagozytose, der Prozess, durch den angeborene Immunzellen große Partikel verschlingen, hat sich aus dem Fressmechanismus einzelliger Organismen entwickelt und beinhaltet die Bindung an ein Ziel, das Umhüllen mit einer Membran und das Einklemmen der Membran, um eine Vakuole innerhalb des Zytosols zu bilden, die als Phagosom bezeichnet wird. Während die phagosomale Membran von der Plasmamembran abgeleitet ist, verwandeln aktive Protein- und Lipidsortierung sowie die Fusion mit Endomembranen während der Phagosomenbildung das Phagosom in ein eigenständiges Organell innerhalb der Zelle mit abbauenden Eigenschaften, die die Abtötung, Neutralisierung und den Abbau des aufge....